CC BY
72
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 616.89-092:547.415.5
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ ПОЛИАМИНОВ, ДЕКАРБОКСИЛИРОВАННОГО ОРНИТИНА И S-АДЕНОЗИЛМЕТИОНИНА НА СКОРОСТЬ СИНТЕЗА ПОЛИАМИНОВ В ТЕСТ-СИСТЕМАХ ИЗ ТКАНЕЙ С ПОВЫШЕННОЙ ПРОЛИФЕРАЦИЕЙ
С.П. Сяткин, Т.Т. Березов, Т.В. Федорончук,
Н.Я. Гридина, Е.А. Неборак, Н.А. Шевкун,
Н.А. Сокуева, Е.В. Устинова, Р.И. Сокуев
Российский университет дружбы народов, ул. Миклухо-Маклая, 8; Москва, Россия, 117198 [email protected] (495) 420-23-69
Исследовали влияние алифатических амино- и оксипроизводных полиаминов на скорость образования путресцина, спермидина и спермина в бесклеточных тест-системах из ткани регенерирующей печени и гепатомы крысы. Использование известных ингибиторов синтеза полиаминов подтвердило, что данные бесклеточные модельные системы функционируют адекватно поставленным задачам. Эффективность антипролиферативного действия химических соединений оценивали по степени торможения синтеза путресцина и полиаминов, а также дополнительно рассчитывали коэффициент молярного отношения спермидина к спермину и величину суммарного пула полиаминов, после одного часа инкубации. Из числа исследуемых соединений этим требованиям в большей степени удовлетворяют 1-аминоокси-3-аминопропан (I), 8-(5-дезоксиаденозил)-8-метил^-тиоэтилгидроксиламин (IV) и этилендиамин (V).
Ключевые слова: полиамины, путресцин, спермидин, спермин, окислительное дезаминирование, дифторметилорнитин, орнитиндекарбоксилаза.
В экспериментах с экстрактами из L-1210 клеток [1] показано ингибирующее
действие а-дифторметилорнитина (ДФМО) на активность орнитиндекарбокси-
1 8
лазы (ОДК) и отсутствие такого эффекта у N ,N -бис(этил)спермидина. Однако оба эти вещества одинаково ингибируют рост L-клеток и тормозят биосинтез белка, РНК и ДНК. Это позволяет рассматривать использование аналогов этих веществ в качестве регуляторов активности ОДК как альтернативный путь в поисках антипролиферативных средств, действующих на биосинтез ПА без прямого ингибирования ОДК. Это определило специфику данного этапа работы.
Целью работы стало исследование влияния химических аналогов полиаминов, декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина на скорость образования путресцина и полиаминов в тест-системах из тканей с усиленной клеточной пролиферацией.
Материалы и методы. О-замещенные гидроксиламины (I—IV, табл. 1), аналоги продуктов ферментативного декарбоксилирования орнитина и S-аденозил-метионина, были синтезированы в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Химические соединения (V—X, табл. 1), химические аналоги ПА, были синтезированы в Институте физической химии РАН.
Таблица 1
Алифатические амино- и оксипроизводные полиаминов
Химические аналоги декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина
название индекс структура
а-дифторметилорнитин 1 -аминоокси-3-аминопропан 1,2-диаминооксиэтан 8-(5'-дезоксиаденозил)-8-тиоэтилгидроксиламин 8-(5'-дезоксиаденозил)-8-метил-Р- тиоэтилгидроксиламин ДФМО I II III IV chf2 I H2NCH2CH2CH2CHCOOH I nh2 2HCINH2OCH2CH2CH2NH2 2HCINH2OCH2CH2ONH2 H28O4NH2OCH2CH28Ade 2H28O4NH2OCH2CH28Ade I CH3
Химические аналоги полиаминов
название индекс структура
Этилендиамин 1,3-диаминопропан 1,5-диамино-3-азапентан 1.9-диамино-3,6-диазанонан 1.9-диамино-3,7-диазанонан Метилглиоксаль-бис(гуанилгидразон) V VI VII VIII IX МГБГ H2NCH2CH2NH2 h2nch2ch2ch2nh2 H2N(CH2)2NH(CH2)NH2 H2N(CH2)2NH(CH2)NH(CH2)3NH2 H2N(CH2)2NH(CH2)3NH(CH2)2NH2 NH II h3c-c=n-nh-c-nh2 I hc=n-nh-c-nh2 II NH
Для определения скорости синтеза путресцина и полиаминов в биологических пробах использовали модифицированный нами метод [2].
В экспериментах использовали белых беспородных крыс-самцов массой 100—130 г, содержащихся на стандартном рационе вивария РУДН со свободным доступом к воде.
Парциальную гепатэктомию (около 70% ткани) выполняли по методике Higgins, Anderson [3] под эфирной анестезией. Для получения регенерирующей ткани печени животных забивали путем декапитации через 12 часов после операции и извлекали малые дольки печени.
Штамм гепатомы Г-27 получили из Онкологического научного центра РАМН и пассировали на беспородных белых крысах, как было описано ранее Швем-бергер [4].
Бесклеточные тест-системы представляли собой цитозольную фракцию (20 000 g х 20 мин при 4 °С) 33%-го гомогената регенерирующей печени или ткани гепатомы с добавлением необходимых компонентов для проявления актив-
ности ОДК. Количество белка в пробах исследуемых тканей определяли по методу Lowry (1951) в модификации С.П. Сяткина (1981) [5].
Достоверность различия средних значений по экспериментальным группам полученных результатов проводили с помощью i-критерия Стьюдента (Афифи, Эйзен, 1982) [6].
Результаты. Сравнивали эффективность и характер действия указанных в таблице химических соединений на процесс образования исследуемых аминов. Первую группу составили оксиаминоаналоги декарбоксилированного орнитина и S-аденозилметионина. Вторую группу сформировали из алифатических гомологов путресцина (Пут), спермидина (Сд) и спермина (См). Результаты этих исследований представлены в табл. 2 и 3.
Таблица 2
Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксилирования орнитина и S-аденозилметионина в бесклеточной тест-системе из регенерирующей печени крыс
Вещество ОДК Эффект, % Синтез спермидина Эффект, % Синтез спермина Эффект, %
— 2,7 ± 0,1 0 1,29 ± 0,04 0 0,48 ± 0,01 0
ДФМО 1,7 ± 0,1* 37 0,87 ± 0,02* 33 0,21 ± 0,01* 56
МГБГ 2,7 ± 0,1 0 0,9 ± 0,02* 26 0,31 ± 0,01* 35
I 1,1 ± 0,1* 59 0,57 ± 0,01* 56 0,1 ± 0,01* 79
II 2,2 ± 0,1* 19 0,88 ± 0,06* 32 0,25 ± 0,08* 48
III 3,7 ± 0,2* +37а 0,92 ± 0,03* 29 0,24 ± 0,07* 50
IV 1,7 ± 0,1* 37 0,63 ± 0,02* 51 0,26 ± 0,07* 46
V 2,3 ± 0,1* 15 0,98 ± 0,02* 24 0,32 ± 0,09 33
VI 2,8 ± 0,1 +4 1,0 ± 0,02* 22 0,19 ± 0,04* 60
VII 2,5 ± 0,1 7 0,74 ± 0,02* 43 0,2 ± 0,05* 58
VIII 2,4 ± 0,1 11 0,78 ± 0,04* 40 0,18 ± 0,04* 62
IX 2,5 ± 0,1 7 0,63 ± 0,02* 50 0,28 ± 0,06* 42
X 1,7 ± 0,1* 37 0,9 ± 0,2* 22 0,5 ± 0,06 +4
Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка. Результаты даны в виде М ± т для 6 параллельных измерений. * — достоверные отличия от контроля, р < 0,05; знак «+» обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.
Таблица 3
Скорость образования путресцина и ПА на фоне действия синтетических аналогов субстратов и продуктов реакции декарбоксилирования орнитина и S-аденозилметионина в бесклеточной тест-системе из гепатомы Г-27 крыс
Вещество ОДК Эффект, % Синтез спермидина Эффект, % Синтез спермина Эффект, %
— 2,6 ± 0,2 0 1,1 ± 0,04 0 0,4 ± 0,01 0
ДФМО 2,0 ± 0,1* 23 1,1 ± 0,1 0 0,2 ± 0,01* 50
МГБГ 2,7 ± 0,2 4 0,97 ± 0,02* 22 0,35 ± 0,02* 25
I 2,0 ± 0,1* 23 1,2 ± 0,04 +9а 0,35 ± 0,02* 25
II 2,3 ± 0,3 12 1,0 ± 0,2 9 0,4 ± 0,01* 0
III 2,4 ± 0,3* 8 0,9 ± 0,1 18 0,3 ± 0,04* 25
IV 1,5 ± 0,1* 42 0,8 ± 0,01* 27 0,4 ± 0,01* 0
V 1,6 ± 0,1* 38 0,45 ± 0,01* 59 0,2 ± 0,03* 50
VI 4,3 ± 0,5* +65 0,6 ± 0,02* 45 0,16 ± 0,02* 17
VII 4,8 ± 0,4* +85 1,0 ± 0,2 9 0,2 ± 0,02* 50
VIII 3,3 ± 0,2* +27 0,8 ± 0,1* 27 0,4 ± 0,02 0
IX 3,5 ± 0,1* +35 1,2 ± 0,1 +9 0,45 ± 0,03 + 12
X 3,4 ± 0,2* +31 0,9 ± 0,1 18 0,2 ± 0,05* 50
Примечание. Скорость биосинтеза путресцина и ПА представлена в мккат/кг белка. Результаты даны в виде М ± т для 6 параллельных измерений. * — достоверные отличия от контроля, р < 0,05; знак «+» обозначает увеличение скорости биосинтеза путресцина и ПА.
Эффективность антипролиферативного действия химических соединений оценивали по степени торможения синтеза Пут и ПА, а также дополнительно рассчитывали коэффициент молярного отношения спермидина к спермину (Сд/См) и величину суммарного пула ПА (£ПА) после одного часа инкубации. Показатель Сд/См положительно коррелирует со скоростью пролиферации как нормальной, так и опухолевой ткани [7].
В первой группе тестируемых веществ наиболее активными оказались соединения I и IV. Они не уступали по эффективности действия, а по некоторым показателям даже превосходили ДФМО и МГБГ (см. табл. 2 и 3).
Соединения второй группы ингибировали синтез ПА в обеих системах с разной степенью эффективности. В опухолевой модели это приводило к резкому, почти двукратному, возрастанию фракции Пут. Исключение составил этиленди-амин (V). Он проявил сильные антипролиферативные свойства по всем выбранным показателям (Сд/См, 2ПА и уровень Сд), в особенности по отношению к опухолевой ткани.
Обсуждение. Ситуацию, когда вещества, структурно похожие на полиамины или содержащие спермидиновую цепь, продуцируют противоположные эффекты, по-видимому, можно объяснить двойственным характером действия и самих полиаминов. Так, в зависимости от концентрации, последние оказывают или стимулирующее, или угнетающее воздействие на различные биохимические и физиологические процессы.
Практически одинаковые исходные уровни синтеза Пут и ПА в двух используемых модельных системах облегчили проведение сравнительного анализа регуляторных свойств исследуемых соединений. ДФМО и МГБГ были выбраны как известные ингибиторы ОДК и аденозилметиониндекарбоксилазы (АМДК) для оценки чувствительности тест-систем к регуляторному воздействию химических веществ на процесс синтеза Пут и ПА. Оба известные ингибитора проявили существенное и специфическое действие (см. табл. 2 и 3) с заранее предполагаемой направленностью как в опытах с опухолевой, так и с регенерирующей тканью. Это свидетельствует о том, что данные бесклеточные модельные системы функционируют адекватно поставленным задачам.
Различная эффективность и избирательность характера действия тестируемых веществ на скорость образования путресцина и ПА в системах из регенерирующей и опухолевой ткани указывают на разбалансированность в опухолевой ткани процесса поэтапного синтеза ПА и на изменения в структуре и каталитических свойствах ферментов, синтезирующих ПА.
Соединения первой и второй групп различались по химической структуре и возможному механизму действия. Реакционная способность аминооксигруп-пы соединений I и IV обусловлена реакцией образования оксимов пиридоксаль-5'-фосфата [8]. Гомологическая серия веществ второй группы варьировала в длине углеводородной цепи, разделяемой различным местоположением иминогруп-пы на ди- и триметиленовые фрагменты. Как химические аналоги Пут и ПА они, вероятно, могли бы действовать по типу ретроингибирования или по конкурентному механизму.
Направленность действия всех 12 исследованных веществ в основном совпадала в обеих системах. Однако глубина торможения процесса биосинтеза ПА в модели из регенерирующей ткани была больше. Это свидетельствует о большей чувствительности данной системы в целом и, в частности, полиаминсинтезиру-ющих ферментов к химическому воздействию. Поскольку при действии канцерогенов образуются множественные формы ОДК, это может быть связано с существованием различных по структурно-функциональным свойствам форм ОДК и АМДК в трансформированной и нетрансформированной тканях, а также с раз-балансированностью в опухолевой ткани поэтапного процесса биосинтеза ПА. Более резкие изменения в скорости синтеза ПА в модели из регенерирующей ткани печени могут быть связаны также с одновременным протеканием процесса окислительного дезаминирования, поскольку активность оксидаз Пут и ПА сохраняется в этой ткани почти на нормальном уровне, а в опухолевой практически равна нулю. Отсутствие синхронизации в действии ОДК и АМДК в опухолевой ткани и наличие высокого исходного уровня Пут и декарбоксилированного S-аде-нозилметионина указывает на необходимость сочетанного применения ингибиторов этих двух ферментов и активаторов процесса окислительного дезаминирования ПА.
Сравнительный анализ степени эффективности возможного регуляторного действия двух групп тестируемых соединений, проведенный на двух модельных бесклеточных системах с различными биологическими, но с одинаково высокими пролиферативными свойствами, показал, что потенциально сильные антипроли-феративные агенты должны одновременно существенно снижать ИПА, отношение Сд/См и уровень Сд до критического значения (70%). Из числа исследуемых соединений этим требованиям в большей степени удовлетворяют 1-аминоокси-3-аминопропан (I), З-(5'-дезоксиаденозил)-З-метил-Р-тиоэтилгидроксиламин (IV) и этилендиамин (V).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Porter C.W., Sufrin J.R. Interference with polyamine biosynthesis and/or function by analogs of polyamines or methionine as a potential anticancer chemotherapeutic strategy // Anticancer Res. — 1986. — V. 6. — P. 525—542.
[2] Сяткин С.П., Березов Т.Т., Гридина Н.Я. и др. Полиамины как биохимические маркеры антипролиферативного действия ингибиторов ферментов биосинтеза полиаминов и путресцина в культуре L-клеток // Вопр. мед. химии. — 1991. — Т. 37. — № 6. — С. 77—81.
[3] Higgins G.M., Anderson R.M. Experimantal pathology of liver: restoration of liver of white rat following partial surgical removal // Arch. Path. — 1931. — V. 12. — P. 186—202.
[4] Швембергер И.Н. Перевиваемый штамм гепатомы крысы Г-27 // Цитология. — 1970. — Т. 12. — С. 1057—1059.
[5] Сяткин С.П. Модифицированный метод определения белка в пробах с повышенным содержанием липо- и гликопротеидов // Вопр. мед. химии. — 1981. — Т. 27. — № 1. — С. 136—138.
[6] Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. — М.: Мир, 1982. — 488 c.
[7] Morgan DM. Polyamines. An overview // Mol. Biotechnol. — 1999. — V. 11. — N 3. — P. 229—250.
[8] Хомутов А.Р., Хомутов P.M. Синтез аминооксианалогов путресцина и спермидина // Биоорг. Химии. — 1989. — Т. 15. — № 5. — С. 698—703.
THE INFLUENCE OF CHEMICAL POLYAMINES ANALOGS, DECARBOXYLATED ORNITHINE AND S-(ADENOSYL)-METHIONINE ON THE POLYAMINE SYNTHSIS VELOCITY IN TEST-SYSTEMS FROM TISSUES WITH HIGH PROLIFERATION
S.P. Siatkin, T.T. Berezov, T.V. Fedoronchuk,
N.Ya. Gridina, E.A. Neborakh, N.A. Shevkhun,
N.A. Sokueva, E.V. Ustinova, R.I. Sokuev
Russian Peoples’ Friendship University
Miklukho-Maklaya str., 8, Moscow, Russia, 117198 [email protected], +7(495)420-23-69
The aliphatic (amino)- and (oxy)-derivatives of polyamines effect on the rate of polyamines (Put-rescine, Spermidine and Spermine) synthesis in cell-free test-systems from rat’s regenerating liver and Hepatoma tissues was examined. The common known inhibitors of polyamines synthesis were also used for the analysis. The research data confirm that cell-free model systems function adequately to applied tests. The effectiveness of anti-proliferate action of chemical compounds was valued by the inhibition degree of Putrescine and polyamines synthesis. In addition, the coefficient of ratio Spermidine (moles)/ Spermine (moles) and the value of total Polyamines pool after 1 h of test-systems incubation with chemical compound were calculated. From the tested compounds 1-aminooxy-3-aminopropan (I), S-(5’-desoxy-adenosile)-S-methyl-P-thioethyl-hydroxylamine (IV) and ethylenediamine (V) did satisfied the requirements to a considerable degree.
Key words: polyamines, Putrescine, Spermidine, Spermine, oxidative deamination, Difluoromethyl-ornithine, Ornithine decarboxylase.
