CC BY
22
УДК 616-006.04
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МИКРОМЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПОЛИАМИНОВ В БИОПРОБАХ С ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
Е.В. Неборак, С.П. Сяткин, С.В. Кутяков, Р.И. Сокуев, К.Ю. Сунграпова
Российский университет дружбы народов Москва, Россия
Аннотация. Биогенные полиамины необходимы для клеточного роста и пролиферации, в том числе для опухолевых клеток. Существует интерес к измерению уровней полиаминов в биопробах как в клиниких, так и в научных исследованиях. Целью работы была адаптация способа определения концентраций биогенных полиаминов в биологических жидкостях методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Задачи: подбор более дешевых реагентов для замены указанных в методиках, подбор оптимальных условий элюирования на имеющемся оборудовании, апробации адаптированной методики. Результаты: модифицированная методика успешно апробирована на бесклеточной тест-системе при первичном скрининге влияния тестируемых химических соединений на скорость синтеза полиаминов.
Ключевые слова: полиамины, путресцин, спермидин, спермин, ВЭЖХ с флуориметрической детекцией, онкозаболевания, скрининг.
Введение. Резко повышенный уровень полиаминов (ПА) в биологических жидкостях характерен для многих видов онкологических заболеваний [1]. Обмен ПА активно вовлечен в процессы опухолевой пролиферации и клеточной дифферен-цировки [2] Это делает его привлекательной терапевтической мишенью для разработки потенциальных противоопухолевых препаратов направленного механизма действия [3]. Мониторинг уровня ПА в биологических жидкостях можно также использовать для контроля за результатом лечения [4]. Так, клинический мониторинг уровней ПА проводится при: карциноме простаты, прогнозировании исхода при остром миелоидном лейкозе, трансплантации костного мозга, фокальной церебральной ишемии и в ряде других клинических ситуаций [4].
Основным аналитическим методом определения ПА в настоящее время остается метод ВЭЖХ с пред- или постколоночной дериватизацией [4],
поскольку молекулы свободных ПА не имеют поглощения в видимой или УФ-области спектра [1]. Все большую популярно приобретают также методы определения ПА методом газовой хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ГХ-МС) [5], при этом они менее затратны по времени, а их чувствительность в 50 раз превышает чувствительность методов ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией. Результаты данных методов хорошо коррелируют с результатами, полученными методом ВЭЖХ. Однако высокая стоимость оборудования препятствует широкому применению метода ГХ-МС. Известны методы определения концентраций ПА с помощью капиллярного электрофореза [6]. Это экспресс-методы, но они менее чувствительны по сравнению с ГХ и ВЭЖХ. Следует упомянуть также существование иммунофер-ментных методик определения ПА. Ограничивающим фактором для них является кросс-реактивность различных ПА к антителам [4]. Таким обра-
—--
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
Неборак Е.В. и др. Модифицированный микрометод определения концентрации полиаминов.
—--—
зом, использование известных методик [7—9], как правило, затруднительно из-за ограниченной доступности реагентов, расходных материалов и оборудования ввиду их высокой коммерческой стоимости. В связи с этим возникает необходимость в удешевлении и упрощении метода путем модификации и адаптации существующих методик к конкретным материально-техническим возможностям клинических баз.
Целью данной работы была технико-экономическая оптимизация способа определения концентраций ПА в биологических пробах.
Метод флуоресцентной детекции более чувствителен по сравнению с методом спектрофото-метрической детекции, т.к. позволяет определять концентрацию веществ в диапазоне фмоль. В качестве дериватизирующих флуоресцентных агентов наиболее популярны: орто-фталевый диальдегид (ОРА) в комбинации с тиоловым агентом, флуоре-нил-метилоксикарбонил-хлорид (FMOC), дансил-хлорид (1,2-нафтохинон-сульфонат) а также дабсил-хлорид [7—9]. Дериватизация о-фталевым диаль-дегидом в присутствии меркаптоэтанола применяются довольно широко, однако неустойчивость получаемых производных не позволяет заготавливать образцы на длительный срок до момента непосредственного ВЭЖХ-анализа. Самым распространенным дериватизирующим агентом остается дансил-хлорид (N, N-1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорид) [4; 8].
Материалы и методы. В работе использовали следующие реактивы: дансил-хлорид (Sigma Aldrich, 99,8%, США), L-орнитин («Реахим», 98%, Россия), пиридоксаль-фосфат («Реанал», 99,8%, Венгрия), дитиотреитол («Serva», «research grade», ФРГ), натрия гидрокарбонат («Химмед», ЧДА, Россия), калия фосфат («Химмед», ЧДА, Россия), калия гидрофосфат («Химмед», ЧДА, Россия), ацетон («Химмед», ЧДА, Россия), бензол («Химмед», ЧДА, Россия), ДМСО («Димексид», Марбиофарм, Россия), соляная кислота 9,8N («Химмед», ЧДА, Россия), метанол («Acros», «для хроматографии», США). Анализ был выполнен на высокоэффективном жидкостном хроматографе на базе платформы Agilent 1200 с использованием метода абсолютной калибровки (Nucleosil C18, 250 мм, 4,6 мм, 5 мкм, Macherey-Nagel). В ходе исследования были протестированы производные анилина, структурные формулы которых представлены в табл. 1 [10]. Частичную гепатэктомию проводили по методу [11].
Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури в модификации С.П. Сяткина [12]. Полученные данные подвергали статистической обработке с использованием стандартного пакета программ Statistica 7.0.
Результаты и их обсуждение. Для определения концентраций путресцина и ПА в биологических объектах был модифицирован метод с дан-сил-хлоридом в качестве дериватизирующего агента, дающего устойчивые флуоресцирующие продукты с первичными и вторичными аминами [9].
В литературе описаны различные варианты соотношений аналита и дериватизирующего реагента [7—9]. В нашем случае ход пробоподготовки был следующим. К 0,1 мл супернатанта добавлялся насыщенный раствор карбоната натрия (до рН = 9,5) и, после перемешивания, 0,2 мл дансил-хлорида в ацетоне (7,5 мг/мл). Реакция дансилирования проводилась в темноте при 55 °С в течение 60 минут. Избыток реагента после окончания реакции удалялся 30-минутной инкубацией с 0,2 мл дистиллированной воды. Жидкофазная экстракция продуктов реакции проводилась в бензол. После тщательного перемешивания и разделения фаз аликвота 400 цл переносилась в эппендорф, растворитель выпаривался, а осадок растворялся в 1 мл метанола хроматографической чистоты. После ультрацентрифугирования (50 000 х 15 мин) надосадочная жидкость переносилась в виалу. Объем вводимой пробы составил 20 цл. Анализ был выполнен на высокоэффективном жидкостном хроматографе на базе платформы Agilent 1200 с использованием метода абсолютной калибровки.
Был проведен подбор оптимальных условий хроматографирования на имеющемся оборудовании (Nucleosil C18, 250 мм, 4,6 мм, 5 мкм, Macherey-Nagel). Состав элюирующей смеси был наиболее простым из предложенных в литературе — вода-метанол. Наиболее оптимальным оказался состав вода-метанол в соотношении 40% : 60%. Режим хроматографического элюирования представлял собой комбинацию градиентного и изократическо-го элюирования. Так, с 1-й по 23 минуту градиент метанола возрастал с 60% до 95%, последующие 2 минуты происходило изократическое элюирова-ние 95% метанолом, 5 минут — промывка колонки 100% метанолом, 5 минут — приведение системы в исходное состояние. Все время анализа занимало 35 минут. Параметры флуоресцентной детекции: ^em = 365 нм, ^ex = 510 нм.
—--
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2016. Vol. 18. No 9
—--—
Таблица 1
Тестируемые соединения
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
Неборак Е.В. и др. Модифицированный микрометод определения концентрации полиаминов..,
—--—
5 10 15 20 2 5 30
Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси ПА
5 1 0 15 20 2 5 30
Рис. 2. Хроматограмма биологической пробы с целевыми ПА
Отработанную методику использовали для определения концентраций ПА в пробах из регенерирующей печени крысы на фоне действия тестируемых соединений — производных анилина [10].
На рисунке 1 представлена хроматограмма контрольной смеси состава путресцин-спермидин-спермин. Пригодность хроматографической системы определяли по факторам симметрии для пиков контрольной смеси, значения которых не превышали 1,5 и числу теоретических тарелок для каждого из компонентов контрольной смеси. Последнее составляло не менее 3000 (критерий приемлемости).
Время удерживания составило для дансилхло-ридных производных путресцина 14,6 мин, спер-мидина — 20,2 мин, спермина — 23,8 мин. Коэффициенты линейной регрессии калибровочных кривых были равны для путресцина 0,9936, для спермидина 0,9983, для спермина 0,9908. Сходимость процесса была определена для 3 параллельных инжекций, относительное стандартное откло-
нение при этом не превышало 2%. Диапазон концентраций подбирался таким образом, чтобы экспериментальные данные попадали в его линейный фрагмент.
В литературе описан метод удаления избытка дериватизирующего реагента добавлением проли-на [9]. Однако разрушение дансил-хлорида дистиллированной водой значительно упрощает и удешевляет эту процедуру. Таким образом, простота и доступность реактивов для хроматографии — как для дериватизации, так и для элюирования — делает методику практически универсальной и воспроизводимой на любой обращено-фазовой колонке типа С18.
Метод апробирован в экспериментах по определению концентрации ПА в бесклеточной тест-системе на фоне действия тестируемых соединений. На рисунке 2 представлена хроматограмма биологической пробы без обработки тестируемыми соединениями.
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 87 ~
The Journal of scientific articles "Health and Education Millennium", 2016. Vol. 18. No 9
----—-
Таблица 2
Скорость синтеза ПА на фоне действия тестируемых веществ
Шифр Путресцин, Эффект, Спермидин, Эффект, Спермин, Эффект,
вещества нкатал/г % нкатал/г % нкатал/г %
К 0,95 ± 0,06 1,3 ± 0,01 0,46 ± 0,01*
А1 0,23 ± 0,02* 44 0,63 ± 0,01* 48 0,33 ± 0,01* 72
А2 0,52 ± 0,02* 44 0,42 ± 0,02* 32 0,26 ± 0,02* 56
A3 1,20 ± 0,05* 86 0,71 ± 0,02* 55 0,42 ± 0,02* 92
A4 0,64 ± 0,05* 56 0,58 ± 0,01* 45 0,31 ± 0,02* 68
А5 0,75 ± 0,04* 55 0,48 ± 0,02* 37 0,27 ± 0,01* 59
А6 0,28 ± 0,05* 34 0,38 ± 0,03* 30 0,26 ± 0,05* 56
А7 0,82 ± 0,05* 75 0,80 ± 0,05* 62 0,41 ± 0,01* 90
А8 0,62 ± 0,01* 57 0,59 ± 0,05* 46 0,33 ± 0,05* 71
А9 0,37 ± 0,01* 48 0,61 ± 0,03* 47 0,32 ± 0,05* 70
А10 0,35 ± 0,17* 41 0,48 ± 0,06* 37 0,29 ± 0,05* 62
А11 0,45 ± 0,02* 41 0,40 ± 0,03* 31 0,25 ± 0,05* 54
Примечания. Результаты представлены в виде среднего М ± т для 4 параллельных измерений. *Отличие от контроля статистически достоверно (р < 0,05).
Результаты опытов с тестируемыми соединениями представлены в табл. 2.
Получены данные о статистически значимых изменениях (снижении) синтеза ПА в бесклеточной тест-системе на фоне действия тестируемых соединений, из чего можно заключить, что данные вещества обладают потенциальными противоопухолевыми свойствами.
Заключение. Таким образом, мы заключаем, что разработанная модификация позволяет достаточно быстро проводить анализ биологических проб, содержащих ПА, простота и доступность реактивов делает ее универсальной и экономически выгодной.
ЛИТЕРАТУРА
1. Miller-Fleming L., Olin-Sandoval V., Campbell K., Raiser M. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. // J Mol Biol. 2015. Oct. 23;427(21). P. 3389—406.
2. Polyamines metabolism and breast cancer: state of the art and perspectives / Cervelli M., Pietropaoli S., Sig-nore F., Amendola R., Mariottini P. // Breast Cancer Res Treat. 2014. Nov. 148(2). P. 233—48.
3. Nowotarski S.L., Woster P.M., Casero R.A.Jr. Po-lyamines and cancer: implications for chemotherapy and che-moprevention // Expert Rev Mol Med. 2013. Feb 22;15:e3.
4. Gugliucci. Polyamines as clinical laboratory tools // Clinica Chimica Acta. 2004. 344. P. 23—35.
5. Gosetti F, Mazzucco E, Gennaro MC, Marengo E. Simultaneous determination of sixteen underivatized bio-
genic amines in human urine by HPLC-MS/MS // Anal Bioanal Chem. 2013. Jan. 405(2—3). P. 907—16.
6. Hernández-Cassou S., Saurina J. Derivatization strategies for the determination of biogenic amines in wines by chromatographic and electrophoretic techniques // Journal of Chromatography В.2011. 879. P. 1270—1281.
7. Molnár-Perl I. Advancement in the derivatizations of the amino groups with theo-phthaldehyde-thiol and with the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride reagents // Journal of Chromatography B. 2011. 879. P. 1241—1269.
8. Escribano M.I. Legaz M.E. High Performance Liquid Chromatography of the Dansyl Derivatives of Putrescine, Spermidine, and Spermine // Plant Physiol. 1988. Nov. 87. P. 519—522.
9. Ducros V., Ruffieux D., Belva-Besnet H., de Frai-pont F., Berger F., Favier A. Determination of dansylated polyamines in red blood cells by liquid chromatography-tandem mass spectrometry // Analytical Biochemistry 2009. Nov. 390. P. 46—51.
10. Волков С.В., Кутяков С.В., Левов А.Н., Полякова Е.И., Ань Ле Туан, Солдатова С.А., Терентьев П.Б., Солдатенков А.Т. Превращение 3-бензоил-1-метил-4-фенил-у-пиперидола под действием ариламинов и арил-гидразинов. Синтез 3-ариламино-1-оксо-1-фенилпропа-нов и 1,3-диарилпиразолов и их фрагментация под электронным ударом // ХГС. 2007. № 4. С. 544—554.
11. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimantal pathology of liver: restoration of liver of white rat following partial surgical removal // Arch. Path. 1931. V. 12. P. 186— 202.
12. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 187. Т. 2. С. 31.
—--—-
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
HeóopaK E.B. u dp. MoflH^^HpoBaHHwñ MHKpoMeiog onpege^eHHH концeнтрaцнн no^HaMHHOB.
----—
MODIFIED MICROMETHOD
OF POLYAMINES ASSAY IN BIOLOGICAL SAMPLES WITH FLUOROMETRIC DETECTION
E. V. Neborak, S.P. Syatkin, R.I. Sokuev, S. V. Kutyakov, K. Y. Sungrapova
Peoples' Friendship University of Russia (RUDN-University) Moscow, Russia
Annotation. Biogenic polyamines are essential for cell growth and proliferation, including cancer cells. Measuring their levels in bioassays is needed in the clinic and in research. The aim of the work was to adapt the method for determining the concentrations of biogenic polyamines in biological fluids using HPLC with fluorescence detection. Tasks: the selection of cheaper reagents to replace these in the methods, selection of optimal elution conditions on existing equipment, testing methods adapted. Results: modified technique has been successfully tested in a cell-free assay system within the primary screening to identify the nature of the effect of the tested compounds on polyamine metabolism.
Key words: polyamines, putrescine, spermidine, spermine, HPLC with fluorometric detection, cancers, screening.
REFERENCES
1. Miller-Fleming L., Olin-Sandoval V., Campbell K., Ralser M. Remaining Mysteries of Molecular Biology: The Role of Polyamines in the Cell. J Mol Biol. 2015. Oct. 23;427(21). p. 3389—406.
2. Cervelli M., Pietropaoli S., Signore F., Amendola R., Mariottini P. Polyamines metabolism and breast cancer: state of the art and perspectives. Breast Cancer Res Treat. 2014. Nov. 148(2). p. 233—48.
3. Nowotarski S.L., Woster P.M., Casero R.A.Jr. Po-lyamines and cancer: implications for chemotherapy and che-moprevention. Expert Rev Mol Med. 2013. Feb 22;15:e3.
4. Gugliucci. Polyamines as clinical laboratory tools. Clinica Chimica Acta, 2004, 344, p. 23—35.
5. Gosetti F., Mazzucco E., Gennaro M.C., Marengo E. Simultaneous determination of sixteen underivatized biogenic amines in human urine by HPLC-MS/MS. Anal Bioanal Chem. 2013. Jan. 405(2—3). p. 907—16.
6. Hernandez-Cassou S., Saurina J. Derivatization strategies for the determination of biogenic amines in wines by chromatographic and electrophoretic techniques. Journal of Chromatography B.2011. 879. p. 1270—1281.
7. Molnar-Perl I. Advancement in the derivatizations of the amino groups with theo-phthaldehyde-thiol and with the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride reagents. Journal of Chromatography B. 2011. 879. p. 1241—1269.
8. Escribano M.I., Legaz M.E. High Performance Liquid Chromatography of the Dansyl Derivatives of Pu-trescine, Spermidine, and Spermine. Plant Physiol. 1988. Nov. 87. p. 519—522.
9. Ducros V., Ruffieux D., Belva-Besnet H., de Frai-pont F., Berger F., Favier A. Determination of dansylated polyamines in red blood cells by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry 2009. Nov.390. p. 46—51.
10. Volkov S.V., Kutyakov S.V., Levov A.N., Polya-kov E.I., Le Anh Tuan, Soldatov S.A., Terentyev P.B., Soldatenkov A.T. Conversion of 3-benzoyl-1-methyl-4-phenyl-y-piperidola under the action arylamines and aryl-hydrazines. Synthesis of 3-arylamino-1-oxo-1-1,3-fenilpro-panov diarilpirazolov and electron impact fragmentation under. Chemistry of Heterocyclic Compounds, 2007, no. 4, p. 544—554 (in Russian).
11. Higgins G.M., Anderson R.M. Experimantal pathology of liver: restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Arch. Path., 1931, vol. 12, pp. 186—202.
12. The State Pharmacopoeia of the USSR: Vol. 1. General methods of analysis / USSR Ministry of Health. 11th ed., Ext. Moscow, Medicine, 187. Vol. 2. P. 31.
