CC BY
29
Глазанова Т. В., Розанова О. Е., Павлова И. Е., Чубукина Ж. В., Шилова Е. Р., Бубнова Л. Н.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский НИИ гематологии и трансфузиологии» Федерального медико-биологического агентства
ВЛИЯНИЕ ГЕМОКОМПОНЕНТНОЙ ТЕРАПИИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА И ОБРАЗОВАНИЕ АЛЛОАНТИТЕЛ У БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ
Glazanova T. V., Rozanova O. E., Pavlova, Chubukina J. V., Shilova E. R., Bubnova L. N.
Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Russian Federal Medico-biological Agency
THE EFFECT OF HAEMOCOMPONENT THERAPY ON IMMUNE PARAMETERS AND ALLOANTIBODY FORMATION IN PATIENTS WITH APLASTIC ANEMIA
Резюме: Исследованы показатели иммунитета и образование антител к антигенам НЬА I и II класса и НРА у пациентов с апластиче-ской анемией (АА, п=54), часть из которых (38,9 %) получала трансфузии гемокомпонентов (ГК) — эритроцитной массы и/или тромбоцит-ного концентрата, а другая часть не получала трансфузий. При отсутствии различий между выделенными группами в относительном содержании общей популяции Т-лимфоцитов, их основных иммунорегуляторных субпопуляций (Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток) и В-клеток, установлено опосредованное имму-носупрессирующее влияние гемокомпонентной терапии на показатели клеточного иммунитета, проявляющееся в изменении относительного содержания ряда минорных популяций: возрастании числа иммунокомпетентных клеток с фенотипом CD8+/CD3- и снижении числа активированных лимфоцитов с фенотипом CD3+/ DR+ и НКТ-клеток 16/56+). У боль-
ных АА, получавших гемокомпонентную терапию, выявлено более высокое содержание ИЛ-6 (в 1,3 раза) и более низкое содержание ИЛ-1Ь (в 2,1 раза) и ИФ^ (в 2,5 раза) по сравнению с группой больных, которым не проводились трансфузии гемокомпонентов. У подавляющего большинства больных (93,3 %), получавших ГК, присутствовали те или иные из изученных алло-антител. При этом чаще всего выявляли НЬА антитела II класса — у 70 % обследованных и НРА антитела — у 61 % обследованных пациентов; НЬА антитела I класса были обнаружены у 50 % больных, получавших трансфузии ГК. Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, что пациентов с многократными трансфузиями гемокомпонентов в анамнезе следует относить к группе повышенного риска развития вторич-
Summary: We have investigated the immune system and the formation of antibodies to antigens HLA class I and II and HPA in patients with aplastic anemia (AA, n=54), some of which (38,9 %) received transfusions of blood components — red blood cell mass and/or platelet concentrate, and the other part did not receive transfusions. In the absence of differences between groups in the relative content of the total population of T lymphocytes, their main immunoregulatory subpopulations of T-helper and T-cytotoxic cells and B-cells, we have revealed mediated immunosuppression influence of blood component therapy on the indices of cell immunity, which is manifested by the change of the relative content of a number of minor populations: the increase in the number of immunocompetent cells with the phenotype CD8+CD3 — and reducing the number of activated lymphocytes with the phenotype CD3+DR+ and NKT-cells (CD3+CD16/56+). In patients with AA treated with blood component therapy, we have revealed a higher content of IL-6 (1.3-fold) and a lower concentration of IL-1b (2.1fold) and IFNg (2.5-fold) compared with the group of patients with no transfusions of blood components. In the majority of patients (93,3 %) receiving the blood components, some of the studied alloantigens were present. Most often identified HLA antibodies class II — 70 % of patients and the HPA antibodies in 61 % of patients surveyed; HLA antibodies class I were detected in 50 % of patients receiving blood component transfusions.
The results suggest, first, that patients with multiple transfusions of blood components in the anamnesis should be attributed to the high-risk group for the development of secondary immunodeficiency, which should be taken into consideration when prescribing immunosuppressive drugs in such patients. Secondly, the presence of
ного иммунодефицита, что целесообразно учитывать при назначении иммуносупрессивных препаратов трансфузионнозависимым больным. Во-вторых, наличие алосенсибилизации следует принимать во внимание при выборе тактики ге-мокомпонентной терапии.
Ключевые слова: клеточный иммунитет, цитокины, трансфузии, аллоантитела, гемокомпоненты, апластическая анемия.
allosensibilization should be taken into consideration when choosing tactics of blood component therapy.
Key words: cell immunity, cytokines, transfusions, alloantibodies, haemocomponents, aplastic anaemia.
Введение. Переливание компонентов донорской крови является важной и неотъемлемой частью лечения больных с заболеваниями системы крови. Внедрение в практику новых программ интенсивной химиотерапии обуславливает возрастающую потребность в трансфузиях тромбоцитного концентрата. Иммунологическая и инфекционная безопасность является основным принципом гемотрансфузионной терапии. Известно, что содержащиеся в донорской крови лейкоциты, их фрагменты и вырабатываемые ими цитокины могут являться причиной нежелательных иммунологических эффектов, таких как НЬА-аллоиммунизация, фебрильные негемолитические реакции, острое трансфузионное поражение
легких и другие иммуноопосредованные осложнения. Индуцированная аллогенными гемотрансфузиями модуляция иммуного ответа, в основном проявляющаяся в виде иммуносупрессии, является одним из важнейших нежелательных эффектов у трансфузионнозависимых пациентов [1, 2]. Считается, что она связана с наличием в гемокомпонентах (ГК) лимфоцитов, с которыми в организм реципиента поступает множество чужеродных антигенов, включая донорские антиген-презентирующие клетки, несущие антигены НЬА II класса. Кроме того, трансфузии аллогенных гемокомпонентов, хранимых в течение длительного периода времени, могут индуцировать анергию Т-клеток реципиента [3], приводящую к иммуносупрессии. Показано, что у реципиентов аллогенных гемотрансфузий наблюдаются различные нарушения функции клеток иммунной системы, включая снижение соотношения хелперы/супрессоры, ингибицию активности натуральных киллеров (НК-клеток), процессов антигенной презентации, а также развитие гиперчувствительности замедленного типа [4]. Умеренные нарушения в составе лимфоидных субпопуляций и функции естественных киллеров обнаруживались даже
через полгода после трансфузий аллогенных ГК [5]. Кроме того, имеются данные о связи между продукцией ИЛ-6 и эффективностью трансфузий гемокомпонентов, в частности — тромбоцитного концентрата [6]. Для клинической практики наибольший интерес представляют HLA- и HPA- антигены тромбоцитов, т.к. именно к этим антигенам чаще всего образуются аллоантитела. Из антигенов главного комплекса гисто совместимости на поверхности тромбоцитов определяются HLA-антигены только класса I (преимущественно локусов А и В, в меньшей степени — локуса С).
Тем не менее, на настоящий момент не существует исчерпывающей картины, дающей представление о закономерностях и механизмах иммуномодуляции, а также процессах антитело-образования в процессе трансфузий компонентов крови, поэтому данный вопрос требует дальнейшего исследования и уточнения.
Целью настоящей работы явилось изучение влияния трансфузий гемокомпонентов на состояние иммунной системы пациентов с апластической анемией и на образование антител к антигенам HLA I и II класса и НРА у этой категории больных.
Материалы и методы. Исследованы показатели иммунитета у 54 пациентов с апластической анемией (АА), часть из которых (38,9 %) получала трансфузии эритроцитной массы и/или тромбоцитного концентрата. Кроме того, определяли содержание антител к антигенам HLA I и II класса и НРА, т.е., антигенам лейкоцитов и тромбоцитов.
Фенотипирование мононуклеарных
клеток осуществляли с применением четырехцветной проточной цитометрии на лазерном проточном цитофлюориметре Beckman Coulter FC500 (США). Для исследования использовали моноклональные антитела производства Beckman Coulter (США), конъюгированные с флюорохромами, имеющие специфичность к следующим поверх-
ностным маркерам: CD3, CD4, CD8, CD16/56, CD19, CD25, HLA-DR. Гейтирование осуществляли с помощью антител к общелейкоцитарному маркеру CD45. По 100 мкл образцов цельной крови с антикоагулянтом помещали в пластиковые пробирки для проточного цитометра, добавляли 20 мкл моноклональных антител и инкубировали согласно прилагаемым к каждому реагенту инструкциям. Далее образцы подвергали лизису с помощью реагентов ImmunoPrep Reagent system, Beckman Coulter, США, используя автоматическую станцию про-боподготовки Beckman Coulter, США. Учет антиген-положительных клеток осуществляли на проточном цитофлюориметре, собирая не менее 5000 событий в области мононуклеарных клеток (CD45+/CD14-). Число клеток в этой области составляло не менее 95 %.
Определение цитокинов ИЛ-1Ь, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНОа и ИФ^ в сыворотке крови проводилось стандартным методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем «Цитокин», Россия.
Определение в сыворотке HLA антител I и II класса, а также НРА антител проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем компании GEN-PROBE (США): LIFECODES QuickS creen — для выявления HLA антител I класса, LIFECODES B-Screen — для выявления
HLA-антител II класса и LIFECODES Pak12 для выявления НРА антител.
Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью персонального компьютера, используя пакет прикладных программ «Microsoft Office Excel 2003», версия 7.0, применяя методы общей статистики. Сравнение двух выборок осуществляли с помощью методов непараметрической статистики по критерию Уилкоксона-Манна-Уитни для независимых переменных из пакета программы Statistica 6.0. Различия считали достоверными при уровне значимости Р < 0.05.
Результаты. Обследованные пациенты с апластической анемией (АА) были поделены на 2 группы: 1-я (33 человека, 61,1 %) — не получавшие трансфузий ГК, 2-я (21 человек, 38,9 %) — получавшие гемокомпоненты (трансфузии эритроцитной массы и/или тромбоцитного концентрата).
Результаты сравнения изученных иммунологических показателей в выделенных группах не выявили значимых различий в относительном содержании общей популяции Т-лимфоцитов (CD3+) и их основных иммунорегуляторных субпопуляций, CD3+CD4+ (Т-хелперы) и CD3+CD8+ (Т-цитотоксические клетки). Однако наблюдались достоверные изменения ряда других показателей (таблица 1).
Иммунологические показатели у пациентов с апластической анемией на фоне трансфузий гемокомпонентов
Таблица 1.
Группа больных АА CD8+CD3-( %) DR+CD3+ ( %) CD16/56+CD3+ ( %) CD16/56+CD3-( %)
1- без ГТ (n=33) 2,4 ± 0,21 2,2 ± 0,42 6,1 ± 0,51 7,9 ± 1,23
2- с ГТ (n=21) 4,6 ± 0,91 1,3 ± 0,31 5,4 ± 0,22 11,7 ± 2,03
Р ,-2 < 0,05 >0,05 >0,05 < 0,05
Так, отмечалось возрастание относительного содержания CD8+ лимфоцитов, не экспрессирующих маркер общей популяции Т-клеток CD3 (CD8+CD3-), в группе пациентов, получавших ГК, при сравнении с пациентами, не получавшими ГК — 2,4 % и 4,6 %, соответственно в 1-й и 2-й группе. Кроме того, у пациентов с АА, получавших трансфузии ГК, наблюдалось повышение относительного содержания клеток с фенотипом естественных киллеров (НК-клеток) — CD16/56+CD3- по сравнению с группой, не получавшей трансфузий ГК — 7,9 % и 11,7 %, соответственно в 1-й и 2-й группе. Отмечалась также тенденция к снижению от-
носительного содержания CD16/56+/CD3+-лимфоцитов, т.н. НКТ-клеток, в группах больных, получавших трансфузии ГК, по сравнению с больными 1-й группы — 6,1 % и 5,4 % в 1-й и 2-й группе, соответственно. Относительное содержание активированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих одновременно маркеры CD3 и DR, имело тенденцию к снижению во 2-й группе, по сравнению с таковым в 1-й группе — 2,2 % и 1,3 %, соответственно.
Исследование продукции цитокинов показало, что у больных апластической анемией, получавших гемокомпонентную терапию, выявлено более высокое содержание
ИЛ-6 (в 1,3 раза) и более низкое содержание ИЛ-1Ъ (в 2,1 раза) и ИФН^ (в 2,5 раза) по сравнению с группой больных, которым не
проводились трансфузии гемокомпонентов. Показатели ФНОа и ИЛ-10 в этих группах были сопоставимы (таблица 2).
Содержание цитокинов в сыворотке у пациентов с апластической анемией на фоне трансфузий гемокомпонентов
Таблица 2.
Группы ИЛ-6 (пг/мл) ИЛ-1Р (пг/мл) ФНОа (пг/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИФНу (пг/мл)
1- без ГТ (n=33) 92,2±37,48 258.69±31,93 1,81±0,62 14,87±2,48 145,42±35,75
2 — с ГТ (n=17) 70,18±25,51 521,43±367 2,08±0,94 17,12±2,08 364,84±58,76
Р >0,05 < 0,05 >0,05 >0,05 < 0,05
У подавляющего большинства больных (93,3 %), получавших ГК, присутствовали те или иные антитела. При этом чаще всего выявляли НЬА антитела II класса — у 70 % обследованных и НРА антитела — у 61 % обследованных пациентов. НЬА антитела I класса были обнаружены у 50 % больных, получавших трансфузии ГК.
Из общего числа получавших ГК больных АА с наличием антител у 43,3 % имелся лишь один из видов изученных антител, а у 56,7 % антитела встречались в каких-либо сочетаниях. Приблизительно у третьей части (26,7 %) были выявлены одновременно все три вида антител; сочетание НЬА антител I и II класса наблюдалось у 13,3 % больных; сочетание НЬА антител I класса и НРА антител — у 6,7 %, и сочетание НЬА антител II класса и НРА антител — также у 6,7 %.
Следует отметить, что при этом наблюдалась обратная связь между титром выявляемых антител и уровнем цитокинов.
Определение антител у больных АА, не получавших трансфузий ГК, показало, что какой-либо из видов антител присутствовал у 4 человек. При этом во всех случаях были обнаружены НЬА антитела I класса, у троих больных — НЬА антитела II класса и еще у троих больных НРА антитела. Следует отметить, что все пациенты, у которых наблюдался тот или иной вид сенсибилизации, были женщинами, имевшими беременности в анамнезе.
Обсуждение. Нами исследованы показатели иммунитета у пациентов с апластической анемией — заболеванием, при котором у части больных существует потребность в трансфузиях эритроцитов и тромбоцитов. В результате проведенных исследований выявлен ряд закономерностей изменения содержания некоторых субпопуляций иммунокомпетентных
клеток на фоне гемотрансфузий. Так, при отсутствии значимых изменений в содержании основных лимфоидных популяций
(Т-клеток — CD3+, их иммунорегуляторных субпопуляций — CD4+CD3+ и CD8CD3+, а также В-клеток — CD19+) при АА после трансфузий эритроцитсодержащих гемокомпонентов и/ или тромбоцитного концентрата наблюдается достоверное возрастание относительного содержания лимфоцитов с фенотипом CD8+CD3-, снижение содержания НКТ-клеток— CD16/56+CD3+, в большинстве случаев отмечено снижение уровня активированных Т-лимфоцитов (CD3+DR+). Выявлено возрастание числа НК-клеток (CD16/56+CD3-) на фоне гемо-трансфузионной терапии Клетки с фенотипом CD8+CD3- рассматривают как субпопуляцию НК-клеток с регуляторными функциями [7, 8]. Их возрастание на фоне трансфузий ГК, а также снижение уровня активированных Т-лимфоцитов, экспрессирующих одновременно молекулы CD3 и DR, свидетельствует о наличии иммунносупрессии. Можно предположить, что повышение содержания НК-клеток в некоторых группах пациентов, получающих гемотрансфузионную терапию, происходит вследствие активации KIR-рецепторов (Killer Immunoglobulin-like Receptors) этих клеток чужеродными (донорскими) HLA-антигенами; кроме того известно, что в ряде ситуаций при сохранном или повышенном количестве НК-клеток наблюдается их функциональный дефект — нарушение секреции цитокинов или цитотоксической функции [9]. НКТ-клетки с фенотипом CD16/56+CD3+ рассматриваются как иммунорегуляторная субпопуляция, обладающая способностью модулировать функции Т-регуляторных клеток (CD4+CD25+) посредством ИЛ-2-независимых механизмов [10,11].
Наличие аллосенсибилизации
у больных апластической анемией было ассоциировано с усилением выработки ИЛ-6 имунокомпетентными клетками и со снижением выработки ИЛ-1Ъ и ИФ^. Результаты подтверждают полученные нами ранее данные о связи эффективности трансфузий гемокомпонентов у больных острым миелоидным лейкозом и множественной миеломой с продукцией интерлейкина-6 [12].
Выявленные нами изменения в составе минорных субпопуляций иммунокомпетентных клеток (CD8+CD3-, CD3+DR+ и CD16/56+CD3+), обусловленные гемотрансфузионной терапи-
ей, свидетельствуют о нарушении Т-клеточного звена иммунитета, т.е., об опосредованной иммуносупрессии, вызываемой трансфузиями гемокомпонентов.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют, во-первых, что пациентов с многократными трансфузиями гемокомпонентов в анамнезе следует относить к группе повышенного риска развития вторичного иммунодефицита, что целесообразно учитывать при назначении иммуносупрессивных препаратов трансфузион-нозависимым больным. Во-вторых, наличие алло-сенсибилизации следует принимать во внимание при выборе тактики гемокомпонентной терапии.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gorham J. Transfusion tickles T cells through cross-priming // Blood. 2006. Vol. 107, N1. P. 6-7.
2. Waters J. Trauma surgery and transfusion options // International Trauma Care. 2008. Vol. 18, N1. P. 66-69.
3. Raghavan M., Marik P. Anemia, Allogenic Blood Transfusion, Immunomodulation in the Critically Ill. // Chest. 2005. Vol.127. P. 295-307.
4. Min Y., Gang C., Ling-ling F. et al. Immunologic changes to autologous transfusion after operational trauma in malignant tumor patients. Neopterin and Interleukin-2 //Journal of Zhejiang University Science. 2005. Vol. 6B, N1. P. 49-52.
5. Mathiesen O., LundL., Brodthagen U., Gandrup P. Leukocyte filtration does not affect lymphocyte subpopulations and NK cell function in recipients of blood transfusion // Vox Sang. 1998. Vol.74, N1. P. 15-20.
6. Даваасамбуу Б., Грицаев С. В., Глазанова Т. В. и др. Эффективность трансфузий тромбоцитного концентрата и интерлейкин-6 у больных острым миелоидным лейкозом // Трансфузиология. 2014. № 2. С. 60-61.
7. Brutkiewicz R., Venkataraman S. Natural killer (NKT) cells and their role in antitumor immunity // Clin.Rev.in Oncol./Hematol. 2002. Vol. 41. P. 287-298.
8. Yang S., Lee J. Role of NKT cells in allogenic islet graft survival // Clin. immunol. 2007. Vol. 124. P. 258-266.
9. Jakobisiak M., Lasek W., Golab J. Natural mechanisms protecting against cancer // Immunol.Lett.— 2003. Vol. 15, N9. P. 103-122.
10. Nikolova M., Lelievre J.—D., Carriere M., et al. Treg modulate CD8 subsets through pd-1/pdl1 pathway // Blood. 2009. Vol. 113, N19. P. 4556-4565.
11. Terabe M., Berzofsky J. NKT cells in immunomodulation of tumor immunity: a new immunoregula-tory axis. // Trends in Immunol. 2007. Vol. 28, N11. P. 491-496.
12. Даваасамбуу Б., Грицаев С. В., Глазанова Т. В. и др. // Клиническая онкогематология. 2014. Т. 7, № 2. С. 213-219.
