CC BY
83
ВЛИЯНИЕ ФУРОСТАНОЛОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ
ИЗ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ DIOSCOREA DELTOIDEA НА РЕГУЛЯТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ЭНДОТЕЛИЯ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ГИПОЭСТРОГЕН-ИНДУЦИРОВАННОЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
Е.Б. Артюшкова1, Н.Г. Туманова2, В.А. Метельская2, Т.Г Покровская1 В.И. Кочкаров1, М.В. Корокин1, М.В. Покровский1, Л.В. Корокина1, А.М. Носов3, М.М. Корнеев1
1 Курский государственный медицинский университет Росздрава
Государственный Научно-исследовательский центр профилактической медицины Росмедтехнологий, Москва 3Институт физиологии растений Российской академии наук, Москва
Влияние фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Deltoidea на регуляторную функцию эндотелия при моделировании ги-поэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции
Е.Б. Артюшкова1, Н.Г. Туманова2, В.А. Метельская2, ТГ Покровская1, В.И. Кочкаров1, М.В. Корокин1, М.В. Покровский1, Л.В. Корокина1, А.М. Носов3, М.М. Корнеев1 1Курский государственный медицинский университет Росздрава
Государственный Научно-исследовательский центр профилактической медицины Росмедтехнологий, Москва 3Институт физиологии растений Российской академии наук, Москва
Цель. Оценить эффекты фуростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea Deltoidea (ДМ-05, Институт физиологии растений РАН) на физиологические и биохимические показатели эндотелиальной функции у крыс в условиях гипоэстроген-индуцированной дисфункции эндотелия.
Материал и методы. В эксперимент включили 10 самок крыс Wistar массой 200-300 г, которым проводили билатеральную овариэктомию. Затем в течение 6 нед этим крысам вводили препарат ДМ-05. Животных контрольной группы (n=10) подвергли ложной операции без удаления яичников.
Результаты. Препарат ДМ-05 способствует восстановлению концентрации стабильных метаболитов оксида азота (NO), отражающих активность эндотелиальной NO-синтазы (eNOS). Данные эффекты подтверждаются коррекцией АД и параметров эндотелиальной функции. Исследования на открытом сердце выявили предотвращение гипоэстроген-индуцированного повышения адренореактивности.
Заключение. Применение веществ растительного происхождения с эстроген-подобной активностью может стать перспективным подходом к коррекции эндотелиальной дисфункции и снижению риска развития сердечно-сосудистых заболеваний у женщин в период менопаузы.
Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция, фитоэстрогены, овариэктомия, оксид азота, менопауза.
РФК 2008;2:85-88
Effect of furostanol glycosides from cultured Dioscorea deltoidea cells on regulatory function of endothelium in a rat model of hypoestrogen-induced endothelial dysfunction
E.B.Artyushkova1, N.G.Gumanova2, V.A.Metelskaya2, T.G.Pokrovskaya1, V.I.Kochkarov1, M.V.Korokin1, M.V.Pokrovsky1, L.V.Korokina1, A.M.Nosov3, M.M. Korneev1 1Kursk State Medical University, Kursk
2State Research center of preventive medicine of Rosmedtechnology, Moscow institute of Plant Physiology, Russian Academy of Sciences, Moscow
Aim. To study the effects of furostanol glycosides from cultured Dioscorea Deltoidea cells (DM-05, Institute of Plant Physiology, RAS) on physiological and biochemical markers of endothelial function in rats with hypoestrogen-induced endothelial dysfunction.
Material and methods. 10 female rats of Wistar line, with body mass 200-300 g have been included in the experiment. The bilateral ovariectomy was performed in rats to produce the model of hypoestrogen-induced endothelial dysfunction. Rats were treated with the injections of DM-05 during 6 weeks. False ovariectomy was performed in rats of control group (n=10).
Results. DM-05 restored the levels of stable metabolites of nitric oxide (NO) which reflex endothelial NO-synthase activity. Besides DM-05 corrected blood pressure and endothelial function. Experiments on open heart showed that DM-05 protects the cardiac tissue from hypoestrogen-induced hyperadrenoreactivity.
Conclusion. Treatment with plant origin substances with estrogen-like activity can be a perspective approach to the correction of endothelial function and decrease in cardiovascular risk in menopause women.
Keywords: endothelial dysfunction, phytoestrogens, ovariectomy, nitric oxide, menopause.
Rational Pharmacother. Card. 2008;2:85-88
Взаимосвязи между менопаузой и развитием сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) посвящено много исследований, большинство из которых свидетельствует об увеличении риска этих заболеваний после менопаузы [1-5]. На частоту возникновения ССЗ и их осложнений в постменопаузе существенно влияет и гормональная заместительная терапия [6-8]. Связанное с менопаузой снижение гормональной активности индуцирует нарушения липидного спектра - рост концентрации общего холестерина (ХС), холестерина ли-попротеидов низкой плотности (ХС ЛПНП) и триглицеридов, которые повышают риск развития ССЗ [5,9]. Наряду с изменениями липидного профиля в период
менопаузы наблюдается увеличение массы тела с развитием преимущественного абдоминального ожирения, снижением чувствительности тканей к инсулину, нарушением метаболизма глюкозы [5, 10-12]. Метаболические изменения в период менопаузы сопровождаются и нарушением продукции ряда вазоактивных соединений эндотелиальными клетками сосудистой стенки: снижается продукция вазодилататоров (про-стациклин, оксид азота) и повышается синтез вазоконстрикторов, митогенов (эндотелин-1, ангиотензин II) и провоспалительных цитокинов, снижается эндо-телий-зависимая вазодилатация (ЭЗВД) [13-16]. В результате нарушается физиологическая регуляция
сосудистого тонуса, что приводит к повышению артериального давления (АД).
В последние годы возрос интерес к стероидным гли-козидам как возможным средствам коррекции метаболических нарушений у женщин в постменопаузе. С одной стороны, эти соединения используют для синтеза гормональных препаратов в фармацевтической промышленности, с другой - изучают как вещества, обладающие широким спектром биологического действия на живые организмы. У этих соединений была обнаружена способность тормозить рост некоторых форм злокачественных образований; снижать уровень ХС в крови и стимулировать овуляторные процессы у животных, а также противогрибковая, антибактериальная и противовирусная активности [17-19].
В институте физиологии растений РАН выведен уникальный штамм - сверхпродуцент клеток растения Диоскореи дельтовидной ф^согеа deltoidea), далее называемый ДМ-05. Уникальной особенностью этого штамма является полное отсутствие спиростаноловых гликозидов, обладающих выраженными иммуноде-прессивными и цитотоксическими эффектами, а в суспензионной культуре продуцируются только фуро-станоловые гликозиды, обладающие поливалентной биологической активностью при минимальной токсичности.
Цель настоящего исследования - экспериментальное изучение влияния фуростаноловых гликозидов растения Dioscorea deltoidea (ДМ-05) на функциональную активность сосудистого эндотелия в условиях моделирования гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс.
Материал и методы
В эксперимент включили 10 самок крыс Wistar массой 200-300 г Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977 г), а также принципам Хельсинкской декларации (2000 г). С целью моделирования гипоэ-строгении у крыс основной группы под анестезией эта-миналом натрия (50 мг/кг) проводили билатеральную овариэктомию [20]. Затем в течение 6 нед животным ежедневно однократно вводили внутрибрюшинно препарат ДМ-05 в дозе 1 мг/кг в объеме 0,1 мл на 100 г массы животного. Животных контрольной группы (п=10) подвергли ложной операции без удаления яичников.
Измерение АД в сонной артерии проводили под наркозом (этаминал натрия 50 мг/кг). С помощью датчика и компьютерной программы «В^ЬюП» непрерывно регистрировали систолическое (САД) и диастолическое (ДАД) АД и частоту сердечных сокращений (ЧСС).
Помимо измерения АД, проводили ряд функциональных тестов: тест на эндотелий-зависимую вазо-дилатацию (ЭЗВД) при внутривенном введении раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кгиз расчета 0,1 мл на 100 г [21], а также тест на эндотелий-независимую вазодилатацию (ЭНВД) при внутривенном введении раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г [22]. Внутривенное введение АХ в течение 3-5с приводило к резкому падению АД. Площадь над кривой рассматривали как сосудистый компонент реакции на АХ и использовали для дальнейших расчетов. ЭНВД оценивали по тому же принципу с той лишь разницей, что вместо АХ вводили донатор оксида азота - нитропруссид.
Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных и ее коррекцию оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД), представляющему собой отношение площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над кривой восстановления АД в ответ на введение АХ, т. е. фактически отношение ЭНВД к ЭЗВД [23, 24].
Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных, находящихся на управляемом дыхании, катетеризировали полость левого желудочка и проводили нагрузочные пробы:
1. Проба на адренореактивность (одномоментное внутривенное введение раствора адреналина гидрохлорида 1.10-5моль/л, из расчёта 0,1 мл на 100 г) [23]. При проведении данной пробы проводилась оценка максимального подъема давления в левом желудочке (ЛЖД).
2. Нагрузка сопротивлением (пережатие восходящей аорты на 30 с) [23]. После проведения данной пробы рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва, выраженный в проценте прироста АД на 25-й с пережатия аорты по отношению к приросту АД на 5-й с пережатия аорты, т.е АД (25 с)/АД (5 с)*100.
Концентрацию конечных стабильных метаболитов оксида азота (сумма нитрат- и нитрит-ионов, NOx) в сыворотке крови крыс измеряли методом Грисса в нашей модификации [25] после депротеинезации сыворотки двукратным объемом этанола с последующим восстановлением нитрата в нитрит хлоридом ванадия ^С13). Оптическую плотность регистрировали при 540 нм. Всех животных в течение эксперимента выдерживали на специальной безнитритной диете [24-26].
Концентрацию эндотелина-1 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью наборов фирмы Вюи^са согласно инструкции производителя.
Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартное отклонение (М±о). Различия считали до-
Таблица 1. Влияние 6-недельного применения препарата ДМ-05 на показатели артериального давления у крыс
Основная группа Контроль
Исходно Через 6 нед
САД, мм рт. ст. Базальный уровень 160,0 ± 6,2 144,5±5,9Ь 128,1 ±6,0
ЭЗВД с АХ 91,8 ±8,0 68,1 ±2,5Ь 83,9 ±4,8
ЭНВД с НП 87,4 ±7,5а 90,0±4,3 91,0 ±4,6
ДАД, мм рт.ст. Базальный уровень 124,9 ±5,5 114,9±5,4 95,7±4
ЭЗВД с АХ 57,3 ±7,1а 41,9±2,7Ь 41,9 ±2,2
ЭНВД с НП 57,8± 6,6а 62,5±4,8 48,5 ±2,9
Примечание (к табл. 1 - 3):3 р<0,05 по сравнению с контрольной группой; р<0,05 по сравнению с основной группой до лечения
стоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
До начала применения препарата у животных с моделированной эндотелиальной дисфункцией показатели АД как исходно, так и на фоне фармакологических проб были выше, чем в контрольной группе. Введение таким животным в течение 6 недель препарата ДМ-05 сопровождалось достоверным снижением показателей АД как исходно (САД), так и на фоне пробы с АХ (САД и ДАД) (табл. 1).
У животных основной группы ЭЗВД до применения ДМ-05 была достоверно ниже, чем у крыс контрольной группы (1022,5±13 1 против 1 673,6+132,4 отн. ед., р<0,05). Напротив, показатель ЭНВД у животных с моделированной эндотелиальной дисфункцией оказался выше, чем в контрольной группе: (2157,3±1 67 против 1338,1 ±1 21,1 отн. ед., р<0,05).
Степень эндотелиальной дисфункции оценивали по коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД). У крыс с моделированной эндотелиальной дисфункцией до введения ДМ-05 КЭД был существенно выше, чем в контроле (2,1 ±0,2 против 0,8±0,11; р<0,05) (табл. 2). В результате 6-недельного курса инъекций препарата ДМ-05 величина КЭД достоверно снизилась (до 1,2±0,1), практически достигнув величины этого показателя в контрольной группе.
Концентрация конечных стабильных метаболитов оксида азота до введения ДМ-05 была ниже в группе животных с моделированной эндотелиальной дисфункцией (30,46+7,2 и 53,21 ±9,6 мкМ, соответственно). При этом концентрация эндотелина-1 (известного вазоконстриктора и митогена [27]) у крыс с ова-риэктомией достоверно не отличалась оттаковой у контрольных животных. После введения ДМ-05 наблюдали восстановление концентрации NOx у крыс основной
группы, которая даже превышала уровень, наблюдаемый в группе контрольных животных (см. табл. 2).
Введение ДМ-05 предотвращало повышение адре-нореактивности, связанное с гипоэстроген-индуци-рованной эндотелиальной дисфункцией (табл. 3). В табл. 3 представлены также результаты пробы на нагрузку сопротивлением. Показатель миокардиального резерва на 25-й с пробы у животных основной группы был ниже, чем у животных контрольной группы (67,9+4,4 и 89,3+4,2%, соответственно). В результате введения ДМ-05 в дозе 1 мг/кг показатель миокардиального резерва достоверно возрос до 79,3+3,8% (р<0,05).
Фитоэстрогены представляют собой биологически активные соединения растительного происхождения, включающие изофлавоноиды, куместаноиды и лигнаны. Выступая в роли как агонистов, так и антагонистов селективных эстрогеновых рецепторов, фитоэстрогены модулируют их активность [28]. В литературе описаны и кардиотропные эффекты стероидных гормонов [28, 29]. Так, эстрогены оказывают значительное влияние на сократительную функцию сердца; экспериментально показано, что 17-р-эстрадиол существенно ослабляет действие адреналина [29].
Изучение механизма действия стероидных глико-зидов позволило предположить, что при адсорбции полярных концов молекул стероидных гликозидов на поверхности мембран эритроцитов под действием а-глю-козидаз происходит гидролиз глюкозидной связи с образованием генинов, способных формировать комплексы с холестерином мембран, что, несомненно, вносит вклад в коррекцию эндотелиальной дисфункции [30]. Известно, что около 60% стероидных гликозидов в пищеварительном тракте животных подвергается гидролизу с образованием свободных сапогенинов, которые препятствуют всасыванию холестерина [31].
Таблица 2. Влияние 6-недельного применения препарата ДМ-05 на показатели эндотелиальной функции у крыс
Основная группа Исходно Через 6 нед Контроль
NOx, мкМ 30,46±7,2а 68,33±6,8Ь 53,21 ±9,6
Эндотелин-1, фмоль/мл 1,47±0,1 1,79±0,1 1,42±0,08
КЭД, отн.ед 2,1 ±0,2а о" ± од 0,8±0,11
Таблица 3. Влияние 6-недельного применения препарата ДМ-05 на функциональные возможности миокарда при проведении нагрузочных проб на фоне гипоэстроген-индуцированной эндотелиальной дисфункции
Основная группа Контроль
Исходно Через 6 нед
Адренореактивность, ЛЖД мм рт. ст. 244,2+5,1a 212,3 ±4,1 Ь 203,4±9,1
Показатель миокардиального резерва, % 67,9+4,4a 79,3±3,8 Ь 89,3±4,2
Кроме того, фитоэстрогены повышают эндотелийза-висимую (ЭЗВД) и снижаютэндотелийнезависимую ва-зодилатацию (ЭНВД) [25, 26].
Заключение
Препарат ДМ-05, представляющий собой смесь фу-ростаноловых гликозидов из культуры клеток растения Dioscorea deltoidea, предотвращает у крыс развитиеэн-дотелиальной дисфункции, индуцированной сниженным уровнем эстрогенов. Об этом свидетельствует снижение величины АД, показателя КЭД, восстановление нормальной концентрации стабильных метаболитов оксида азота через 6 нед применения препарата. Параллельные исследования на открытом сердце
Литература
1. Miller AM, Wilbur J, Chandler PJ, Sorokin O. Cardiovascular disease risk factors and menopausal status in midlife women from the former Soviet Union. Women Health
2003;38:19-36.
2. Sjoberg L, Kaaja R,TuomilehtoJ. Epidemiology of postmenopausal hypertension. Int J Clin Pract Suppl 2004;139:4-12.
3. CreatsasG, Christodoulakos G, Lambrinoudaki I. Cardiovascular disease: screening andmanagementofthea-symptomatichigh-riskpost-menopausalwoman.Ma-turitas 2005; 52 Suppl 1: S32-S37.
4. Lobo RA. Surgical menopause and cardiovascular risks. Menopause 2007;14(3 Pt 2):562-
5. Rosano GM, Vitale C, Marazzi G, Volterrani M. Menopause and cardiovascular disease: the evidence. Climacteric 2007;10 Suppl 1:19-24.
6. Burt VL. Whelton P., Roccella E. J., etal. Prevalence of hypertension in the US adult population. Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey 1991. Hypertension 1995; 25(3): 303-4.
7. Pradhan AD, Manson JE, Rossouw JE, et al. Inflammatory biomarkers, hormone replacement therapy, and incident coronary heart disease: prospective analysis from the Women's Health Initiative observational study. JAMA 2002; 288:980-7.
8. Shakir YA., Samsioe G., Nyberg P., et al. Do sex hormones influence features of the metabolic syndrome in middle-aged women? A population-based study of Swedish women: the Women's Health in the Lund Area (WHILA) Study. Fertil Steril 2007; 88( 1):163-71.
9. LaRosa JC. Lipids and cardiovascular disease: do the findings and therapy apply equally to men and women? Womens Health Issues 1992; 2:102-11.
10. Вихляева Е.М. Климактерический синдром. В: Жмакина К. Н., редактор. Гинекологическая эндокринология. М.: Медицина; 1989.
11. Барт Б. Я., Бороненков, В. Ф. Беневская Г М. Артериальная гипертония у женщин в постменопаузе: современные возможности медикаментозной терапии в поликлинических условиях. Росс кардиол журн 2001; (5): 69-70.
1 2. Zarate A, Basurto L, Hernandez M. The metabolic syndrome in postmenopausal women. Clinical implications [in Spanish]. Gac Med Mex 2003; 1 39:625-8. 1 3. Быстрова М.М., Бритов А.Н., Горбунов В.М. и др. Заместительная гормональная терапия у женщин с артериальной гипертонией в пери- и постменопаузе: гемодинамические эффекты. Тер арх 2001;73(10): 33-8.
14. Davison S., Davis S.R. New markers for cardiovascular disease risk in women: impact of endogenous estrogen status and exogenous postmenopausal hormone therapy. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88:2470-8.
15. Sowers M.R., Matthews K.A., Jannausch M., etal. Hemostatic factors and estrogen during the menopausal transition. J Clin Endocrinol Metab 2005;90:5942-8.
16. Reimann M., Vafeiadou K., Hall W.L., et al. Evidence for associations between common polymorphisms of estrogen receptor beta gene with homocysteine and nitric oxide. Climacteric 2006; 9:215-223.
выявили предотвращение гипоэстроген-индуциро-ванного повышения адренореактивности. Можно полагать, что указанные эффекты реализуются за счет уменьшения гипоэстроген-индуцированной гиперхо-лестеринемии и предотвращения развития окислительного стресса. Применение веществ растительного происхождения, обладающихэстроген-подобной активностью, может стать перспективным подходом к коррекции эндотелиальной дисфункции и внести определенный вклад в снижение риска развития ССЗ у женщин в период менопаузы без развития осложнений, характерных для заместительной гормональной терапии.
17. Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К., Волернер Ю.С. Химия спиростанолов. М.:
Наука; 1996.
18. Sirtori C.R. Risks and benefits of soy phytoestrogens in cardiovascular diseases, cancer, climacteric symptoms and osteoporosis. Drug Saf 2001; 24:665-82.
19. Cassidy A., Albertazzi P., Lise Nielsen I., et al. Critical review of health effects of soyabean phyto-oestrogens in post-menopausal women. Proc Nutr Soc 2006; 65:76-92.
20. Vico L. Dolleans E., Benhamou C.L., Courteix D. Dose effects of propranolol on cancellous and cortical bone in ovariectomized adult rats. J Pharmacol Exp 2005; 10:110-1.
21. Laursen J. B., Rajagopalan S.,Galis Z., etal. Role of superoxide in angiotensin II-induced but not catecholamine-induced hypertension. Circulation 1997; 95(3):588-93.
22. Галаган М.Е., Широколова А. В., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие оксида азота, продуцируемого из экзо-и эндогенных источников. Вопр мед химии 1991; 37(1): 67-70.
23. Покровский М. В., Качкаров В. И., Покровская Т Г и др. Методические подходы для количественной оценки развития эндотелиальной дисфункции при L-NAME- индуцированной модели дефицита оксида азота в эксперименте. Кубанский научно-медицинский вестник 2006;( 12): 25-9.
24. Гуманова Н.Г, Артюшкова Е.Б., Метельская В.А., и др. Влияние антиоксидантов nQ510 и резвератрола на регуляторную функцию эндотелия у крыс с моделированной артериальной гипертонией. Бюлл эксп биол мед 2007; 143 (6): 619-22.
25. Метельская В. А., Гуманова Н. Г Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови человека. Клин лабор диагн 2005;(6):1 5-18.
26. Granger D.L., Anstey N.M., Miller W.C., etal. Measuring nitric oxide production in human clinical studies. Methods Enzymol 1999;301: 49-61.
27. Fleming I., Busse R. NO: the primary EDRF. J Mol Cell Cardiol 1999; 31(1): 514.
28. OldenhaveA.,JaszmannL.J.,HaspelsA.A.,etal.Impactofclimactericonwell-being, a survey based on 5213 women from 39 to 60 years old. Am J Obstet Gynecol 1993; 168(3 Pt 1): 772-80.
29. van der SchouwYT, de Kleijn M..J, Peeters P.H., Grobbee D.E. Phyto-oestrogens and cardiovascular disease risk. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2000;10:154-67.
30. Lange Y YeJ, SteckTL. Activation of membrane cholesterol by displacement from phospholipids. J Biol Chem. 2005; 280: 36126-31.
31. Petit PR, Sauvaire YD, Hillaire-Buys DM, et al Steroid saponins from fenugreek seeds: extraction, purification, and pharmacological investigation on feeding behavior and plasma cholesterol. Steroids. 1995;60:674-80.
