CC BY
36
УДК 577.115
Усовершенствование способа этерификации жирных кислот для идентификации их с помощью газовой хроматографии
Л.Н. Чижова, к. б. н.
И.Н. Локтева, с.н.с.
В.Ю. Бороденко, асп.
В последние годы изучению жирных кислот уделяется все большее внимание. В результате проводимых исследований все полнее вырисовывается разносторонняя функциональная роль этих важнейших соединений.
От жирнокислотного состава липидов зависит целый ряд процессов, например, транспортные процессы, гормоно-рецепторное взаимодействие, функция фосфолипидообменивающих белков, синаптическя передача, некоторые иммунологические реакции и т.д. Жирные кислоты являются важнейшими компонентами липидов, определяющими их физико-химические свойства и функциональные особенности. В животном организме обнаружено большое разнообразие жирных кислот. В липидах различных органов найдены жирные кислоты с длиной цепи от 12 до 24 углеродных атомов, содержащие четное и нечетное число атомов углерода, с нормальной и разветвленной цепью, насыщенные и ненасыщенные, с различным количеством двойных связей.
Как и полярные «головки» фосфолипидов, жирные кислоты принимают участие в интеграции биологических мембран, обусловливая их структурные и функциональные особенности. Углеводородные цепи жирных кислот участвуют в молекулярной организации биомембран, взаимодействуя при помощи Ван-дер-Ваальсовых сил с другими липидами (например с холестерином) и с гидрофобными областями мембранных белков. Различные биомембраны отличаются друг от друга не только по составу и расположению липидов и белков, но и по составу и организации углеводородных цепей жирных кислот.
Благодаря чрезвычайному разнообразию жирных кислот, возможно
существование множества липидов с широким спектром физико-химических свойств, которые определяют их биологическую роль, метаболизм, участие в биохимических реакциях. Состав жирных кислот - это своеобразная характеристика отдельных липидных классов и индивидуальных липидов.
Разнообразием отличаются жирные кислоты мышц сельскохозяйственных животных. Уровень содержания отдельных из них связан как с продуктивностью животных (живая масса, прирост и др.), так и с качеством мяса, следовательно, они могут служить тестом его биологической и пищевой ценности.
Целью настоящей работы являлась разработка новых и усовершенствование существующих методов выделения и этерификации жирных кислот из мяса сельскохозяйственных животных.
Жирные кислоты являются группой гомологичных соединений, различия в свойствах двух соседних членов этой группы порой выражены настолько слабо, что при помощи большинства хроматографических методов, за исключением газовой хроматографии, разделить их практически невозможно.
Многие соединения в биологических материалах являются по природе нелетучими, и поэтому для их определения с помощью газовой хроматографии должны быть приготовлены их летучие производные. Производные для количественного анализа соединений должны приготавливаться просто и быстро. Они должны быть устойчивы в течение нескольких дней и образовываться при низких температурах, чтобы не произошло разложение чувствительных молекул. Выбор летучих производных и типа колонки для анализа зависит от сложности соединений в исследуемой пробе.
Для газохроматографического анализа обычно используют не свободные жирные кислоты (ЖК), а их метиловые эфиры, так как температура кипения эфиров значительно ниже, чем температура кипения жирных кислот, и потому возможно проводить анализ при более низких температурах.
Существует масса приемов получения метиловых эфиров жирных кислот как по характеру используемых реагентов, так и аппаратурному оформлению.
Нет метода, обладающего только положительными качествами. Все они имеют и положительные и отрицательные стороны, в зависимости от предъявляемых требований.
По методу В. Штоффеля (1959), например, для получения метиловых эфиров используют смесь безводного метанола и соляной кислоты, длительность этерификации 2 часа.
По методу К. Пейскера (1964) применяют смесь метанола, хлороформа и серной кислоты, длительность этерификации 2-3 часа.
По методу В. Моррисона и Л. Смита (1964) метилирование проводят с помощью раствора фтористого бора в метаноле, длительность метилирования 90 минут.
Метод метилирования с использованием BF3 позволяет быстро получать чистые метиловые эфиры жирных кислот. Однако его недостатком является довольно сложная процедура получения метилирующего реактива, при которой приходится работать с ядовитым газом, реактив BF3 в метаноле нельзя хранить более двух месяцев.
В отечественной литературе наиболее часто встречается в качестве метилирующего агента хлористый ацетил в метаноле (Верещагин А.Г., 1964; Byorntorp Р., 1960).
Мы в своей работе ориентировались на доступность реактивов, их экологическую безопасность и сокращение временного фактора. Для этого использовались приспособления для метилирования жирных кислот диазометаном (включает воронку с притертым краном, колбу на 250 мл с боковым ответвлением и сосуд-приемник объемом на 100 мл). Соединение всех частей осуществляется с помощью хорошо притертых шлифов.
Предварительно в колбу помещали гидроокись калия и смесь гидразингидрата и изопропилового спирта. Приемник заполняли этоксиэтаном, через воронку подавали очищенный хлороформ. В результате реакции с содержимым колбы происходит образование диазометана.
3 KOH + NH2-NH2 + CHCl3 = CH3N2 + 3 KCl + 3 H2O
Диазометан через боковой отросток поступает в сосуд с эфиром, и там происходит насыщение эфира диазометаном. Смесь приливают к пробе жирных кислот, метилирование проходило в течение 10-15 минут с изменением цвета смеси и выделением газа.
R-COOH + CH3N2 = R-COOCH3 + N2
По окончании метилирования эфир выпаривали на водяной бане.
Анализ полученных метиловых эфиров кислот проводили в хроматографе «Хром-5» на колонке из нержавеющей стали 2,40±0,6 мм (внутренний диаметр), заполненной 15%-ным полидиэтиленгликольсукцинатом на хромосорбе, силанизированном гексаметилдисилазаном. Величина зерен 60-80 меш. Температура колонки 1850, дозатор 300, газ-носитель гелий, скорость прохождения через колонку 35 мл/мин, детектор пламенно-ионизационный. Скорость воздуха и водорода (для поддержания пламени) соответственно 950 и 55 мл/мин. Чувствительность самописца 10 мВ. Пробу объемом 1-3 мкл вводили шприцем Гамильтона. Анализ проводили в течение 25 минут.
Усовершенствованный нами способ этерификации жирных кислот для их идентификации на хроматографе «Хром-5» экономичен, менее длителен, экологичеки безвреден и более точен по сравнению с другими методами.
Литература
1. Ленинджер, А. Основы биохимии /А. Ленинджер - М.: Мир, 1985.-Т 1-3.
2. Общая органическая химия - М.: Химия, 1986. -Т 11. Липиды, углеводы, макромолекулы, биосинтез /Ред. проф. Н.К. Кочеткова, В.Е. Васьковский в соавт.- М., 2001.
3. Верещагин, А.Г. Биохимия /А.Г. Верещагин, С.В. Скворцов, И.И. Исхаков. -1963.
4. Грин, Н. Биология /Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор //В 3 т. Под ред. Сопера Р. -М.: Мир, 1990.
5. Методические указания по исследованию липидного обмена у сельскохозяйственных животных, выпуск 3 /Под ред. Н.А. Шманенкова. -Боровск, 1973. -С. 92-95.
6. Синяк, К.М. Лабораторное дело /К.М. Синяк, М.Я. Оргель, В.И. Крук. -1976. -№1. -С. 37-41.
7. Bjorntorp, P. Polynsaturated Fatty Acids in Man Aslo, 1960.
8. Лабораторное дело. -М.: Медицина. - 1971. -№2.
9. Митрук, Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине /Б.М. Митрук. -М.: Медицина. -1978 г.
10. Stoffel, W. /W. Stoffel, F. Chu, E.N. Ahrens. -Anal. Chtm 159. -vol. 31. -p.307-318.
11. Peisker, K.V.-J. Amer. Oilchem Soc., 1964. - vol 41. -p 87-88.
12. Morrison, W.R. /W.R. Morrison, L.M. Smith. -J. Lipid Res., 1964. -vol.5. -p.600-608.
