CC BY
16ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2015, том 25, № 4, c. 3-18 ФИЗИКА И ХИМИЯ ПРИБОРОСТРОЕНИЯ
УДК 579.871.08+577.112.385.4.08
© О. В. Мосин, И. Игнатов, В. И. Швец, Г. Тыминский
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭЛЕКТРОННОГО УДАРА В АНАЛИЗЕ ВКЛЮЧЕНИЯ СТАБИЛЬНЫХ ИЗОТОПОВ ДЕЙТЕРИЯ И УГЛЕРОДА-13 В МОЛЕКУЛЫ АМИНОКИСЛОТ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
В работе продемонстрирована возможность использования масс-спектрометрии электронного удара (ЭУ) на приборе MB-80 A ("Hitachi", Япония) с двойным электронным фокусированием для анализа смесей [2H, 13С]аминокислот Z-фенилаланин-продуцирующего штамма Brevibacterium methylicum и Z-лейцин-продуцирующего штамма Methylobacillus flagellatum, а также [2H, 13С]аминокислот суммарных белков биомассы, выделенных при выращивании клеток бактерий на средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов [2Н]метанол, [13С]метанол и 2Н2О. Для масс-спектрометрического анализа уровней включения стабильных изотопов 2H и 13С в молекулы [2H, 3С]аминокислот их многокомпонентные смеси в составе культуральных жидкостей и белковых гидролизатов (гидролиз в 6 М 2НС1 (3 % фенол) и 2 М Ва(ОН)2) модифицировали в N-бензилоксикарбонил-производные: ГН, 13С]аминокислоты и метиловые эфиры N-5-(диметиламино)нафталин-1-сульфонил-производных [2Н, С]аминокислот, — которые разделяли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с октадецилсилановым се-ликагелем Separon SGX С18. Уровни включения 2Н и 1 С в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы варьируются в зависимости от метаболических путей биосинтеза [2Н, 13С]аминокислот и содержания 2Н- и C-меченых субстратов в ростовых средах и различаются для разных аминокислот (от 20.0 атом. % для Z-лейцина / изолейцина и до 97.5 атом. % для Z-аланина).
Кл. сл.: стабильные изотопы, метилотрофные бактерии, изотопно-меченые аминокислоты, ОФ ВЭЖХ, масс-спектрометрия ЭУ
ВВЕДЕНИЕ
Метод изотопного мечения является важным инструментальным этапом в разнообразных биохимических и метаболических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами 2Н, 13С, 15^ 180 [1]. Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекулах БАС методами высокого разрешения, включая ЯМР [2], ИК-спектроскопию [3] и масс-спектрометрию [4]. Развитие инструментальных методов детектирования и анализа стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность биохимических исследований, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. В частности, 2Н- и 13С-меченые аминокислоты применяются для изучения пространственной структуры и конформационных изменений белков, взаимодействия белковых молекул, а также в химических синтезах изотопно-
меченых соединений на их основе [5, 6].
Определяющим фактором в исследованиях с применением [ Н, С]аминокислот, является их доступность. [ Н, С]аминокислоты могут быть получены с использованием химических, ферментативных и микробиологических методов. Химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов дорогостоящих реагентов и меченых субстратов и приводят к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L-энантиомеров, для разделения которых требуются специальные методы [7]. Тонкие химические технологии синтеза [2Н, 13С]аминокислот связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов [8].
Микробиология предлагает альтернативный химическому синтезу метод получения [2Н, 13С]аминокислот, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению стабильных изотопов в молекулы, и к сохранению природной конфигурации синтезируемых [2Н, 13С]соединений. При микробиологическом получении [2Н, 13С]аминокислот используют несколько подходов, один из которых заключается в равномерном обогащении синтези-
руемых соединений стабильными изотопами по всему углеродному скелету молекулы за счет выращивания штаммов продуцентов на селективных средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов [13С]метанол, [2Н]метанол и 2Н2О [9, 10]. Этот подход включает также комплексное использование химических компонентов биомассы, выращенной на [2H, 13С]ростовых субстратах, и последующее выделение целевых 2H-и C-меченых соединений. Другой подход заключается в селективном обогащении аминокислот стабильными изотопами по определенным положениям молекул за счет ассимиляции клеткой изотопно-меченых предшественников, например [1,4-13С]сукцината, [1, 2-13С]ацетата и [1-3С]лактата [11].
Настоящая работа является продолжением исследований, связанных с применением масс-спектрометрии электронного удара (ЭУ) в анализе уровней включения стабильных изотопов 2Н и 13С в сложные многокомпонентные смеси [2Н, 13С]аминокислот, полученные микробиологически за счет утилизации клетками микроорганизмов низкомолекулярных меченых^ субстратов — [ Н]метанола, [ С]метанола и Н2О. Чувствительность масс-спектрометрии ЭУ составляет 10-9— 1011 моль, что существенно выше, чем при использовании ИК- и ЯМР-спектроскопии. Данный метод в сочетании с обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ ВЭЖХ) показал большие перспективы в исследовании уровней изотопного обогащения молекул [2Н, С]аминокислот в составе их многокомпонентных смесей, каковыми являются образцы культураль-ных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот и гидролизаты суммарных белков биомасс, полученные с минимальных ростовых сред, содержащих изотопно-меченые субстраты.
ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ
Для синтеза производных [2H, 13С]аминокислот использовали N-5 -(диметиламино)нафтален-1 -сульфонил хлорид (Dns-хлорид) ("Sigma Aldrich", США), бензилоксикарбонилхлорид ("Sigma Aldrich", США) и диазометан, получаемый из N-нитрозометилмочевины ("Sigma Aldrich", США). Для приготовления ростовых сред использовали 2Н2О (99.9 атом. % 2Н), 2НС1 (95.6 атом. % 2Н), [2Н]метанол (98.5 атом. % 2Н) и [13С]метанол (99.5 атом. % С), полученные из Российского научно-технического центра "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия). Неорганические соли предварительно перекристаллизовывали в 2Н2О, 2H2O дистиллировали над KMnO4 с последующим контролем изотопной чистоты Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250
("Brucker Daltonics", ФРГ) (рабочая частота 70 МГц, внутренний стандарт Me4Si), химические сдвиги протонов (S, ppm) измерены в миллионных долях по отношению к Ме4Si.
Разделение смеси метиловых эфиров N-Dns-[2H, 13С]аминокислот из культуральной жидкости и белковых гидролизатов проводили методом ОФ ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Knauer Smartline ("Knauer", Германия), снабженном УФ-детектором UF-2563 и интегратором С-R 3A ("Shimadzu", Япония) при t = 20-(±25) °С, используя колонку размерами 250 х 10 мм с неподвижной обращенной фазой Separon SGX С18, 7 мкм ("Kova", Словакия). Подвижная фаза: (А) — аце-тонитрил—трифторуксусная кислота = 100 : (0.10.5) об. % и (Б) — ацетонитрил = 100 об. % в условиях градиентного элюирования. Объем пробы — 50-100 мкл; скорость элюирования — 1.5 мл/мин. Выход индивидуальных метиловых эфиров N-Dns-[2Н, 13С]аминокислот — 75-89 %; хроматографи-ческая чистота — 95-98 %.
Ионообменную хроматографию белковых гид-ролизатов [2H, 13С]аминокислот осуществляли на приборе Biotronic LC 5001 ("Eppendorf-Nethleler-Hinz", Германия) с использованием колонки Biotronic resin BIC 2710; t = 20-(±25) °С; размеры колонки — 3.2 х 230 мм. Неподвижная фаза — сульфированная стирольная смола UR-30 ("Beckman Spinco", США); подвижная фаза — 0.2 М Na-цитратный буфер. Рабочее давление — 50-60 атм; скорость подачи Na-цитратного буфера — 18.5, нингидрина — 9.25 мл/ч; детекция при X = 570 нм и X = 440 нм (для пролина).
Масс-спектры ЭУ производных [2H, 13С]амино-кислот регистрировали на приборе MB-80 A ("Hitachi", Япония) с двойным электронным фокусированием при ионизирующем напряжении 70 эВ, ускоряющем напряжении 8 кВ и температуре катодного источника 180-200 °С. Сканирование анализируемых образцов проводили при разрешении 7500 усл. ед., используя 10 %-ю резкость изображения.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Штаммы-продуценты [2Н, 13С]аминокислот
Исследования проводили с генетически маркированными штаммами бактерий, полученными из коллекции культур Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов:
1) Brevibacterium methylicum ВКПМ В 5652 — Z-лейцин-зависимый штамм факультативных ме-
тилотрофных бактерий, продуцент L-фенилала-нина;
2) МеЛу1оЬасШш flageПaШm КТ — L-изо-лейцин-зависимый штамм облигатных метило-трофных бактерий, продуцент L-лейцина;
Условия выращивания бактерий и выделения 2Н, 13С-меченых белков и аминокислот
Выращивание метилотрофных бактерий В. те^уНсит и М. flagellatum осуществляли в минеральной среде М9 в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с наполнением средой 50 мл по методике [12], используя в качестве источников стабильных изотопов [2Н]метанол, [13С]метанол и 2Н20 в присутствии L-лейцина для В. те^уНсит и L-изолейцина для М. flagettaШm в концентрациях 10 мг/л. Клетки отделяли центрифугированием на центрифуге Т-24 ("Heraues Sepatech", Германия) (10 000 g, 20 мин). В культуральной жидкости анализировали секретируемые аминокислоты. Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10 000 g, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 40 кГц (3^15 мин) и центрифугировали. Полученный осадок (10 мг) после отделения липидов и пигментов смесью органических растворителей хлороформ— метанол—ацетон (2 : 1 : 1) использовали в качестве фракции суммарных белков биомассы. Липиды и пигменты экстрагировали смесью хлороформ— метанол—ацетон (2 : 1 : 1) по методу Блайя и Дай-ера [13]. Гидролиз белка проводили с помощью 6 М 2НС1 (3 % фенол в 2Н2О) или 2 М Ва(ОН)2 (110 °С, 24 ч).
Синтез N-Dns-[2H, 13^аминокислот
Для синтеза ^0ш-[2И, 13С]аминокислот к 4-5 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости и белковых гидролизатов в 1 мл 2 М NaHCO3, рН = 9-10, порциями при перемешивании добавляли 25.5 мг дансилхлорида в 2 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали 1 ч при перемешивании при t = 40 °С, затем подкисляли 2 М НС1 до рН = 3.0 и экстрагировали этилацетатом (3x5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН = 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
Синтез метиловых эфиров N-Dns-[2H, ^^аминокислот
К 20 мл 40 % КОН в 40 мл диэтилового эфира добавляли 3.0 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане со льдом в течение 15-20 мин. После окончания интенсивного
газовыделения из реакционной смеси диазометана эфирный слой отделяли, промывали ледяной водой до рН = 7.0, сушили безводным сульфатом натрия и использовали для обработки препаратов N-[ H, 13С]дансиламинокислот в составе культуральной жидкости или гидролизатов суммарных белков биомассы.
Синтез N-Cbz-[2H, 13C] аминокислот
Для синтеза N-Cbz-[2H, 13С]аминокислот к 1.5 мл охлажденного до 0 °С раствора культуральной жидкости (50 мг) или белковых гидролизатов (4-5 мг) в 4 М NaOH добавляли порциями при перемешивании 2 мл 4 М NaOH и 28.5 мг бензилоксикарбо-нилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при 0 °С, перемешивали ~3 ч, подкисляли 2 М HCl до рН = 3.0 и экстрагировали этилацетатом (3x5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до рН = 7.0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выделение [2Н, ^ аминокислот из культуральных жидкостей и белковых гидролизатов
Объектами исследования служили полученные в результате мутагенеза L-фенилаланин-про-дуцирующий штамм факультативных метило-трофных бактерий Brevibacterium те^уНсит, ассимилирующий метанол по рибулозо-5-монофосфатному циклу ассимиляции углерода, и L-лейцин-продуцирующий штамм облигатных ме-тилотрофных бактерий Ме^уЬЬасШш flagellatum, реализующий 2-кето-3-дезокси-глюконат-альдолаз-ный вариант рибулозо-5-монофосфатного цикла ассимиляции углерода. Для компенсации ауксо-трофности по L-лейцину и L-изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде. Уровни накопления L-фенилаланина и L-лейцина в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов достигали величины 0.8 и 1.0 г/л соответственно [14, 15]. Включение дейтерия в молекулы секретируемых аминокислот и суммарных белков биомассы осуществляли за счет выращивания штамма В. те^уИсит на минеральных средах М9 с 2Н2О и обычным метанолом, т. к. уровень включения 2Н в молекулы аминокислоты за счет ассимиляции [2Н]метанола незначителен.
Поскольку в клетке происходит ассимиляция водорода (дейтерия) из Н20/2Н20 сред, мы подбирали условия включения дейтерия в молекулы аминокислот и белков при ступенчатом возрастании концентрации 2Н20 в ростовых средах, как показано в табл. 1. Рост микроорганизмов
Табл. 1. Влияние изотопного состава среды на рост штаммов В. теЛуНсит и М. flagellatum
Номер опыта Среда выращивания* Величина лаг-фазы, ч Выход биомассы, % от контроля Время генерации, ч
1 0 24.0 100 2.2
2 24.5 32.1 90.6 2.4
3 49.0 40.5 70.1 3.0
4 73.5 45.8 56.4 3.5
5 98.0 60.5 32.9 4.4
6 СН3ОН 0 100 1.1
7 13СН3ОН 0.1 72.0 1.0
* Данные опытов 1-5 приведены для В. те^уНсит при выращивании на водных средах М9, содержащих 2 % метанол и указанное количество (об. %) 2Н2О. Данные опытов 6-7 приведены для М. flagellatum при выращивании на водной среде М9, содержащей 1 % метанол (6) или 1 % [13С]метанол.
на 2Н20-содержащих средах характеризуется увеличением продолжительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и снижением выходов микробной биомассы (табл. 1), поэтому было необходимо проводить клеточную адаптацию к 2Н2О.
Метод адаптации штамма факультативных ме-тилотрофных бактерий В. те^уНсит к росту на 2Н2О при сохранении способности к биосинтезу Х-фенилаланина описан в работе [16]. В данной работе были исследованы образцы культуральной жидкости В. те^уИсит и гидролизаты биомассы, полученные в ходе многоступенчатой адаптации бактерий к тяжелой воде на минимальных минеральных средах М9 с различным содержанием 2Н2О (от 24.5 до 98.0 % 2Н2О). Поскольку данный штамм метилотрофных бактерий удалось адаптировать к росту на 2Н2О, исследование уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот представлялось наиболее интересным.
В отличие от выращивания на 2Н2О-среде, где необходимо проводить клеточную адаптацию к дейтерию, при получении [ С]аминокислот за счет ассимиляции 13СН3ОН данный этап не является обязательным, поскольку этот изотопный субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые характеристики метило-трофов (см. табл. 1). Поэтому в случае со штаммом облигатных метилотрофных бактерий М. flagellatum включение изотопа 13С в молекулы аминокислот осуществляли в одну стадию за счет выращивания бактерий на водных средах М9, содержащих 1 % [13С]метанол в качестве источника изотопа углерода-13.
Основные этапы при выделении [2Н, 13С]-аминокислот заключались
- в выращивании соответствующих штаммов-
продуцентов на средах с мечеными субстратами — [2Н]метанолом, [13С]метанолом и 2Н2О;
- отделении культуральных жидкостей (КЖ), содержащих секретируемые аминокислоты от микробной биомассы;
- очистке от липидов;
- разрушении клеток;
- выделении фракции суммарных белков биомассы с последующим их гидролизом, обработкой смесей аминокислот дансилхлоридом, бензилок-сикарбонилхлоридом и диазометаном;
- разделении метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот и N-Cbz-производных аминокислот методом ОФ ВЭЖХ;
- масс-спектрометрии ЭУ полученных производных аминокислот.
2Н- и 13С-меченые аминокислоты выделяли из лиофилизованных культуральных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот В. те^уИсит и М. flagellatum, а также в составе гидролизатов суммарных белков биомассы. При выделении фракции суммарных белков необходимо учитывать наличие в них углеводов, липидов и пигментов. В работе использовали богатые по белку штаммы бактерий со сравнительно небольшим содержанием углеводов в них. Гидролизу в качестве фракции суммарных белков подвергали остаток после исчерпывающего отделения липидов и пигментов экстракцией органическими растворителями (метанол—хлороформ—ацетон). В редких случаях для полного отделения от сопутствующих клеточных компонентов прибегали к высаливанию их сульфатом аммония.
Гидролиз 2Н-меченых белков проводили в условиях предотвращения реакций изотопного обмена водорода на дейтерий в ходе гидролиза и сохра-
нения остатков ароматических [2Н]аминокислот в белке. Рассмотрены два альтернативных варианта проведения гидролиза — кислотный и щелочной. Кислотный гидролиз белка в стандартных условиях (6 М HCl, 24 ч, 110 °С) приводит к полному разрушению триптофана и частичному разрушению серина, треонина и некоторых других аминокислот [17]. Другим существенным недостатком при проведении гидролиза в HCl является изотопный (:Н—2Н) обмен ароматических протонов (дейтеронов) в молекулах триптофана, тирозина и гистидина, а также протонов (дейтеронов) при атоме С3 аспарагиновой и С4 глутаминовой кислот [18]. Поэтому, чтобы получить реальные данные о биосинтетическом включении дейтерия в молекулы аминокислот необходимо проводить гидролиз белка с использованием дейтерирован-ных реагентов (6 М 2НС1 с 3 % фенолом (в 2Н20)).
Другой вариант гидролиза белка заключался в использовании 2 М Ba(OH)2 (110 °C, 24 ч). В этих условиях гидролиза белка реакций изотопного обмена водорода на дейтерий в ароматических [2И]аминокислотах — тирозине и триптофане — не происходит, а триптофан не разрушается. Оба метода гидролиза показали хорошие результаты по сохранению ароматических [2И]амино-кислот в гидролизатах белка и содержанию дейтерия в молекулах [2И]аминокислот. Для препаративного получения ^-меченых аминокислот из белка микроорганизмов целесообразнее использовать гидролиз с использованием 2НС1 в 2Н2О (в присутствии добавки фенола для сохранения ароматических аминокислот), позволяющего избежать рацемизации.
Для получения летучих производных [2H, 13С]аминокислоты переводили в метиловые
эфиры ^0^-[2Н, 13С]аминокислот или в N-Cbz-[2Н, 13С]аминокислоты, которые затем разделяли методами ОФ ВЭЖХ. Условия ^дериватизации [2Н, 13С]аминокислот отрабатывали таким образом, чтобы получить в масс-спектрах ЭУ как можно более интенсивные пики их молекулярных ионов (М+) на уровне фона метаболитов среды. Для этого проводили реакцию Ламинирования [2Н, 13С]аминокислот (в составе лиофилизованных культуральных жидкостей и гидролизатов суммарных белков биомассы) пятикратным избытком дансилхлорида (в ацетоне) или бензилоксикарбо-нилхлорида.
В условиях реакции Ламинирования для лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цис-теина наряду с монопроизводными образовывались N-ди-0ns- и N-ди-Cbz-производные. Кроме этого, из аргинина синтезировался ^три-О^-(Cbz)-аргинин. Поэтому в масс-спектрометрических исследованиях молекулярные ионы (М) этих соединений соответствовали ди- или три-произ-водным.
Эффективность использования N-Cbz- и N-0ns-производных аминокислот в ОФ ВЭЖХ и в масс-спектрометрических исследованиях была показана нами ранее [19]. Летучесть ^производных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе может быть повышена за счет дополнительной эте-рификации по карбоксильной группе, поэтому ^0^-[2Н, 13С]аминокислоты были переведены в их метиловые эфиры. Для предотвращения обратного изотопного обмена ароматических протонов (дейтеронов) при этерификации 2Н-меченых аминокислот в данной работе отдали предпочтение использованию диазометана. Свежеприготовленным раствором диазометана в диэтиловом
Табл. 2. Результаты одноступенчатого градиентного разделения смеси метиловых эфиров ^0ш-[2Н]аминокислот из белкового гидролизата методом ОФ ВЭЖХ на колонке 250*10 мм, t = 20-(+25) °С, с октадецилсилановым селикагелем 8ераши SGX С18, 7 мкм ("Kova", Словакия)
Номер обработки Компоненты подвижной фазы, об.% Время элюирования, мин
А* Б**
1 90 10 10
2 80 20 10
3 60 40 10
5 50 50 10
6 30 60 5
8 20 80 5
9 10 90 5
10 0 100 5
* А: ацетонитрил—трифторуксусная кислота 100 : (0.1-0.5) об. %; ** Б: ацетонитрил 100 об. %.
эфире обрабатывали сухие остатки смесей аминокислот. При этерификации аминокислот диазоме-таном происходило дополнительное ^метилирование по а-ЫН-(Эш)-группе [^аминокислот, что приводило к появлению в масс-спектрах метиловых эфиров №Эш-аминокислот дополнительных пиков, соответствующих соединениям, с молекулярной массой на 14 массовых единиц больших исходных.
Исследование уровней включения изотопов 2Н и 13С в молекулы секретируемых аминокислот и белковых гидролизатов
Уровни включения изотопов 2Н и 13С в молекулы аминокислот мультикомпонентных смесей в составе культуральных жидкостей и белковых гидролизатов определяли аналитически методом масс-спектрометрии ЭУ. Метиловые эфиры №Эш-[2Н, 13С]производных аминокислот или N-Cbz-[2H, 13С]производные аминокислот разделяли методом ОФ ВЭЖХ на колонке с октадецилси-лановом селикагелем Separon SGX С18, 7 мкм. Наилучшее разделение достигалось при градиентном элюировании метиловых эфиров N-0^-[2Н, 13С]производных аминокислот смесью растворителей (А): ацетонитрил—трифторуксусная кислота = 100 : (0.1-0.5) об. % и (Б): ацетонитрил = 100 об. % в условиях градиентного элюиро-вания за счет постепенного увеличения концентрации компонента Б в смеси от 0 до 100 % (см. табл. 2). В этом случае каждый из компонентов смеси разделяется при наиболее оптимальном составе элюента, отчего достигается их полное и качественное разделение за гораздо меньшее время, чем при изократическом режиме. Кроме того, при использовании градиента существенно увеличивается максимальное количество пиков, способных разместиться на хроматограмме, — пиковая емкость, что весьма немаловажно при разделении сложных многокомпонентных смесей, каковыми являются белковые гидролизаты. Таким способом удалось разделить триптофан и трудно разрешимую пару фенилаланин / тирозин. Степени хрома-тографической чистоты [2Н, 3С]аминокислот, выделенных из культуральных жидкостей В. Ме^уЫсыт, и М. Flagellatum, и гидролизатов белков в виде N-Cbz-[2H, 13С]производных их аминокислот, составили 96-98 % при выходах 67-89 %. Для отдельных [2Н, 13С]аминокислот оказалось более удобным разделение в виде метиловых эфиров №Эш-[2Н, 13С]производных аминокислот. При этом степень хроматографической чистоты полученных из гидролизатов суммарных белков биомассы метиловых эфиров №Эш-[2Н]фенилаланина, №Эш-[2Н]тирозина и №Эш-[2Н]триптофана со-
а то 234 А 353 1 В 381
О II
-so2- -NH—СН- II ЬС- -ОСН3
(CH3)2NmQ> | сн2 1 91
б Ш 234 KJ А 319 В 347
f-y -so2- -NH—СН-| О II г-С" -ОСН3
(CH3)2NH^ сн2
СН3 СН3
Рис. 1. Фрагментации метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина c Мг = 412 (а) и N-Dns-лейцина с Мг = 378 (б) при масс-спектрометрии электронного удара
ставили 96, 97 и 98 % соответственно. Данный результат важен потому, что именно метиловые эфиры N-Dns-аминокислот вследствие своей химической стабильности, наличия высокоинтенсивных молекулярных ионов (М+) при высоких молекулярных массах оказались весьма удобными для масс-спектрометрических исследований и позволяют идентифицировать [2H, 13С]аминокислоты в присутствии низкомолекулярных метаболитов среды и других продуктов аминирования и кар-боксиметилирования аминокислот. Последний факт очень важен для изучения состава пула [ H, 13С]аминокислот, секретируемых в культу-ральные жидкости (КЖ) штаммов-продуцентов.
Пути фрагментации метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина при масс-спектрометрии ЭУ приводят к формированию пиков их молекулярных ионов (М+) при m/z = 412 и m/z = 378 и к образованию дансильных фрагментов и продуктов их дальнейшего распада до N-ди-метиламинонафталина, а также к образованию аминных А+ и аминоацильных фрагментов В+ (рис. 1). Показанная на рис. 1 фрагментация метиловых эфиров N-Dns-фенилаланина и N-Dns-лейцина характерна для этих производных всех других аминокислот, что позволяет проводить масс-спектрометрический мониторинг [2H, 13С]аминокислот в составе культуральных жидкостей штаммов-продуцентов, содержащих сумму аминокислот и других метаболитов среды, до стадии их хроматографического разделения, а также
исследовать включение стабильных изотопов 2Н и 13С в молекулы аминокислот белковых гидроли-затов.
При использовании в качестве источников стабильных изотопов [13С]метанола и 2Н2О в клетке синтезируются изотопно-замещенные [13C, 2Н]аминокислоты, различающиеся количеством атомов, замещенных на 13С и 2Н. При этом чем выше молекулярная масса аминокислот, тем возможен больший набор молекулярных ионов (M+), соответствующих изотопно-замещенным формам. Пики при m/z = 323.2, 337.4, 368.5, 382.3, 420.5 в масс-спектре [13С]аминокислот обработанной культуральной жидкости M. flagellatum, полученной с водной средой и c 1 % [13С]метанолом (рис. 2, б), соответствуют по массе метиловым эфирам N-Dns-^^глицина, N-Dns-^^аланина, N-Dns-[13С]валина, N-Dns-[13C]лейцина / [13С]изолейцина и N-Dns-[13C]фенилаланина. Следует подчеркнуть,
что величина m/z для молекулярного иона (M+) метиловых эфиров N-Dns-[13C]лейцина и [13С]изо-лейцина в масс-спектрах электронного удара одинакова, поэтому данным методом нельзя точно идентифицировать эти аминокислоты. Максимальные уровни включения 13С в молекулы аминокислот, измеренные по увеличению усредненного значения соотношения массы к заряду m/z для молекулярного иона (М+) изотопно-меченого образца в сравнении с молекулярной массой природной аминокислоты варьируют от 35 % для [13С]аланина до 95 % для [1 С]фенилаланина (рис. 2). Учитывая ауксотрофность штамма по L-изо-лейцину, разброс значений может быть объяснен вкладом экзогенного изолейцина в уровень изотопного включения [13С]лейцина, а также других метаболически связанных с ним аминокислот — [13С]аланина и [13С]валина.
Phe
40 с4
МП
f«4 § 1 U 1 м 3
400
m/z
Рис. 2. Масс-спектры ЭУ метиловых эфиров №Бш-[13С]аминокислот из культуральной жидкости М. flagellatum после обработки дансилхлоридом и диазометаном. а — 1 % метанол и Н2О (контроль); б — 1 % [13С]метанол и Н2О. Символами аминокислот обозначены пики молекулярных ионов [М]+ метиловых эфиров ^Бш-[13С]аминокислот. Интенсивность пиков приведена в %
а
Схема
1J6
сэнв
91 107
220
сн^о ; сс—nh—сн->- соон
сн 1 г
205 f -СООН
_J 250
158" 175"
-НС00Н -C0QH
112 13о
I, % 100-
50
112 L,
L.
Iii , lll(.
150
I, % 100-
176
134
116 Iii
UIÖj
. \ | Ii
IIA
150
265 M
m/z
169 M
? i У4 1 ...., .Ii. р.. , i, 4 >.
ZW ! = '! m/z
Рис. 3. Масс-спектры ЭУ N-Cbz-[13C]-Leu, выделенного из культуральной жидкости М. flagellatum после обработки бензилоксикарбонилхлоридом. а — 1 % метанол и Н2О (контроль); б — 1 % [13С]метанол и Н2О. Схема — углеродный скелет молекулы
а
б
Данные масс-спектрометрии ЭУ по уровням включения 13С и 2Н в молекулы N-Cbz-[2H, 13С]производных аминокислот в пределах различных концентраций 2Н2О не отличались от таковых для метиловых эфиров N-Dns-[2H, 13С]производных аминокислот (точность определения уровней изотопного включения в молекулы аминокислот данным методом составляет ±5 %). В качестве примера на рис 3, б, изображен масс-спектр N-Cbz-[13C]-Leu (относительно немеченого N-Cbz-Leu, (рис. 3, а), выделенного методом ОФ ВЭЖХ из КЖ M. fla-gellatum после обработки бензилоксикарбонилхлоридом. Пик молекулярного иона N-Cbz-[13C]-Leu соответствует среднему значению (M) при m/z = 269 (относительно (M ) при m/z = 265 в контрольных условиях), что свидетельствует о включении 4 атомов изотопа 13С в молекулу лейцина (рис. 3, схема). Специфическая фрагментация N-бензилоксикарбонильного производного [13С]лейцина при электронном ударе позволяет локализовать сайты включения атомов изотопа 13С по углеродному скелету молекулы. Как видно из рис. 3, таковыми являются 4 атома углерода в положениях [2, 3, 4, 5] углеродного скелета молекулы лейцина.
Для штамма факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum наблюдалось специфиче-
ское возрастание уровней изотопного включения дейтерия в молекулы индивидуальных [2Н]аминокислот культуральных жидкостей (табл. 3) при ступенчатом увеличении концентраций 2Н20 в ростовой среде. Уровни включения дейтерия в молекулы разных [2Н]аминокислот при одинаковых условиях культивирования различаются. При этом во всех опытах наблюдалось пропорциональное возрастание уровней изотопного включения 2H в молекулы метаболически родственных [2Н]аминокислот при ступенчатом увеличении концентраций тяжелой воды в ростовых средах (табл. 3). Такой результат зафиксирован во всех экспериментах, где источником стабильных изотопов является Н2О.
Из масс-спектра ЭУ метиловых эфиров N-Dns-[2Н]производных аминокислот культуральной жидкости B. methylicum, полученной со среды, содержащей 49 % Н2О (рис. 4, б), видно, что молекула фенилаланина содержит 6 изотопно-замещеных форм со средним значением пика молекулярного иона (M+) при m/z = 414.2, которое возрастает по сравнению с контрольными условиями (m/z = 412.0, рис. 4, а) на 2.2 единицы, т. е. 27.5 атом. % от общего количества атомов водорода в молекуле замещены на дейтерий. Область масс-спектра со значениями m/z = 90-300
Табл. 3. Уровни включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот (атом. %), секретируемых в культуральную жидкость (КЖ) В. Ые^уНсит, и Ы. flageUatum, и в аминокислотные остатки белков
Содержание 2Н2О в среде, %* 1%
Аминокислоты 24.5 49.0 73.5 98.0 13СН3ОН**
КЖ Белок КЖ Белок КЖ Белок КЖ Белок КЖ Белок
Глицин - 15.0 - 35.0 - 50.0 - 90.0 60.0 90.0
Аланин 24.5 20.0 50.0 45.0 50.0 62.5 55.0 97.5 35.0 95.0
Валин 20.0 15.0 50.0 46.0 50.0 50.0 55.8 50.0 50.0 50.0
Лейцин / изолей-цин 20.0 15.0 50.0 42.0 50.0 50.0 50.0 50.0 40.0 49.0
Фенилаланин 15.0 24.5 27.5 37.5 51.2 50.0 75.0 95.0 95.0 80.5
Тирозин - 20.0 - 25.6 - 68.5 - 92.8 - 53.5
Серин - 15.0 - 36.7 - 47.6 - 86.6 - 73.3
Аспарагиновая кислота - 20.0 - 36.7 - 60.0 - 66.6 - 33.3
Глутаминовая кислота - 20.0 - 40.0 - 53.4 - 70.0 - 40.0
Лизин - 10.0 - 35.3 - 40.0 - 58.9 - 54.4
* Приведены данные по включению 2Н в молекулы аминокислот В. те^уНсит при выращивании на водных средах М9, содержащих 2 % метанол и указанное количество (об.%) 2Н2О.
* Данные по включению 13С приведены для Ы. flagellatum при выращивании на водной среде М9, содержащей 1 % [13С]метанол.
Рис. 4. Масс-спектр ЭУ метиловых эфи-ров ^Бш-[2Н]аминокислот из КЖ В. те^уНсит после обработки дансил-хлоридом и диазометаном. а — 2 % метанол и 98.0 % Н2О (контроль); б — 2 % [2Н]метанол и 49.0 % 2Н2О
соответствует продуктам дериватизации метаболитов ростовой среды. Пик с m/z = 431.0, зафиксированный в масс-спектре ЭУ культуральной жидкости и проявляющийся во всех опытах, соответствует продукту дополнительного метилирования фенилаланина по a-NH-(Dns)- группе. Пик с m/z = 400 (рис. 4, б) отвечает продукту отщепления метильной группы от дейтерированного производного [2Н]фенилаланина.
Присутствие в масс-спектре ЭУ (рис. 5) образца культуральной жидкости B. methylicum, полученной на среде с 73.5 % 2Н2О, пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-^Щфенил-аланина (М+) при m/z = 416.1 указывает на увеличение молекулярной массы [ Н]фенилаланина на 4.1 единицы, т. е. 51.2 % атомов водорода в молекуле [2Н]фенилаланина замещены на дейтерий. Очевидно, что вышеобозначенные атомы дейтерия включились в молекулу [2Н]фенилаланина за счет
процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы. К легко обмениваемым относятся протоны (дейтероны) при гетероатомах в NH2- и СООН-группах аминокислот, которые замещаются за счет легкости диссоциации в Н2О (2Н2О).
Из табл. 3 видно, что в условиях ауксотрофно-сти по Z-лейцину уровни включения Н в молекулы [2Н]лейцина / [2Н]изолейцина ниже, чем для фенилаланина. Отмеченная особенность отчетливее всего проявляется на среде с максимальной концентрацией 2Н2О. Еще раз этот результат подтвердил рис. 6, где показан масс-спектр ЭУ метиловых эфиров N-Dns-^Н] аминокислот культуральной жидкости после выращивания бактерий B. methylicum в указанных условиях. Видно, что величина пика молекулярного иона метилового эфира N-Dns-^Щфенилаланиа (М+) при m/z = = 418.0 увеличивается по сравнению с контрольными условиями на 6 единиц, что соответствует
Рис. 5. Масс-спектр ЭУ метиловых эфиров N-Dns-[2Н]аминокислот из КЖ B. methylicum при выращивании
в среде, содержащей нол и 73.5 % 2Н2О
2 % [2Н]мета-
Рис. 6. Масс-спектр ЭУ метиловых эфиров ^Бш-[2Н]аминокислот из КЖ B. methylicum при выращивании в среде, содержащей 2 % [2Н]мета-нол и 98.0 % 2Н2О (максимально дейтерированная среда)
замещению 75.0 атом. % от общего количества атомов водорода в молекуле. В отличие от [2Н]фе-нилаланина ^уровень включения дейтерия в [2Н]лейцин / [2Н]изолейцин составил 50.0 атом. %, а в [2Н]валин — 58.8 атом. %. Пик при m/z = 432, зафиксированный в масс-спектре ЭУ метиловых эфиров N-Dns-^Щаминокислот КЖ на рис. 6 соответствует продукту дополнительного метилирования [2Н]фенилаланина по a-N^-группе. Кроме этого, в масс-спектре фиксируется пик обогащенного дейтерием бензильного С6Н5СН2-фрагмента молекулы [ Н]фенилаланина при m/z = 97 (вместо m/z = 91 в контроле), что указывает на то, что местами локализации 6 атомов дейтерия в молекуле [2Н]фенилаланина являются положения С1-С6 ароматических протонов в бензильном С6Н5СН2-фрагменте. Из масс-спектрометрических данных следует, что при других концентрациях 2Н2О
дейтерий также включается в ароматическое кольцо [2Н]фенилаланина, т. к. метаболизм адаптированного к 2Н2О штамма B. methylicum не претерпевает существенных изменений в 2Н2О.
Аналогичная закономерность в уровнях включения 13С в молекулы аминокислот, связанных с ауксотрофным метаболизмом, проявляется при выращивании L-изолейцин-зависимого штамма M. flagellatum на среде с 1 % [13С]метанолом. Как видно из табл. 3, в отличие от наблюдаемого для [13С]фенилаланина (уровень изотопного включения 95.0 %) уровни включения изотопа 13С в молекулы [13С]лейцина / изолейцина, [13С]аланина и [1 С]валина составили 38.0, 35.0, 50.0 % соответственно. Уровень изотопного включения для [13С]глицина (60 %), хотя и выше, чем для трех последних аминокислот, но намного ниже, чем для [13С]фенилаланина.
б
Рис. 7. Масс-спектр ЭУ метиловых эфиров N-Dns-^Щаминокислот из гидролизатов суммарных белков биомассы B. methylicum при выращивании в среде M9, содержащей
% метанол
и 2 % [ Н]метанол
и Н2О (контроль) (а) нол и 98.0 % 2Н2О (б)
а
Суммируя полученные данные по уровням способе введения метки были продемонстрирова-
включения Ни С в молекулы секретируемых ны на примере масс-спектрометрического анализа
аминокислот, можно сделать вывод о сохранении сложных многокомпонентных смесей, полученных
минорных путей метаболизма, связанных с био- после гидролиза суммарных белков биомассы ме-
синтезом лейцина и метаболически родственных тилотрофных бактерий B. methylicum. Как видно
с ним аминокислот de novo. Другим логическим из рис. 7, до десяти аминокислот могут быть иден-
объяснением наблюдаемого эффекта, если принять тифицированы в масс-спектре ЭУ гидролизата
во внимание происхождение лейцина и изолейци- белка B. methylicum по пикам молекулярных ионов
на по различным путям биосинтеза (лейцин при- (М+) метиловых эфиров их N-Dns-[2Н]производных
надлежит к семейству пирувата, а изолейцин — аминокислот.
к семейству аспартата), может быть ассимиляция Как и в случае с секретируемыми аминокисло-
клеткой немеченого лейцина из среды на фоне тами, пики молекулярных ионов (М) соответство-
биосинтеза изотопно-меченого изолейцина вали смесям изотопно-замещеных форм производ-
de novo. Учитывая вышесказанное, следует под- ных аминокислот. Для лизина и тирозина пики
черкнуть, что использование ауксотрофных форм (М) соответствовали метиловым эфирам ди-
микроорганизмов для получения изотопно-мече- производных аминокислот — а, е-ди^^-лизину
ных аминокислот не оправдывает себя практиче- ((М+) при m/z = 631.0) и О^-ди^^-тирозину
ски из-за множественного включения изотопов ((М+) при m/z = 663.9). Уровни изотопного вклю-
в молекулы [20]. Напротив, использование для чения дейтерия в молекулы [2Н]аминокислот гид-
этих целей прототрофных форм микроорганизмов ролизата суммарных белков биомассы при содер-
кажется более перспективным. жании 2Н20 в ростовой среде 49.0 % варьируют от
Общие принципы изучения уровней изотопного 25.6 % для [2Н]тирозина до 45.0 % для [ Н]аланина
включения в молекулы аминокислот при данном (рис. 8, б, и табл. 3). В молекулах [2Н]глицина,
Рис. 8. Ионообменная хроматография аминокислот из гидролизатов про-тонированных (а) и дейтерированных (б) клеток B. methylicum на максимально дейтерированной среде. Прибор Biotronic LC-5001 (230x3.2 мм) ("Eppendorf-Nethleler-Hinz", Germany). Подвижная фаза: сульфонированная стирольная смола UR-30 ("Beckman-Spinco", USA). Диаметр гранул — 25 мкм; рабочее давление 50-60 атм; подвижная фаза — 0.2 M Na-цитратный буфер (pH = 2.5); скорость подачи элю-ента — 18.5, нингидрина — 9.25 мл/ч; детекция при X = 570 и X = = 440 нм (для пролина)
[2Н]валина, [2Н]фенилаланина, [2Н]серина, [2Н]лизина, [2Н]аспарагиновой и [2Н]глутаминовой кислот они находятся в пределах 35-46 %. Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, при повышении концентрации 2Н2О в ростовой среде наблюдалось пропорциональное повышение уровней включения 2Н в молекулы аминокислот. Что касается других [2Н]аминокислот, не детектируемых данным методом, очевидно, что уровни изотопного включения в них приблизительно такие же. Это подтверждается данными по разделению белковых гидролизатов метилотрофных бактерий методом ОФ ВЭЖХ в виде ^СЬ2-[2Н]производных аминокислот и метиловых эфиров N-0^-[2Н]производных аминокислот и ионообменной хроматографией исходных белковых гидролиза-тов, где детектируется уже 15 аминокислот (рис. 8, табл. 4).
Полученные данные свидетельствуют о возможности достижения максимальных уровней включения стабильных изотопов 2Н и 13С в аминокислотные остатки суммарных белков биомассы (за исключением аланина, валина и лейцина / изолейцина, сниженные уровни включения для которых объясняются эффектом ауксотрофно-сти по ¿-лейцину и по Х-изолейцину). Например, в случае с дейтерированными аминокислотами полного замещения на стабильные изотопы удалось достичь за счет использования в качестве источника дейтерия 98.0 % 2Н2О (табл. 4). Как видно из табл. 4, при выращивании В. тв^уИсит на среде с 98.0 % 2Н2О уровни включения 2Н в остатки глицина, аланина, фенилаланина и тирозина составляют 90.0, 97.5, 95.0 и 92.8 %. В экспериментах
Табл. 4. Аминокислотный состав белкового гидролизата суммарных белков биомассы В. твЛуНсит, полученный при росте в максимально дейтерированной среде, и уровни дейтерированности молекул
Аминокислота Выход, % от сухого веса 1 г биомассы Количество включенных атомов дейтерия в углеродный скелет молекулы Уровень дейтерированности молекул, % от общего количества атомов водорода
протонирован-ный образец (контроль) образец, полученный в 98.0% 2Н2О
Глицин 8.03 9.69 2 90.0
Аланин 12.95 13.98 4 97.5
Валин 3.54 3.74 4 50.0
Лейцин 8.62 7.33 5 50.0
Изолейцин 4.14 3.64 5 50.0
Фенилаланин 3.88 3.94 8 95.0
Тирозин 1.56 1.83 7 92.8
Серин 4.18 4.90 3 86.6
Треонин 4.81 5.51 - -
Метионин 4.94 2.25 - -
Аспарагин 7.88 9.59 2 66.6
Глутаминовая ки- 11.68 10.38 4 70.0
слота
Лизин 4.34 3.98 5 58.9
Аргинин 4.63 5.28 - -
Гистидин 3.43 3.73 - -
* Данные получены на среде М9 с 98.0 % 2Н20 и 2 % [2Н]метанолом.
При подсчете уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при СООН- и КН2-группах молекул аминокислот не учитывались из-за легкости их диссоциации и изотопного обмена в Н20 / 2Н20.
*** Прочерк означает отсутствие данных.
по включению изотопа 13С в суммарные белки биомассы за счет ассимиляции [ С]метанола ме-тилотрофными бактериями М. flagellatum также наблюдались высокие уровни изотопного включения в [13С]глицине (90.0 %), [13С]аланине (95.0 %) и [13С]фенилаланине (80.5 %) (табл. 3). Как и в случае с секретируемыми аминокислотами, сниженные уровни включения стабильных изотопов в [13С]лейцине / изолейцине (49.0 %), а также в метаболически связанных с ним [13С]аминокислотах в этих условиях могут быть объяснены эффектом ауксотрофности штамма по Х-изолейцину, который добавляли в ростовую среду в протонирован-ном виде.
Во всех экспериментах по включению стабильных изотопов в молекулы аминокислот уровни включения 2Н и 13С в метаболически связанные аминокислоты обнаружили коррелляцию. Так, уровни изотопного включения для аланина, валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот, синтезируемых из шикимовой кислоты) коррелируют. В то же время уровни изотопного включения для аланина, валина и лейцина / изо-лейцина сохраняют стабильность в пределах широкого разброса концентраций 2Н2О вследствие эффекта ауксотрофности по лейцину. Уровни изотопного включения для глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имеют близкие величины и находятся в корреляции. Уровни изотопного включения секретируемых аминокислот и соответствующих аминокислотных остатков суммарного белка при выращивании бактерий на средах с одинаковым изотопным составом, в целом, также коррелируют. Причина некоторых наблюдаемых расхождений в уровнях включения изотопов в молекулы аминокислот может быть связана с эффектом ауксотрофности штаммов по определенным аминокислотам.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные исследования продемонстрировали эффективность метода масс-спектрометрии ЭУ на примере N-Cbz- и N-Dns-производных [2Н, 13С]аминокислот с различными уровнями изотопного обогащения, полученных микробиологическим синтезом, для исследования уровней изотопного обогащения молекул [2Н, 13С]аминокислот в составе их многокомпонентных смесей, полученных микробиологически с использованием клеток микроорганизмов. Метод удобен для изучения состава пула аминокислот, секретируемых в культуральные жидкости штаммов-продуцентов и гидролизатов белков биомассы, выращенной на средах со стабильными изотопами 2Н и 13С,
и может найти применение в метаболических и биомедицинских исследованиях.
Работа выполнялась при финансовой поддержке Научно-исследовательского центра медицинской биофизики (Болгария), грант № 115-RU.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Мосин О.В. Изучение методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных стабильными изотопами 2H и 13C с высокими степенями изотопного обогащения. Автореф. дис. ... канд. хим. наук. М.: МГАТХТ им. М.В. Ломоносова, 1996. 25 с.
2. LeMaster D.M. Uniform and selective deuteration in two-dimensional NMR studies of proteins // Annu. Rev. Bio-phys. Chem. 1990. Vol. 19, no. 2. P. 243-266. doi: 10.1146/annurev.bb.19.060190.001331.
3. MacCarthy P. Infrared spectroscopy of deuterated compounds: an undergraduate experiment // J. Chem. Educ. 1986. Vol. 62, no. 7. P. 633-638. doi: 10.1021/ed062p633.
4. Мосин О.В., Складнее Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов // Биоорганическая химия. 1996. Т. 22, № 10-11. С. 856-869.
5. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Методы получения аминокислот и белков, меченных стабильными изотопами 2H, 13C, 15n, 1 O // Биотехнология. 1996, № 10. С. 24-40.
6. Мосин О.В., Швец В.И., Складнев Д.А., Игнатов И. Биосинтез фотопреобразующего трансмембранного белка [2Н]бактериородопсина, меченного дейтерием по остаткам ароматических аминокислот [2,3,4,5,6-2H5]Phe, [3,5-2H2]Tyr и [2,4,5,6,7-2H5]Trp // Научное приборостроение. 2013. Т. 23, № 2. С. 14-26.
7. Matthews H.R., Kathleen S., Matthews K., Stanley J. Selective deuterated amino acid analogues. Synthesis, incorporation into proteins and NMR properties // Biochim. et Biophys. Acta. 1977. Vol. 497. P. 1-13. doi: 10.1016/0304-4165(77)90134-9.
8. LeMaster D.M., Cronan J.E. Biosynthetic production of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment // Journal of Biological Chemistry. 1982. Vol. 257, no. 3. P. 1224-1230.
9. Mosin O.V., Ignatov I. Microbiological synthesis of 2H-labeled phenylalanine, alanine, valine, and leucine / isoleucine with different degrees of deuterium enrichment by the Gram-positive facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum // International Journal of Biomedicine. 2013. Vol. 3, no. 2. P. 132-138.
10. Мосин О.В., Швец В.И., Складнев Д.А., Игнатов И. Микробный синтез дейтерий-меченного L-фенила-ланина факультативной метилотрофной бактерией Brevibacterium meyhylicum на средах с различными концентрациями тяжелой воды // Биофармацевтический журнал. 2012. Т. 4, № 1. С. 11-22.
11. Patel G.B., Sprott G.D., Ekiel I. Production of specifically labeled compounds by Methanobacterium espanolae
grown on H2-CO2 plus [13C]acetate // Applied and Environmental Microbiology. 1993. Vol. 59, no. 4. P. 1099-1103.
12. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. Microbial synthesis of 2H-labelled L-phenylalanine with different levels of isotopic enrichment by a facultive methylo-trophic bacterium Brevibacterium methylicum with RuMP assimilation of carbon // Biochemistry (Moscow). Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2013. Vol. 7, no. 3. P. 249-260.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method for total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. 1959. Vol. 37, no. 8. P. 911-918. doi: 10.1139/o59-099.
14. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А. и др. Метило-трофные бактерии — источники изотопно-меченых 2Н-и 13С-аминокислот // Биотехнология. 1996. № 5. С. 2534.
15. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S. Biosyn-thetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum // Amino Acids. 1993. Vol. 5, no. 1. P. 125.
16. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum // Bioscience, biotechnology, and biochemistry. 1998. Vol. 62, no. 2. P. 225-229. doi: 10.1271/bbb.62.225.
17. Cohen J.S., Putter I. The isolation of deuterated amino acids // Biochim. Biophys. Acta. 1970. Vol. 222. P. 515-520. doi: 10.1016/0304-4165(70)90143-1.
18. Penke B., Ferenczi R., Kovacs K. A new acid hydrolysis method for determining tryptophan in peptides and proteins // Analytical Biochemistry. 1974. Vol. 60, no. 1. P. 45-50. doi: 10.1016/0003-2697(74)90129-8.
19. Егорова Т.А., Мосин О.В., Еремин С.В., Карнаухо-
ва Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. Разделение аминокислот белковых гидролизатов природных объектом методом ВЭЖХ в виде карбобензоксипроизводных // Биотехнология. 1993. № 8. С. 21-25.
20. Мосин О.В., Игнатов И. Биологическое воздействие дейтерия на клетки прокариот и эукариот // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. Т. 2, № 7. С. 122-131.
Московский государственный университет прикладной биотехнологии, Москва (Мосин О.В.)
Научно-исследовательский центр медицинской биофизики, София, Болгария (Игнатов И.)
Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова, Москва (Швец В.И.)
Европейское научное общество, Европейская академия естественных наук, Ганновер, Германия
(Тыминский Г.)
Контакты: Мосин Олег Викторович, mosin-oleg@yandex.ru
Материал поступил в редакцию: 13.08.2015
ISSN 0868-5886
NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2015, Vol. 25, No. 4, pp. 3-18
ELECTRON IMPACT MASS SPECTROMETRY IN ANALYSIS OF INTRODUCTION OF STABLE ISOTOPES OF DEUTERIUM AND CARBON-13 INTO AMINO ACID MOLECULES FROM BIOLOGICAL OBJECTS
O. V. Mosin1, I. Ignatov2, V. I. Shvets3, G. Tyminski4
1 Moscow State University of Applied Biotechnology, Russia
2The Scientific Research Center of Medical Biophysics, Sofia, Bulgaria
33Moscow State University of Fine Chemical Technology named after M. V. Lomonosov, Russia 4European Scientific Society, European Academy of Natural Sciences, Hannover, Germany
The work demonstrates the possibility of using electron impact mass spectrometry (EI) on a MB-80A ("Hitachi", Japan) with a double electron focusing for analysis of [2H, 13C]amino acid mixtures of ¿-phenylalanine producing strain of Brevibacterium methylicum and L-leucine-producing strain of Methylobacillus flagellatum, and [2H, 3C]amino acids of the total biomass protein isolated while growing the bacterial cells on media containing as a source of stable isotopes [2H]methanol, [13C] methanol and 2H2O. For mass-spectrometric analysis of the level of incorporation of stable isotopes 2H and 13C into the molecules of [2H, 13C]amino acids the multi-componential mixtures of [2H, 13C]amino acids, derived from cultural media and protein hydrolysates after hydrolysis in 6 M 2HCl (3 % phenol) and 2 M Ba(OH)2 were modified into N-benzyloxycarbonyl-derivatives of [2H, 13C]amino acids as well as into the methyl esters of N-dansyl-derivatives of [2H, 13C]amino acids, which were separated by RP HPLC on a column with octadecylsilane gel Separon SGX C18. The levels of 2H and 13C enrichment of secreted amino acids and amino acid residues of protein were found to be varied depending on the metabolic pathways of biosynthesis and concentration of 2H- and 13C-labelled substrates in growth media from 20.0 atom % to L-leucine/isoleucine up to 97.5 atom % for L-alanine.
Keywords: stable isotopes, methylotrophic bacteria, isotope labeled amino acids, RP HCLP, EI mass spectrometry
REFERENСES
1. Mosin O.V. Izuchenie metodov biotechnologicheskogo polucheniya belkov, aminokislot i nukleozidov, mechen-nych stabil'nymi izotopami i C s vysokimi stepenyami izotopnogo obogascheniya. Avtoref. dis. kand. chim. nauk. [Studying of methods of biotechnological preparation of proteins, amino acids and nucleosides, labeled with stable isotopes 2H and 13C with high levels of isotopic enrichment. Doct. Diss. Autoref.]. Moscow, M.V. Lomonosov MGATChT Publ., 1996. 25 p. (In Russ.).
2. LeMaster D.M. Uniform and selective deuteration in two-dimensional NMR studies of proteins. Annu. Rev. Bio-phys. Chem, 1990, vol. 19, no. 2, pp. 243-266. doi: 10.1146/annurev.bb.19.060190.001331.
3. MacCarthy P. Infrared spectroscopy of deuterated compounds: an undergraduate experiment. J. Chem. Educ., 1986, vol. 62, no. 7, pp. 633-638. doi: 10.1021/ed062p633.
4. Mosin O.V., Skladnev D.A., Egorova T.A., Shvets V.I. [Mass and spectrometer assessment of level of inclusion 2H and 13C
in molecules of amino acids of bacterial objects]. Bioorganicheskaya chimiya [Bioorganic chemistry], 1996, vol. 22, no. 10-11, pp. 856-869. (In Russ.).
5. Mosin O.V., Skladnev D.A., Egorova T.A., Shvets V.I. [Methods of receiving amino acids and proteins, marked
stable isotopes H, C, 15N, 1 O]. Biotechnologiya [Biotechnology], 1996, no. 10. pp. 24-40. (In Russ.).
6. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. [Biosynthesis of transmembrane photo-transforming protein [2H]bacteriorhodopsin, labelled with deuterium on residues of aromatic amino acids [2,3,4,5,6-2H5]Phe, [3,5-2H2]Tyr, [2,4,5,6,7-2h5]Trp]. Nauchnoe Priborostroenie [Science Instrumentation], 2013, vol. 23, no. 2. pp. 14-26. (In Russ.).
7. Matthews H.R., Kathleen S., Matthews K., Stanley J. Selective deuterated amino acid analogues. Synthesis, incorporation into proteins and NMR properties. Biochim. et Biophys. Acta, 1977, vol. 497, pp. 1-13. doi: 10.1016/0304-4165(77)90134-9.
8. LeMaster D.M., Cronan J.E. Biosynthetic production of 13C-labeled amino acids with site-specific enrichment. Journal of Biological Chemistry, 1982, vol. 257, no. 3, pp. 1224-1230.
9. Mosin O.V., Ignatov I. Microbiological synthesis of 2H-labeled phenylalanine, alanine, valine, and leucine / isoleucine with different degrees of deuterium enrichment by the gram-positive facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum. International Journal of Biomedicine, 2013, vol. 3, no. 2, pp. 132-138.
10. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. [Mi-crobic synthesis a deuterium of marked L-phenylalanine a facultative metilotrofny bacterium of Brevibacterium meyhylicum on Wednesdays with various concentration
of heavy water]. Biofarmazevticheskiy zhurnal [Biophar-maceutical journal], 2012, vol. 4, no. 1, pp. 11-22. (In Russ.).
11. Patel G.B., Sprott G.D., Ekiel I. Production of specifically labeled compounds by Methanobacterium espanolae grown on H2-CO2 plus [13C]acetate. Applied and Environmental Microbiology, 1993, vol. 59, no. 4, pp. 10991103.
12. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. Microbial synthesis of 2H-labelled L-phenylalanine with different levels of isotopic enrichment by a facultive methy-lotrophic bacterium Brevibacterium methylicum with RuMP assimilation of carbon. Biochemistry (Moscow), Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2013, vol. 7, no. 3, pp. 249-260.
13. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol, 1959, vol. 37, no. 8, pp. 911-918. doi: 10.1139/o59-099.
14. Skladnev D.A., Mosin O.V., Egorova T.A. et al. [Metilo-trofny bacteria — sources izotopno marked 2H- and 13C-amino acids]. Biotechnologiya [Biotechnology], 1996, no. 5, pp. 25-34. (In Russ.).
15. Karnaukhova E.N., Mosin O.V., Reshetova O.S. Biosyn-thetic production of stable isotope labeled amino acids using methylotroph Methylobacillus flagellatum. Amino Acids, 1993, vol. 5, no. 1, pp. 125.
Contacts: Mosin Oleg Viktorovich, mosin-oleg@yandex. ru
16. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 1998, vol. 62, no. 2, pp. 225-229.
doi: 10.1271/bbb.62.225.
17. Cohen J.S., Putter I. The isolation of deuterated amino acids. Biochim. Biophys. Acta, 1970, vol. 222, pp. 515-520. doi: 10.1016/0304-4165(70)90143-1.
18. Penke B., Ferenczi R., Kovacs K. A new acid hydrolysis method for determining tryptophan in peptides and proteins. Analytical Biochemistry, 1974, vol. 60, no. 1, pp. 45-50. doi: 10.1016/0003-2697(74)90129-8.
19. Egorova T.A., Mosin O.V., Eremin S.V., Karnauchova E.N., Zvonkova E.N., Shvets V.I. [Division of amino acids of proteinaceous hydrolyzates natural object by VEZhH method in the form of a karbobenzoksa of derivatives]. Biotechnologiya [Biotechnology], 1993, no. 8, pp. 21-25. (In Russ.).
20. Mosin O.V., Ignatov I. [Biological impact of a deuterium on prokariot and eukariot cages]. Razrabotka i registra-ziya lekarstvennych sredstv [Development and registration of medicines], 2014, vol. 2, no. 7, pp. 122-131. (In Russ.).
Article received in edition: 13.08.2015
