CC BY
17ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2016, том 26, № 2, c. 3-16
--ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ^
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ
УДК 543.51: 577.1
© О. В. Мосин, И. Игнатов, В. И. Швец, Г. Тыминский
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С БОМБАРДИРОВКОЙ БЫСТРЫМИ АТОМАМИ В УСТАНОВЛЕНИИ ПУТЕЙ БИОСИНТЕЗА ПУРИНОВОГО РИБОНУКЛЕОЗИДА [2Н]ИНОЗИНА
Продемонстрирована возможность применения масс-спектрометрии с бомбардировкой быстрыми атомами (ББА) на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ ("Fisons VG Analytical", США) для установления путей биосинтеза 2Н-меченого пуринового рибонуклеозида инозина, секретируемого в культуральную жидкость (КЖ) грамположительной хемогетеротрофной бактерией Bacillus subtilis ВКПМ B-3157 при выращивании на тяжеловодородной среде с 2 % гидролизатом дейтерированной биомассы метилотрофной бактерии Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 как источника Н-меченых ростовых субстратов. Выделение [2Н]инозина из КЖ производили адсорбцией/десорбцией смеси рибонуклеозидов на поверхности активированного угля, экстракцией 0.3 М МН4-формиатным буфером (рН = 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80 % этаноле и ионообменной хроматографией на колонке с катионообменной смолой AG50WX 4, уравновешенной 0.3 М МН4-формиатным буфером с 0.045 М NH4Cl. Исследование распределения дейтерия в молекуле биосинтетического [2Н]инозина методом масс-спектрометрии ББА продемонстрировало включение 5 атомов дейтерия в молекулу (общий уровень дейтерированности — 62.5 атом. % 2Н) с включением 3 атомов дейтерия в рибозный фрагмент и 2 атомов дейтерия — в гипоксантиновый фрагмент молекулы. Три не обмениваемые атома дейтерия были включены в рибозный фрагмент молекулы за счет гликолиза по пути Эмбдена—Мейергофа вследствие реакций ферментативной изомеризации глюкозы в 2Н20-среде с участием реакций изотопного (:Н—2Н) обмена, в то время как два других атома дейтерия при С2-, С8-положениях в гипоксантиновом остатке происходили из [2Н]аминокислот дейтерированного метилотрофно-го гидролизата Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662.
Кл. сл.:
2Н
-меченый инозин, биосинтез, тяжелая вода, Bacillus subtilis ВКПМ B-3157, масс-спектрометрия
ББА
ВВЕДЕНИЕ
Природные нуклеозиды, меченные дейтерием (2Н), представляют значительный научно-практический интерес для многочисленных биохимических и диагностических целей [1], структурно-функциональных исследований [2], а также в матричных синтезах молекул дейтерированных РНК для изучения их пространственной структуры и конформационных изменений [3]. Тенденции к их предпочтительному применению обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью использования инструментальных методов масс-спектрометрии для определения локализации дейтериевой метки в молекулах синтезируемых соединений [4]. Как аналитический метод масс-спектрометрия обладает исключительно высокой чувствительностью и позволяет обнаруживать и количественно определять микро и следовые количества органического вещества в больших объемах жидкостей и газов, а также в биологических системах [6]. В случае бомбардировки быстрыми атомами (ББА) быстрые ато-
мы образуются путем предварительной ионизации в разряде атомов благородных газов (Аг, Хе), ускорения образующихся ионов и последующей их нейтрализации при столкновении с незаряженными атомами [6]. Масс-спектрометрию ББА применяют при анализе веществ, которые способны растворяться или диспергироваться в жидкой матрице (глицерин, тиоглицерин, полиэтиленгли-коль, м-нитробензиловый спирт и др.) [7]. Масс-спектры ББА отличаются от масс-спектров химической ионизации тем, что они содержат пики ионов [М + Н]+ или [М - Н]-, но не М+ или М-. Методом ББА можно анализировать молекулы разной природы с молекулярной массой до 10 кДа [8]. Метод ББА особенно удобен при исследовании соединений, содержащих кислотные, основные или ионные группировки. Вместе с тем метод ББА менее чувствителен, чем ионизация электронами и матрично-активированная лазерная десорбция, и малопригоден для количественных определений, но удобен для качественного определения нелетучих веществ без их химической модификации в летучие производные.
Основным препятствием практического использования дейтерированных нуклеозидов в вы-шеобозначенных исследованиях является недостаток 2Н-меченых ростовых субстратов высокого уровня дейтерированности. Прежде всего это связано с ограниченной доступностью и высокой стоимостью высокоочищенного дейтерия, выделяемого из природных источников. Природная распространенность дейтерия составляет 0.015 атом. %, однако, несмотря на невысокое содержание дейтерия в пробах, разработанные в последние годы методы обогащения и очистки позволяют получать 2Н-меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты.
Инозин (1,9-дигидро-9-бета^-рибофуранозил-6Н-пурин-6-ОН) — рибонуклеозид, состоящий из гипоксантина, связанный с остатком рибозы (ри-бофуранозы) посредством в -№-гликозидной связи, обладающий полифункциональным биологическим воздействием на организм. В клетках простейших и эукариот инозин является предшественником АТФ, повышает активность ряда ферментов цикла Кребса, стимулирует синтез нуклеотидов. Как метаболическое средство инозин оказывает антигипоксическое, метаболическое и антиаритмическое действие, а также оказывает положительное влияние на процессы обмена в миокарде, улучшает коронарное кровообращение, предотвращая дистрофические изменения миокарда, вызванные физическими нагрузками, инфекцией или эндокринными заболеваниями
2
Для биосинтеза природных Н-меченых нук-леозидов, в том числе инозина, разработаны подходы с использованием в качестве ростовых субстратов гидролизатов дейтерированной биомассы метилотрофных бактерий, ассимилирующих метанол по рибулозо-5'-монофосфатному (РМФ) и сериновому пути фиксации углерода, интерес к которым возрастает благодаря интенсивному развитию технологии химического синтеза метанола [10, 11]. Уровень ассимиляции биомассы метилотрофных бактерий клетками простейших организмов и эукариот составляет 85-98 %, а их производительность, измеренная по уровню биоконверсии метанола в клеточные компоненты, достигает 50 % [12]. Как было показано нами ранее, метилотрофные бактерии — неприхотливые объекты, растут на минимальных средах с 2-4 % метанолом, в которых другие бактерии не размножаются, и достаточно легко адаптируются к максимальным концентрациям 2Н2О [13]. Однако эксперименты обнаружили бактериостатиче-ский эффект 2Н2О, заключающийся в ингибиро-вании жизненно-важных функций клеток бактериальных штаммов-продуцентов [14]. Поэтому целый ряд практических вопросов биосинтеза
природных дейтерированных нуклеозидов в 2Н2О остается неизученным.
Большой научно-практический интерес к использованию аналитических методов масс-спектрометрии для изучения биосинтетических путей дейтерированных природных соединений определил цель настоящей работы, связанной с изучением принципиальной возможности использования масс-спектрометрии ББА для установления путей биосинтеза 2Н-меченого пурино-вого рибонуклеозида инозина, синтезируемого грамположительной хемогетеротрофной бактерией Bacillus subtilis ВКПМ B-3157.
ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ
Для приготовления ростовых сред использовали 2Н2О (99.9 атом. % 2Н), 2НС1 (95.6 атом. % 2Н) и [2Н]метанол (98.5 атом. % Н), полученные из Российского научно-технического центра "Изотоп" (Санкт-Петербург, Россия). Неорганические соли предварительно перекристаллизовыва-ли в 2Н2О, 2H2O дистиллировали над KMnO4 с последующим контролем изотопной чистоты :Н ЯМР-спектроскопией на приборе Brucker WM-250 ("Brucker Daltonics", Германия) (рабочая частота —70 МГц, внутренний стандарт —Me4Si), химические сдвиги протонов (S, ppm) измерены в миллионных долях по отношению к Ме4Si.
УФ-спектрофотометрию проводили на программируемом спектрофотометре Beckman DU-6 ("Beckman Coulter", США) в диапазоне длин волн 220-280 нм.
Аналитическое определение инозина проводили в пробах культуральной жидкости (КЖ) объемом 10 мкл на хроматографических пластинках (150 х 150 мм) с закрепленным слоем флуоресцентного носителя Silufil UV-254 ("Kavalier", Словакия) с использованием стандартного набора рибонуклеозидов фирмы "Beckman Spinco" (США) в системе растворителей: н-бутанол— уксусная кислота—вода = 2 : 1 : 1 об. %. Элюиро-вание пятен проводили 0.1 н. HCl. УФ-поглощение элюатов определяли спектро-фотометрически при X = 249 нм, используя стандартную калибровочную кривую.
Ионообменную хроматографию осуществляли на приборе Biotronic LC 5001 ("Eppendorf-Nethleler-Hinz", Германия) с использованием колонки Biotronic resin BIC 2710; t = 20-(±25) °С; размеры колонки — 3.2 х 230 мм; неподвижная фаза — сульфированная стирольная смола (7.25 % сшивки полимера) UR-30 ("Beckman Spin-co", США); подвижная фаза — 0.2 М Na-цит-ратный буфер; рабочее давление — 50-60 атм; скорость подачи Na-цитратного буфера —
18.5 мл/ч; нингидрина — 9.25 мл/ч; детекция при X = 570 нм и X = 440 нм (для пролина).
Высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer Smartline ("Knauer", Германия), снабженном УФ-детектором UF-2563 и интегратором С-R 3A ("Shimadzu", Япония) при t = 20-(±25) °С, используя колонку размером 250 х 10 мм с неподвижной фазой Ultrasorb CN, 10 мкм ("Kova", Словакия); подвижная фаза: ацетонит-рил—вода = 75 : 25 об. % в условиях градиентного элюирования; объем пробы — 50-100 мкл; скорость элюирования — 1.5 мл/мин.
Масс-спектрометрию ББА проводили на импульсном масс-спектрометре VG-70 SEQ ("Fisons VG Analytical", США), снабженным цезиевым (Cs) источником на глицериновой матрице с ускоряющим напряжением 8-30 кВ и ионным током 0.6-0.8 мА путем предварительной ионизации образцов в разряде атомов благородного газа (Ar, Xe).
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Штамм-продуцент [2Н]инозина
Объектом исследования являлся полиауксо-трофный по гистидину, тирозину, аденину и ура-цилу (потребность 10 мг/л) штамм спорообразую-щих аэробных грамположительных хемогетеро-трофных бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, продуцент инозина, полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных штаммов микроорганизмов (Москва, Россия). Штамм был предварительно адаптирован к дейтерию рассевом до отдельных колоний на 2 % агаре со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации 2Н2О и последующей селекцией по признаку устойчивости к 2Н2О.
Биосинтез [2Щинозина
[2Н]инозин получен микробиологическим синтезом с выходом 3.9 г/л на синтетической тяжеловодородной (ТВ) среде (89-90 атом. % 2Н), используя в качестве штамма-продуцента штамм хемогетеротрофных бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-3157, а в качестве источника 2Н-меченых ростовых субстратов — гидролизат дей-терированной биомассы метанол-ассимилиру-ющего штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum ВКПМ B-5662 (условия получения: автоклавирование в 0.1 н. 2НС1 ~30-40 мин при 0.8 атм), выделенный селекцией в условиях многостадийной адаптации
на твердой минеральной среде М9 (2 % агар) с 2 % [2Н]метанолом со ступенчато увеличивающимся градиентом концентрации тяжелой воды (от 0 до 98 об. % 2Н2О). Сырую метилотрофную биомассу (выход 200 г с 1 л среды) суспендировали в 100 мл 0.5 н. 2НС1 (в 2Н2О), автоклавировали 30-40 мин при 0.8 атм. Полученную суспензию нейтрализовали 0.2 н. КОН (в 2Н2О) до рН = 7.0, после чего использовали в качестве источника ростовых субстратов при выращивании штамма-продуцента инозина. Для этого посевной материал в количестве 5-6 масс. % переносили в ТВ-среду с 2Н2О (масс. %): глюкоза — 12.0; дейте-рированный гидролизат B. methylicum ВКПМ B-5662 — 2.0; NH4NO3 — 2.0; MgSO^^O — 1.0; СаСО3 — 2.0; аденин — 0.01; урацил — 0.01. В качестве контроля использовали протонирован-ную среду на основе белково-витаминного концентрата (БВК) дрожжей, состав которой аналогичен составу ТВ-среды, за исключением 2 % БВК дрожжей. Культивирование бактерий проводили в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (наполнение средой 100 мл) в течение 3-4 сут при t = +32 °С в условиях интенсивной аэрации реакционной смеси на орбитальном шейкере S-380 ("Biorad Labs", Венгрия). Бактериальный рост контролировали по способности к образованию отдельных колоний на поверхности твердых ага-ризованных (2 % агар) сред, а также по величине оптической плотности (ОП) суспензии клеток, измеренной на спектрофотометре Beckman-DU6 ("Beckman Coulter", США) при X = 540 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Уровень биоконверсии углеродного субстрата определяли глюкозооксидазным методом, как описано в работе [15].
Выделение [2Щинозина
Пробы КЖ центрифугировали на центрифуге Т-24 ("Carl Zeiss", ФРГ) при 2000 g 10 мин, концентрировали при 10 мм рт. ст. в роторном испарителе РВО-6 ("Microtechna", Венгрия) до объема в 2 раза меньше исходного, добавляли ацетон при 0 °С (3 х 5 мл). Смесь выдерживали 14-15 ч при +4 °С, осадок отделяли центрифугированием при t = +4 °С при 1200 g 5 мин. К супернатанту добавляли 10 г активированного угля, выдерживали 1 сут при t = +4 °С. Водную фракцию отделяли фильтрованием, к твердой фазе добавляли 20 мл 50 % этанола в 25 % аммиаке (1 : 1 об. %), кипятили при t = +60 °С с обратным водяным холодильником. Через 2-3 ч смесь фильтровали и упаривали при 10 мм рт. ст. Продукт экстрагировали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН =
Здесь и далее использованы проценты по объему.
= 8.9), промывали ацетоном (2 х 10 мл), сушили безводным СaCl2. Инозин перекристаллизовывали из 80 % этанола ([a]D20 = +1.61°, выход 3.1 г/л (80 %)). Затем образцы наносили на откалибро-ванную колонку (150 х 10 мм) с ручным отбором проб с катионообменной смолой АG50WX 4 ("Pharmacia", США). Колонку уравновешивали 0.3 М NH4-формиатным буфером (рН = 8.9) c 0.045 М NH4Cl и элюировали тем же буфером в условиях изократической элюции (хроматогра-фическая чистота, 92 %). Элюат подвергали лио-фильной сушке и хранили в запаянных ампулах в морозильной камере холодильника при t = -10 °С. Выход: 3.1 г/л (80 %); Тш. = 68-70 °С; [а^0 = = +1.61° (этанол); Rf = 0.5; рК3 = 1.2 (фосфатный буфер, рН = 6.87). УФ-спектр (0.1 н. На): (Xmax = = 249 нм, £249 = 7100 М-1 см1); масс-спектр ББА (жидкая матрица — глицерин, ускоряющее напряжение Cs+ — 8-30 кВ, ионный ток — 0.60.8 мА): [M + H]+ m/z (I, %): 273, 20 % (4 атома 2Н); 274, 38 % (5 атомов 2Н); 275, 28 % (6 атомов 2Н); 276, 14 % (7 атомов 2Н), [А + H]+ 136, 46 %; [В + Н]+ 138, 55 %; [В - НС^+ 111, 49 %; [В -HCN]+ 84, 43 %.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Получение 2Н-меченой биомассы B. methylicum ВКПМ В-3157
В качестве продуцента инозина использовали полиауксотрофный по гистидину, тирозину,
аденину и урацилу штамм грамположительных хемогетеротрофных бактерий Б. subtilis ВКПМ В-3157 (предварительно адаптированный к дейтерию селекцией до отдельных колоний), который из-за нарушения метаболических путей регуляции биосинтеза пуриновых рибонуклеозидов синтезирует в стандартных условиях выращивания (дрожжевая среда, поздний экспоненциальный рост, t = +32 °С) 17-20 г инозина на 1 л КЖ [16]. Максимальный выход инозина достигался при использовании протонированной среды, содержащей в качестве источника углерода и энергии глюкозу (12 масс. %), а в качестве источника ростовых факторов и аминного азота 2 % белково-витаминный концентрат (БВК) дрожжей. При проведении биосинтеза требовалось заменить протонированные ростовые субстраты их дейте-рированными аналогами, а также использовать Н2О высокого уровня изотопной чистоты. Для решения поставленной задачи использовали биомассу адаптированного к дейтерию штамма факультативных метилотрофных бактерий В. тв^у-Нсит ВКПМ В-5662, ассимилирующего метанол по рибулозо-5'-монофосфатному пути фиксации углерода, который благодаря 50 %-му уровню биоконверсии метанола (при эффективности конверсии 15.5-17.3 г сух. биомассы на 1 г потребленного субстрата) и устойчивому росту в минеральной дейтерированной среде М9 оказался очень удобным источником для наработки дейтеро-биомассы, а затраты на биоконверсию
Табл. 1. Условия адаптации, изотопный состав ростовых сред и характеристики бактериального роста
Б. mвthylicum ВКПМ В-5662*
Номер опыта Компоненты среды, об. % Лаг-период, ч Выход микробной биомассы, % от контроля Время генерации, ч
H2O 2H2O метанол [2Щметанол
1 98.0 0 2 0 20.0 100.0 2.2
2 98.0 0 0 2 30.0 92.3 2.4
3 73.5 24.5 2 0 32.1 90.6 2.4
4 73.5 24.5 0 2 34.0 85.9 2.6
5 49.0 49.0 2 0 40.5 70.1 3.0
6 49.0 49.0 0 2 44.1 60.5 3.2
7 24.5 73.5 2 0 45.8 56.4 3.5
8 24.5 73.5 0 2 49.6 47.2 3.8
9 0 98.0 2 0 58.3 32.9 4.4
10 0 98.0 0 2 60.0 30.1 4.9
10' 0 98.0 0 2 40.0 87.0 2.8
* Данные опытов 1-10 приведены для Б. тв^уНсит ВКПМ В-5662 при выращивании в водных средах М9, содержащих 2 % метанол и указанное количество (об. %) 2Н2О. Данные опыта 10' приведены для адаптированной к максимальному содержанию дейтерия бактерии при выращивании в среде, содержащей 2 % [2Н]метанол и 98 % 2Н2О. В качестве контроля использовали опыт 1, где использовали обычную воду и метанол.
определяются в основном стоимостью 2Н2О и [2Н]метанола [17]. Проведение адаптации для В. тв^уИсит ВКПМ В-5662 определялось необходимостью улучшения ростовых характеристик штамма и достижения высокого выхода микробной биомассы в максимально дейтерированной среде. Для этого использовали ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации 2Н2О в ростовых средах М9 (от 24.5 до 98.0 % 2Н2О) в присутствии 2 % метанола и его дейтерирован-ного аналога, т. к. предполагалось, что постепенное привыкание клеток к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на ростовые параметры (табл. 1).
Для изучения влияния уровня дейтерированно-сти источника углерода на ростовые параметры штамма в опытах 1, 3, 5, 7 и 9 использовали про-тонированный метанол, а в опытах 2, 4, 6, 8 и 10 — [2Н]метанол (табл. 1). Замена протониро-ванного метанола его дейтерированным аналогом в условиях одинаковой концентрации 2Н2О в среде приводила к небольшим уменьшениям ростовых характеристик штамма (табл. 1, опыты 2, 4, 6, 8 и 10). Поэтому в дальнейших опытах использовали среды с 2Н2О и [2Н]метанолом. При росте исходного штамма В. тв^уИсит ВКПМ В-5662 на контрольной протонированной среде (рис. 1, (1)) с водой и метанолом продолжительность лаг-периода и времени клеточной генерации составили 20 и 2.2 ч, а выход микробной биомассы 200 г с 1 л КЖ (табл. 1, опыт 1). В промежуточных опытах (2-10) биосинтетические параметры изменялись пропорционально концентрации 2Н2О. Выявленная закономерность заключалась в увеличении продолжительности лаг-периода и
времени клеточной генерации при уменьшении выходов микробной биомассы с фиксированием самых низких значений этих параметров в максимально дейтерированной среде с 98 % 2Н2О и 2 % [2Н]метанолом (табл. 1, опыт 10), где продолжительность лаг-периода и время генерации увеличивались в 3.0 и 2.2 раза по сравнению с контрольными условиями, а выход микробной биомассы уменьшался в 3.1 раза (табл. 1, опыт 1). Улучшить ростовые характеристики штамма в максимально дейтерированной среде позволила адаптация к дейтерию, условия которой показаны в опыте 10' (табл. 1). За ходом адаптации наблюдали, снимая динамики роста (рис. 1) исходного (б) и адаптированного к дейтерию (в) штамма в максимально дейтерированной среде М9, содержащей 98 % 2Н2О и 2 % [2Н]метанол (рис. 1, а, (контроль) получен в протонированной среде), а также по изменению продолжительности лаг-периода, времени генерации и выходов микробной биомассы. В отличие от адаптированного штамма (в) ростовые динамики исходного штамма (б) в максимальной дейтерированной среде ингибировались дейтерием (рис. 1). Выход микробной биомассы у адаптированного штамма (в) уменьшался на 13 % по сравнению с контрольными условиями (рис. 1, а) при увеличении времени генерации до 2.8 ч, а продолжительности лаг-периода до 40 ч (рис. 1, в). В целом улучшенные ростовые характеристики адаптированного мети-лотрофа существенно упрощают схему получения дейтеро-биомассы, оптимальным условием которой является максимально дейтерированная среда М9 с 98 % 2Н2О и 2% [2Н]метанолом (инкубационный период 3-4 сут при t = +32 °С).
Рис. 1. Выход биомассы В. тв^уН-сит ВКПМ В-5662 (1), величина лаг-периода (2) и время генерации (3) в различных экспериментальных условиях.
а — исходный метилотроф в протонированной среде с обычной водой и метанолом; б — исходный метилотроф в максимально дейтериро-ванной среде; в — адаптированный к дейтерию метилотроф на максимально дейтерированной среде
Биосинтез [2Щинозина
Стратегия биосинтеза 2Н-меченого инозина за счет использования в качестве ростовых субстратов биомассы метилотрофных бактерий разрабатывалась с учетом способности метилотрофных бактерий синтезировать большое количество белка (50 % от веса сухого вещества), 15-17 % полисахаридов, 10-12 % липидов (в основном фосфолипиды) и 18 % зольных веществ [18]. Для обеспечения высоких выходов этих соединений и минимизации реакций обратного (:Н—2Н) обмена в аминокислотных остатках гидролиз биомассы проводили автоклавированием в 0.5 н. 2НС1 (в 2Н20). Поскольку штамм В. subtilis ВКПМ В-3157, продуцент инозина, является полиауксо-трофным штаммом, нуждающимся для роста в тирозине и гистидине, исследовали качественный и количественный состав ароматических аминокислот гидролизата метилотрофной биомассы, полученного в максимально дейтериро-ванной среде с 2 % [2Н]метанолом и 98 % Н2О, а также уровни их дейтерированности (табл. 2). Качественный и количественный состав аминокислот метилотрофного гидролизата изучали на катионообменной колонке "Вю^ошс LC-5001" (Германия) с сульфированной смолой UR-30,
а уровни дейтерированности молекул — масс-спектрометрией ЭУ метиловых эфиров N-5-(диметиламино)нафтален-1 -сульфонильных (дан-сильных) производных аминокислот, как описано в работе [19]. Из табл. 2 видно, что гидролизат представлен пятнадцатью идентифицированными аминокислотами (за исключением пролина, который детектировался при X = 440 нм) при содержании тирозина и гистидина в 1 г сухого метило-трофного гидролизата 1.82 и 3.72 %, что удовлетворяет ауксотрофную потребность штамма продуцента в тирозине и гистидине. Содержание других аминокислот в гидролизате также сопоставимо с потребностями штамма-продуцента инозина в источниках углерода и аминного азота (табл. 2). Индикатором, определяющим высокую эффективность включения дейтерия в синтезируемый продукт, служит высокий уровень дейтерирован-ности молекул аминокислот, который варьирует от 49.0 атом. % для лейцина/изолейцина до 97.5 атом. % для аланина (табл. 2). Это позволило использовать гидролизат дейтеро-биомассы метило-трофных бактерий В. те^уИсит ВКПМ В-5662 как источник ростовых субстратов для выращивания штамма В. subtilis ВКПМ В-3157, продуцента инозина.
Табл. 2. Аминокислотный состав гидролизата биомассы В. теЛуНсит ВКПМ В-5662, полученный с максимально дейтерированной среды, и уровни дейтерированности (атом. %) молекул
Аминокислота Выход, % от сухо- Величина молеку- Количество вклю- Уровень дейтерирован-
го веса 1 г биомас- лярного иона про- ченных атомов дей- ности молекул, % от об-
сы изводных амино- терия в углеродный щего количества атомов
кислот [М]+ скелет молекулы водорода
Глицин 9.69 324 2 90.0
Аланин 13.98 340 4 97.5
Валин 3.74 369 4 50.0
Лейцин 7.33 383 5 49.0
Изолейцин 3.64 383 5 49.0
Фенилаланин 3.94 420 8 95.0
Тирозин 1.82 669 7 92.8
Серин 4.90 355 3 86.6
Треонин 5.51 НД*** - —
Метионин 2.25 НД — —
Аспарагин 9.59 396 2 66.6
Глутаминовая
кислота 10.38 411 4 70.0
Лизин 3.98 632 5 58.9
Аргинин 5.27 НД — —
Гистидин 3.72 НД — —
Данные получены масс-спектрометрией ЭУ для метиловых эфиров ^5-(диметиламино)нафтален-1-сульфонил хлоридных производных аминокислот.
При подсчете уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при СООН- и КН2-группах молекул аминокислот не учитывались из-за легкости изотопного ( Н—2Н) обмена. НД — не детектировался.
Рис. 2. Динамики роста В. subtШs ВКПМ В-3157, кл/мл (1, 1'); накопления инозина, г/л (2, 2') и ассимиляции глюкозы, г/л (3, 3') в различных экспериментальных условиях.
1, 2, 3 — протонированная БВК-среда; 1', 2', 3' — ТВ-среда с 2 % гидролизатом дейтерированной биомассы В. те^уНсит ВКПМ В-5662
Табл. 3. Состав внутриклеточных углеводов гидролизата биомассы В. subtШs ВКПМ В-3157 и уровни дейтерированности (атом. %) молекул
Углевод Содержание в биомассе, % от сухого веса 1 г биомассы Уровень дейтерированности молекул, %
протонированный гидро-лизат, полученный в БВК-среде (контроль) гидролизат, полученный в ТВ-среде
Глюкоза 20.01 21.40 80.6
Фруктоза 6.12 6.82 85.5
Рамноза 2.91 3.47 90.3
Арабиноза 3.26 3.69 90.7
Мальтоза 15.30 11.62 —
Сахароза 8.62 НД** -
* Данные получены *Н ЯМР-спектроскопией. НД — не детектировалось.
Ростовые и биосинтетические характеристики штамма продуцента инозина В. зиЪйШ ВКПМ В-3157 изучали в протонированной БВК-среде с обычной водой и в синтетической ТВ-среде с 86 % 2Н2О, 12 % глюкозой и 2 % гидролизатом дейтерированной биомассы В. те^уИсит ВКПМ В-5662 (рис. 2). Во всех опытах отмечена корреляция в характере изменения ростовых динамик (рис. 2, опыты 1, 1'), выхода инозина (рис. 2, опыты 2, 2') и ассимиляции глюкозы (рис. 2, опыты 3, 3'). Максимальный выход инозина (17 г/л) зафиксирован на протонированной БВК-среде (рис. 2, опыт 2) при уровне ассимилируемой глюкозы 10 г/л (рис. 2, опыт 3). На ТВ-среде выход инозина снижался в 4.4 (3.9 г/л) (рис. 2, опыт 2'), а уровень ассимиляции глюкозы в 4 раза, о чем свидетельствует 40 г/л остаточной неассимилируемой глюкозы в КЖ (рис. 2, опыт 3'). Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что при росте
в ТВ-среде глюкоза расходуется менее эффективно, чем в контрольных условиях на протонированной БВК-среде, из-за ингибирования тяжелой водой ферментативных реакций ассимиляции глюкозы клеткой.
Полученный результат требовал изучения содержания глюкозы и других внутриклеточных углеводов в биомассе штамма продуцента B. sub-tilis ВКПМ В-3157, осуществленное методом ВЭЖХ на колонке Ultrasorb CN, 10 мкм с подвижной фазой ацетонитрил—вода = 75 : 25 об. % (табл. 3). Смесь внутриклеточных углеводов гидролизата биомассы в табл. 3 (нумерация приведена по последовательности их элюции с колонки) составляли моно-(глюкоза, фруктоза, рамноза, арабиноза), ди-сахариды (мальтоза, сахароза), а также четыре других неидентифицированных углевода с временами удерживания 3.08 (15.63 %), 4.26 (7.46 %), 7.23 (11.72 %) и 9.14
80 - I
220 230 240 250 260 270 280
Длина волны, нм
Рис. 3. Спектры УФ-поглощения инозина (0.1 н. раствор HCl).
a — исходная КЖ после выращивания штамма-продуцента B. subtilis ВКПМ В-3157 в ТВ-среде; б — природный инозин; в — инозин, выделенный из КЖ штамма-продуцента. I — инозин, II и III — вторичные метаболиты
(7.95 %) мин (не показаны). Как ожидалось, выход глюкозы в дейтерированном гидролизате составляет 21.4 % от сухого веса, т. е. выше, чем фруктозы (6.82 %), рамнозы (3.47 %), арабинозы (3.69 %) и мальтозы (11.62 %) (табл. 3). Их выходы существенно не отличались от контроля в Н2О, за исключением сахарозы, которая не детектируется в дейтерированном гидролизате. Уровни дейтерированности углеводов варьируют от 90.7 атом. % 2Н для арабинозы до 80.6 атом. % 2Н для глюкозы.
Выделение [ Щинозина
Применение комбинации физико-химических методов для выделения биосинтетического [2Н]инозина из КЖ диктовалось необходимостью получать инозин высокой степени хроматографи-ческой чистоты (не менее 95 %). Поскольку в КЖ наряду с синтезируемым продуктом присутствуют примеси неорганических солей, белков и полисахаридов, а также сопутствующие вторичные метаболиты нуклеиновой природы (аденозин, гуанозин) и непрореагировавшие субстраты (глюкоза, аминокислоты), проводилось ступенчатое фракционирование КЖ. Повышенная чувстви-
тельность инозина к кислотам и щелочам и его нестабильность при выделении требовали использования кислотных и щелочных растворов низкой концентрации, а также проводить выделение при низких температурах, избегая длительного перегрева реакционной смеси. Фракционирование КЖ заключалось в низкотемпературном осаждении высокомолекулярных примесей органическими растворителями — ацетоном и метанолом, адсорбции/десорбции на поверхности активированного угля, экстракции продукта, перекристаллизации, ионообменной хроматографии. Белки и полисахариды удаляли низкотемпературным осаждением ацетоном при +4 °С, проводя последующую адсорбцию суммы рибонуклеозидов активированным углем на холоде. Десорбирован-ные рибонуклеозиды извлекали из прореагировавшей твердой фазы элюированием этанольно-аммиачным раствором при +60 °С, а сам инозин — экстракцией 0.3 М МН4-формиатным буфером (рН = 8.9) с последующей перекристаллизацией в 80 % этаноле. Окончательная стадия очистки заключалась в колоночной ионообменной хроматографии на катионообменнике AG50WX 4, уравновешенном 0.3 М КН4-формиатным буфе-ромс 0.045 М N^0 со сбором фракций при Rf = = 0.5. Данные по выделению инозина из КЖ штамма-продуцента В. subtilis ВКПМ В-3157 представлены в виде спектров УФ-поглощения на рис. 3. Наличие в анализируемом образце (в) основной полосы поглощения I, соответствующей природному инозину (Ятах = 249 нм, е249 = = 7100 М-1см-1) и отсутствие вторичных метаболитов II и III доказывает его однородность и, следовательно, эффективность разработанного метода выделения.
Изучение распределения дейтериевой метки в молекуле [2Щинозина
Уровень дейтерированности инозина исследовали методом масс-спектрометрии ББА, который за счет ионизации быстрыми атомами позволяет обнаруживать микро и следовые количества органического вещества в больших объемах жидкостей и в биологических системах без их предварительной химической модификации в летучие производные. Для этого регистрировали масс-спектры ББА дейтерированного и протонирован-ного инозина, по разности величин пиков молекулярных ионов которых проводили расчет уровня дейтерированности молекулы. Формирование пика молекулярного иона инозина при масс-спектрометрии ББА сопровождается миграцией протона Н+ с формированием молекул с [М + Н]+. Биосинтетический 2Н-меченый инозин (масс-спектр ББА приведен на рис. 4, б, относительно
пь
tfä/l н\|_l/н
он он
215
II
III
(CgH904)+ (C5H40N4)+
\ 136 109 82 133 93
136
1зз
185
50
100
200
I
[М + Н]+
269
277
300
m/z
100
50
54
II
III
(C5H4ON4)+ (С5Н904)+ у
138
111
84
93
136
215
185
50
100
200
I
[М + Н]+ 274
1к
I
300
m/z
Рис. 4. Масс спектры ББА инозина (глицериновая матрица) в различных экспериментальных условиях, а — природный инозин; б — [2Н]инозин, выделенный из ТВ-среды. Условия ионизации: цезиевый источник в разряде атомов Аг; ускоряющее напряжение — 8-30 кВ; ионный ток — 0.6-0.8 мА. I — инозин, II — ри-бозный фрагмент, III — гипоксантиновый фрагмент
Табл. 4. Величины пиков [М + Н]+ в масс-спектрах ББА и уровни дейтерированности (атом. %) молекулы инозина
Величина пика [М + Н]+ Вклад в уровень дейтерированности, мол. % Количество атомов дейтерия Уровень дейтерированности, % от общего количества атомов водорода
273 20 4 20.0
274 38 5 62.5
275 28 6 72.5
276 14 7 87.5
* При вычислении уровня дейтерированности протоны (дейтероны) при ОН-гидроксильных группах, а также имидазольные NH-протоны при гетероатомах азота не учитывались из-за легкости изотопного (Н—2Н) обмена в 2Н2О.
контроля (рис. 4, а)) представлял смесь изотопно-замещенных форм молекул с различным количеством атомов водорода, замещенных на дейтерий. Поэтому пики молекулярных ионов инозина [М + Н]+ полиморфно расщеплялись на отдельные кластеры с примесью молекул со статистическим набором массовых чисел m/z с различным вкладом в суммарный уровень дейтерированности молекулы. Его подсчет проводили по вкладу наиболее интенсивного пика молекулярного иона [М + Н]+ (пик с наибольшим вкладом в уровень дейтерированности), зарегистрированного в данных условиях масс-спектрометром. Этим условиям удовлетворял пик I при m/z = 274, 38 % (вместо [М + Н]+ при m/z = 269, 42 % в контрольных условиях (рис. 4, а)), что соответствует включению 5 атомов дейтерия в молекулу инозина (рис. 4, б).
Пик II с m/z = 133, 41 % и пик III с m/z = 136, 49 % соответствуют фрагменту рибозы и гипоксанти-новому фрагменту. Как видно из табл. 4, в пике молекулярного иона инозина [М + Н]+ также фиксировались менее интенсивные пики с примесями молекул с включением четырех (m/z = 273, 20 %), пяти (m/z = 274, 38 %), шести (m/z = 275, 28 %) и семи атомов дейтерия (m/z = 276, 14 %). Это свидетельствует об изотопном полиморфизме при данном инструментальном методе введения в молекулу дейтериевой метки.
С учетом эффекта изотопного полиморфизма суммарный уровень дейтерированности молекулы инозина (УД), вычисленный по нижеприведенной формуле, составил 62.5 атом. % от общего количества атомов водорода в углеродном скелете молекулы:
Рис. 5. Схема фрагментации молекулы инозина методом ББА
УД =
[ MH ] С, +[ Mr 2 ] С2 + ... + [ Mm ] с,
I С„
где Mrn — величины пиков молекулярных ионов инозина; Сп — вклад в уровень дейтерированно-сти, мол. %.
Более точную информацию о распределении дейтерия в молекуле инозина дает фрагментация молекулы методом ББА, показанная на рис. 5. Пути фрагментации молекулы инозина методом ББА приводят к распаду инозина на фрагмент ри-бозы II при массовом соотношении m/z = 133 и гипоксантиновый фрагмент III при m/z = 136 (их распад сопровождается миграцией протона Н+), которые в свою очередь расщепляются на ряд низкомолекулярных осколочных фрагментов (IV— VIII) при m/z = 109, 108, 82, 81 и 54 за счет элиминирования HCN и СО из фрагмента гипоксан-тина (рис. 5). Следовательно, присутствие в масс-спектре ББА инозина "тяжелых" пиков фрагментов рибозы II с m/z = 136, 46 % (вместо m/z = 133, 41 %) и гипоксантина III с m/z = 138, 55 % (вместо m/z = 136, 48 %), а также осколочных пиков низкомолекулярных фрагментов (VII, VIII), продуктов распада гипоксантина при m/z = 111, 49 % (вместо m/z = 109, 45 %) и m/z = 84, 43 % (вместо m/z = 82, 41 %) свидетельствует о включении трех атомов дейтерия в рибозный и двух атомов дейтерия в гипоксантиновый фрагменты молекулы инозина. Селективный характер включения дейтерия в молекулу инозина по определенным положениям молекулы подтвержден присутствием дейтерия в осколочных фрагментах.
При анализе уровня дейтерированности [2Н]инозина учитывался факт, что уровень и характер включения дейтерия в молекулу определя-
ется путями ассимиляции углерода (глюкоза, аминокислоты) данным штаммом хемогетеро-трофных бактерий. Метаболические пути ассимиляции глюкозы хемогетеротрофными бактериями в аэробных условиях определяются в основном гликолизом; анаэробный гликолиз не распространен для этого вида бактерий. Основным источником углерода служила глюкоза, а источником дейтерированных субстратов и аминного азота — гидролизат дейтеро-биомассы метилотрофных бактерий В. те^уИсит ВКПМ В-5662. Поскольку протоны (дейтроны) в положениях рибозного остатка в молекуле инозина могли синтезироваться из глюкозы, характер изотопного включения дейтерия в рибозный остаток молекулы определяется в основном ассимиляцией глюкозы за счет гликолиза по пути Эмбдена—Мейергофа. Поскольку глюкоза в экспериментах использовалась в про-тонированной форме, ее вклад в уровень обогащения дейтерием рибозного остатка пренебрегал-ся. Однако, вопреки этому, наблюдалось включение дейтерия в рибозный фрагмент молекулы инозина за счет ферментативной изомеризации глюкозы и реакций изотопного (!Н—2Н) обмена в процессе изомеризации. Эти обменные процессы также могли приводить к специфическому включению атомов дейтерия по определенным положениям в молекуле инозина. Такими доступными положениями в молекуле инозина являются гидроксильные протоны (ОН-), протоны в С'2, С'3-положениях рибозного остатка, имидазольные протоны при гетероатомах ^Н+) и протоны в N1-положении в гипоксантиновом остатке, которые могут обмениваться на дейтерий в 2Н2О за счет кето-енольной таутомерии. Три не обмениваемые атома дейтерия в рибозном фрагменте молекулы
Рис. 6. Общая схема биосинтеза ИМФ микробной клеткой (адаптировано из [21])
могли синтезироваться за счет ферментативной ассимиляции глюкозы клеткой, в то время как два других атома дейтерия в С2-, С8-положениях ги-поксантинового остатка могли синтезироваться из [2Н]аминокислот — глицина, глутамина и аспар-тата (с участием ^-СНО^Н и N5,N10-CH=FH) (рис. 6), источником которых служил дейтериро-ванный гидролизат метилотрофной бактерии В. т^куЫсит ВКПМ В-5662. Гликозидный протон в положении гликозидной связи в ри-бозном фрагменте мог заместиться на дейтерий в процессе реакции элиминирования СО2 на стадии образования рибулозо-5'-монофосфата из 3-кето-6-фосфоглюконовой кислоты с последующим присоединением протона (дейтерона) по С1-положению рибулозо-5'-монофосфата. В целом
наши исследования подтверждают эту схему [20]. Тем не менее следует отметить, что ауксо-трофность этого мутантного штамма в тирозине, гистидине, аденине и урациле предполагает разветвленные метаболические пути, отличные от тех, которые указаны выше, поскольку известно, что промежуточные продукты гликолиза являются предшественниками ряда соединений, как нук-леотиды и аминокислоты. Уровень изотопного обогащения молекулы инозина определяется степенью изотопной чистоты 2Н20 и дейтерирован-ных субстратов и, следовательно, для униформного включения атомов дейтерия в молекулу инозина вместо протонированной глюкозы должен использоваться ее дейтерированный аналог.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Согласно проведенному исследованию, масс-спектрометрия ББА хорошо зарекомендовала себя для изучения путей биосинтеза 2Н-меченого инозина и распределения дейтерия в молекуле. В результате удалось установить места локализации дейтерия в молекуле биосинтетического [2Н]инозина. Наблюдаемый изотопный полиморфизм, сопровождающийся миграцией протона с образованием [M + H]+ не является препятствием определения дейтерия в молекуле, который определяется с учетом вклада пиков молекулярных ионов в суммарный уровень дейтерированно-сти молекулы (5 атомов Н, 62.5 атом. %). Из пяти включенных в молекулу инозина атомов дейтерия три атома дейтерия в рибозном фрагменте молекулы инозина синтезировались за счет ферментативной изомеризации глюкозы клеткой и реакций изотопного ('Н—2Н) обмена, в то время как два других атома дейтерия в С2-, С8-положениях ги-поксантинового остатка могли синтезироваться из [2Н]аминокислот — глицина, глутамина и ас-партата, источником которых служил гидролизат дейтеро-биомассы B. methylicum B-5662. Кроме этого, реакции изотопного (:Н—2Н) обмена также могли приводить к специфичному включению дейтерия в молекулу. Для достижения более высокого уровня дейтерированности конечного продукта необходимо тщательным образом контролировать изотопный состав ростовой среды и исключить все источники дополнительных протонов, в том числе использовать дейтерированную глюкозу, которая может быть выделена в препаративных количествах из дейтерированной биомассы того же штамма метилотрофных бактерий B. methylicum ВКПМ B-5662. В будущем планируется получать и идентифицировать разработанным методом другие дейтерированные природные нуклеозиды и их аналоги.
Работа осуществлялась при финансовой поддержке Научно-исследовательского центра медицинской биофизики (Болгария). Грант № 48-РП.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Chen B., Jamieson E.R., Tullius T.D. A general synthesis of specifically deuterated nucleotides for studies of DNA and RNA // Bioorg. & Med. Chem. Lett. 2002. Vol. 12. P. 3093-3096. Doi: 10.1016/S0960-894X(02)00650-9.
2. Kundu M.T., Trifonova A., Dinya Z., Foldes A., Chatto-padhyaya J. Synthetic studies to improve the deuterium labeling in nucleosides for facilitating structural studies of large RNAs by high-field NMR spectroscopy // Nucleo-sides, Nucleotides and Nucleic Acids. 2001. Vol. 20, no. 4-7. P. 1333-1337. Doi: 10.1081/NCN-100002549.
3. Chirakul P., Litzer J.R., Sigurdsson S.T. Preparation of base-deuterated 2'-deoxyadenosine nucleosides and their site-specific incorporation into DNA // Nucleosid., Nuc-leotid. Nucleic Acids. 2001. Vol. 20, no. 12. P. 19031913. Doi: 10.1081/NCN-100108321.
4. Мосин О.В., Складнее Д.А., Егорова Т.А., Швец В.И. Масс-спектрометрическая оценка уровня включения 2Н и 13С в молекулы аминокислот бактериальных объектов // Биоорганическая химия. 1996. Т. 22, № 10-11. С. 856-869.
5. Мосин О.В., Швец В.И., Складнее Д.А., Игнатов И. Биосинтез фотопреобразующего трансмембранного белка [2Н]бактериородопсина, меченного дейтерием по остаткам ароматических аминокислот [2,3,4,5,6-2H5]Phe, [3,5-2H2]Tyr и [2,4,5,6,7-2H5]Trp // Научное приборостроение. 2013. Т. 23, № 2. С. 14-26. URL: http://213.170.69.26/mag/2013/full2/Art3.pdf.
6. Caprioli R.M. Continuous flow fast atom bombardment mass spectrometry / R.M. Caprioli (ed.). New York: Wiley, 1990. 125 p. Doi: 10.1016/0076-6879(90)93417-j.
7. Tomer K.B. The development of fast atom bombardment combined with tandem mass spectrometry for the determination of biomolecules // Mass Spectrometry Reviews. 1989. Vol. 8, no. 6. P. 445-482. Doi: 10.1002/mas.1280080602.
8. Morris H.R., Panico M., Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler A. Fast atom bombardment: a new mass spectrometric method for peptide sequence analysis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 101, no. 2. P. 623-631. Doi: 10.1002/mas.1280080602.
9. Muñoz García D., Midaglia L., Martinez Vilela J. et al. // Acta Neurologica Scandinavica. 2015. Vol. 131. no. 6. P. 405-410. Doi: 10.1111/ane.12333.
10. Мосин О.В., Складнев Д.А., Швец В.И. Биосинтез дей-терированного инозина бактерией Bacillus subtilis на тяжеловодородной среде // Изв. Акад. наук. Серия биологическая. 1999. № 4. С. 396-402.
11. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum // Biosci., Biotechnol., Bio-chem. 1999. Vol. 62, no. 2. P. 225-229. Doi: 10.1271/bbb.62.225.
12. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. Microbial synthesis of 2H-labelled L-phenylalanine with different levels of isotopic enrichment by a facultive methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum with RuMP assimilation of carbon // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2013. Vol. 7, no. 3. P. 249-260.
13. Мосин О.В., Швец В.И., Складнев Д.А., Игнатов И. Исследование микробного синтеза дейтерий-меченного L-фенилаланина факультативной метило-трофной бактерией Brevibacterium methylicum на средах с различным содержанием тяжелой воды // Биофармацевтический журнал. 2012. Т. 4, № 1. С. 11-22.
14. Мосин О.В., Игнатов И. Биологическое воздействие дейтерия на клетки прокариот и эукариот // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. Т. 2, № 7. С. 122-131.
15. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская К.А., Складнее Д.А., Юркевич А.М., Швец Д.А. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высоко-дейтерированной среде // Биотехнология. 1996. № 4. С. 19-26.
16. Мосин О.В., Швец В.И., Складнее Д.А., Игнатов И. Микробиологический синтез [2Н]инозина высокого уровня дейтерированности грамм-положительной хе-могетеротрофной бактерией Bacillus subtilis // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № 3. P. 255-266. Doi: 10.1134/S0003683813030137.
17. Mosin O.V., Ignatov I. Microbiological synthesis of 2H-labeled phenylalanine, alanine, valine, and leucine/isoleucine with different degrees of deuterium enrichment by the Gram-positive facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum // International Journal of BioMedicine. 2013. Vol. 3, no. 2. P. 132-138.
18. Складнев Д.А., Мосин О.В., Егорова Т.А., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии - источники изотопномеченых 2Н- и 13С-аминокислот // Биотехнология. 1996. № 5. С. 25-34.
19. Мосин О.В., Игнатов И., Швец В.И., Тыминский Г. Масс спектрометрия электронного удара в анализе включения стабильных изотопов дейтерия и углерода-13 в молекулы аминокислот биологических объектов // Научное приборостроение. 2015. Т. 25, № 4. P. 3-18. URL: http://213.170.69.26/mag/2015/ full4/Art1.pdf.
20. Ignatov I., Mosin O. V. Possible processes for origin of life and living matter with modeling of physiological processes of bacterium Bacillus subtilis in heavy water as model system // Journal of Natural Sciences Research. 2013. Vol. 3, no. 9. P. 65-76.
21. Bohinski R.C. Modern concepts in biochemistry / R.C. Bohinski (ed.). Boston, London, Sydney, Toronto, Massachusetts: Allyn & Bacon Inc, 1983. 378 p.
Московский государственный университет прикладной биотехнологии (Мосин О.В.)
Научно-исследовательский центр медицинской биофизики, София, Болгария (Игнатов И.)
Московский государственный университет тонких химических технологий им. М. В. Ломоносова
(Швец В.И.)
Европейское научное общество, Европейская академия естественных наук, Ганновер, Германия
(Тыминский Г.)
Контакты: Мосин Олег Викторович, mosin-oleg@yandex.ru
Материал поступил в редакцию: 14.02.2016
ISSN0868-5886 NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2016, Vol. 26, No. 2, pp. 3-16
FAST ATOM BOMBARDMENT MASS SPECTROMETRY IN EVALUATION OF BIOSYNTHETIC PATHWAYS OF PURINE RIBONUCLEOSIDE [2H]INOSINE
O. V. Mosin1, I. Ignatov2, V. I. Shvets3, G. Tyminski4
1 Moscow State University of Applied Biotechnology, Russia
2The Scientific Research Center of Medical Biophysics, Sofia, Bulgaria
3'Moscow State University of Fine Chemical Technology named after M. V. Lomonosov, Russia 4European Scientific Society, European Academy of Natural Sciences, Hannover, Germany
In this paper was demonstrated the possibility of the use of fast atom bombardment (FAB) mass spectrometry on an impulse mass spectrometer VG-70 SEQ ("Fisons VG Analytical", USA) for the study of biosynthetic pathways of 2H-labeled purine ribonucleoside inosine secreted into the culture liquid (CL) by Gram-positive chemoheterotrophic bacterium Bacillus subtilis VKPM B-3157 when grown on heavy water (HW) medium with 2 % hydrolyzate of deuterated biomass of methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum VKPM B-5662 as a source of growth 2H-labeled substrates. Isolation of 2H-labeled inosine from the LC was performed by adsorption/desorption on activated carbon with following extraction by 0.3 M ammonium-formate buffer (pH = = 8.9), crystallization in 80 % (v/v) ethanol and ion exchange chromatography (IEC) on a column with AG50WX 4 cation exchange resin equilibrated with 0.3 M ammonium-formate buffer and 0.045 M NH4Cl. The investigation of deuterium incorporation into the molecule of biosynthetic [2H]inosine by FAB mass spectrometry demonstrated the incorporation of 5 deuterium atoms into the molecule (the total level of deuterium enrichment — 62.5 atom% 2H) with incorporation of 3 deuterium atoms into the ribose and 2 deuterium atoms — into the hypoxanthine residue of the molecule. Three non-exchangeable deuterium atoms were incorporated into the ribose residue owing to reactions of enzymatic izomerization of glucose in 2H2O-medium due to reactions of glycolysis, associated with the Embden-Meyerhof pathway with participation of reactions of isotope (1H-2H) exchange, while two other deuterium atoms at C2, C8-positions in the hypoxanthine residue were synthesized from [2H]amino acids that originated from the deuterated hydrolysate of the methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum VKPM B-5662.
Keywords: 2H-labeled inosine, biosynthesis, heavy water, Bacillus subtilis VKPM B-3157, mass spectrometry FAB
REFERENСES
1. Chen B., Jamieson E.R., Tullius T.D. A general synthesis of specifically deuterated nucleotides for studies of DNA and RNA. Bioorg. & Med. Chem. Lett, 2002, vol. 12, pp. 3093-3096. Doi: 10.1016/S0960-894X(02)00650-9.
2. Kundu M.T., Trifonova A., Dinya Z., Foldes A., Chatto-padhyaya J. Synthetic studies to improve the deuterium labelling in nucleosides for facilitating structural studies of large RNAs by high-field NMR spectroscopy. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 2001, vol. 20, no. 47, pp. 1333-1337. Doi: 10.1081/NCN-100002549.
3. Chirakul P., Litzer J.R., Sigurdsson S.T. Preparation of base-deuterated 2'-deoxyadenosine nucleosides and their site-specific incorporation into DNA. Nucleosid., Nucleo-tid. Nucleic Acids, 2001, vol. 20, no. 12, pp. 1903-1913. Doi: 10.1081/NCN-100108321.
4. Mosin O.V., Skladnev D.A., Egorova T.A., Shvets V.I. [Mass-spectrometry evaluation of enrichment levels of 2H and 13C isotopes in molecules of bacterial objects]. Bioor-ganicheskaja himija [Bioorganic chemistry], 1996, vol. 22, no. 10-11, pp. 856-869 (In Russ.).
5. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. [Biosynthesis of transmembrane photo-transforming protein [2H]bacteriorhodopsin, labeled with deuterium on residues of aromatic amino acids [2,3,4,5,6-2H5]Phe, [3,5-2H2]Tyr u [2,4,5,6,7-2H5]Trp]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2013, vol. 23, no. 2, pp. 1426 URL: http://213.170.69.26/mag/2013/full2/Art3.pdf (In Russ.).
6. Caprioli R.M. Continuous flow fast atom bombardment mass spectrometry. Ed. R.M. Caprioli, New York, Wiley, 1990. 125 p. Doi: 10.1016/0076-6879(90)93417-j.
7. Tomer K.B. The development of fast atom bombardment combined with tandem mass spectrometry for the determination of biomolecules. Mass Spectrometry Reviews, 1989, vol. 8, no. 6, pp. 445-482. Doi: 10.1002/mas. 1280080602.
8. Morris H.R., Panico M., Barber M., Bordoli R.S., Sedgwick R.D., Tyler A. Fast atom bombardment: a new mass spectrometric method for peptide sequence analysis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, vol. 101, no. 2, pp. 623-631. Doi: 10.1002/mas. 1280080602.
9. Muñoz García D., Midaglia L., Martinez Vilela J. et al. Associated Inosine to interferon: results of a clinical trial
in multiple sclerosis. Acta Neurologica Scandinavica, 2015, vol. 131, no. 6, pp. 405-410. Doi: 10.1111/ ane.12333.
10. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. [Biosynthesis of 2H-labelled inosine by bacterium Bacillus subtilis on heavy water medium]. Izv. RAN. Ser. Biologicheskaja [News of the Russian Academy of Sciences. A series is biological], 1999, vol. 4, pp. 396-402 (In Russ.).
11. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of 2H-labeled phenylalanine by a new methylotrophic mutant Brevibacterium methylicum. Biosci., Biotechnol., Bio-chem, 1999, vol. 62, no. 2, pp. 225-229. Doi: 10.1271/ bbb.62.225.
12. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. Microbial synthesis of 2H-labelled L-phenylalanine with different levels of isotopic enrichment by a facultive methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum with RuMP assimilation of carbon. Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2013, vol. 7, no. 3, pp. 249-260.
13. Mosin O.V., Shvets V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. [Studying of microbial synthesis of deuterium labeled L-phenylalanine by methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum on media with different content of heavy water]. Biofarmacevticheskij zhurnal [Russian Journal of Biopharmaceuticals], 2012, vol. 4, no. 1, pp. P. 11-22 (In Russ.).
14. Mosin O.V., Ignatov I. [Biological influence of deuterium on prokaryotic and eukaryotic cells]. Razrabotka i regi-stracija lekarstvennyh sredstv [Drug development and registration], 2014, vol. 2, no. 7, pp. 122-131 (In Russ.).
15. Mosin O.V., Kazarinova L.A., Preobrazhenskaja K.A., Skladnev D.A., Jurkevich A.M., Shvets V.I. [Growth of the bacteria Bacillus subtilis, and the biosynthesis of inosine on high deuterated medium]. Biotechnologiya
Contacts: Mosin Oleg Victorovich, mosin-oleg@yandex.ru
[Biotechnology], 1996, no. 4, pp. 19-26 (In Russ.).
16. Mosin O.V., Shvez V.I., Skladnev D.A., Ignatov I. Microbiological synthesis of [2H]inosine with high degree of isotopic enrichment by Gram-positive chemoheterotrophic bacterium Bacillus subtilis. Applied Biochemistry and Microbiology, 2013, vol. 49, no. 3, pp. 255-266. Doi: 10.1134/S0003683813030137.
17. Mosin O.V., Ignatov I. Microbiological synthesis of 2H-labeled phenylalanine, alanine, valine, and leucine/isoleucine with different degrees of deuterium enrichment by the Gram-positive facultative methylotrophic bacterium Brevibacterium methylicum. International Journal of BioMedicine, 2013, vol. 3, no. 2, pp. 132-138.
18. Skladnev D.A., Mosin O.V., Egorova T.A., Eremin S.V., Shvets V.I. [Methylotrophic bacteria - the sources of iso-topically labeled H- and C-amino acids]. Biotechnologiya [Biotechnology], 1996, no. 5, pp. 24-34 (In Russ.).
19. Mosin O.V., Ignatov I., Shvets V.I. Tyminski G. Electron impact mass spectrometry in analysis of introduction of stable isotopes of deuterium and carbon-13 into amino acid molecules from bacterial objects. Nauchnoe Priboro-stroenie [Scientific Instrumentation], 2015, vol. 25, no. 4, pp. 14-26. Doi: 10.18358/np-25-4-i318 (In Russ.).
20. Ignatov I., Mosin O.V. Possible processes for origin of life and living matter with modeling of physiological processes of bacterium Bacillus subtilis in heavy water as model system. Journal of Natural Sciences Research, 2013, vol. 3, no. 9, pp. 65-76.
21. Bohinski R.C. Modern concepts in biochemistry. R.C. Bohinski, ed., Boston, London, Sydney, Toronto, Massachusetts, Allyn & Bacon Inc., 1983, 378 p.
Article received in edition: 14.02.2016
