CC BY
19
Орипнальна стаття = Original article = Оригинальная статья
DOI: https://doi.org/10.25305/unj.115236
Вплив ембрюнальних нейрональних кл^ин на структури внyтpiшньoгo вуха тварин при експериментальному oтoтoкcикoзi (морфолопчна oцiнкa)
CanrnaK I.I.1, TiMeH Г.Е.1, Ceмeновa В.М.2, Cтaйно Л.П.2
1 Вщдш ЛОР-патологи дитячого вiкy, 1н^итут отолapингологiï ím. пpоф. О.С. Коломшченка HAMH У^аши, Кив, У^аша
2 Лaбоpaтоpiя культивування тканин, Iнcтитyт нейpоxipypгiï ím. акад. А.П. Ромоданова HAMH У^аши, Кив, У^аша
Нaдiйшлa до peдaкцiï 31.10.2017. Пpийнятa до пyблiкaцiï 15.11.17.
Адреса для листування:
Can'waK Ipинa I^piBHa, Вддл ЛОР-пaтологiï дитячого BiKy, Iнcтитyт отолapингологiï, вул. Зоологiчнa, 3, Ки'1в, yKpaÏHa, 03680, e-mail: irina. sapizhak8888@ukr.net
Мета. Оцшити ефектившсть суспензи ембрюнальних нейро^тин (ЕН) при експериментальному ototok^ko3í у гвшейських свинок. Матерiали i методи. Дослщження виконане на 40 статевозр^их гвшейських свинках. Сенсоневральну приглухуватють моделювали шляхом введення амшоткозидного антибiотика гентамщину сульфату в дозi 100 мг/кг протягом 14 дiб.
Суспензiю нейральних стовбурових кл^ин вводили в об'eмi 2 млн. клiтин в 0,5 мл - штратимпанально та в об'eмi 2 млн. клiтин в 0,5 мл - субокциттально у 1-шу та на 15-ту добу експерименту. Результати. Застосовування методики выбору та приготування суспензи ЕН дозволило забезпечити Тх потрiбну кiлькiсть для подальшоТ трансплантацií in vivo з незмшними для цих клiтин характеристиками. Ототоксикоз, модельований шляхом 14-денного внуршньом'язового введення розчину гентамiцину в дозi 100мг/кг маси тiла, супроводжувалася вираженою загальною iнтоксикацieю: погiршенням апетиту, схудненням, частим сечовипусканням, випадшням шерстi. 1н'екшя ЕН в першу добу, до i тсля введення амiноглiкозиду, повшстю, на 15-ту добу - частково швелювала дiагностованi симптоми.
При 14-добовому введеннi гентамiцину виникали змiни пстоарх^ектошки внутрiшнього вуха, порушення мiкроциркуляцiТ в судиннш смужцi, що пiдтверджено даними морфолопчного дослiдження.
Введення ЕН в першу добу тсля моделювання ототоксикозу попереджало його прогресування при 14-денних iн'eкцiях гентамiцину, що пiдтверджено даними функцюнальних та морфологiчних дослiджень. Висновки. Отримаш данi свiдчать про доцшьшсть обраного напрямку вивчення можливостi використання ЕН для попередження та л^ування ототоксичного впливу амiногликозидiв на внутршне вухо експериментальних тварин.
Ключовi слова: сенсоневральна приглухуват/сть; ам/ногл/козидний антиб/отик; гентам/цин; нейральнi кл/тини; морфолог/чн/ зм/ни; експеримент.
Украшський нейрохiрургiчний журнал. 2017;(4):55-9.
The neuronal stem cells effect on inner ear structure in experimental gentamicin ototoxicity
Irina I. Sapizhak1, Hryhoriy E. Timen1, Vira M. Semenova2, Lyudmyla P. Stayno2
1 Department of ENT-childhood diseases, Kolomiychenko Otolaryngology Institute, Kyiv, Ukraine
2 Tissue Culture Lab, Romodanov Neurosurgery Institute of NAMS of Ukraine, Kyiv, Ukraine
Received, October 31, 2017. Accepted, November 15, 2017.
Address for correspondence:
Irina I. Sapizhak, Department of ENT-childhood diseases, Kolomiychenko Otolaryngology Institute, 3 Zoologichna st., Kyiv, Ukraine, 03680, e-mail: irina. sapizhak8888@ukr.net
Objective. To examine the effectiveness of suspensions of embryonic stem cells in experimentally induced aminoglycoside ototoxicity in Guinea pigs.
Materials and methods. The study involved 35 adult Guinea pigs. The hearing loss was caused by administration of gentamicin 100 mg per KBW. Intratympanal suspension of 2 million neuronal steam cells in 0.5 mg and sub occipital suspension of 2 million cells in 0.5 mg were administered on the 1st and 15th day.
Results. The methodology of using and preparation of the suspension from neuronal stem cells enables to provide their necessary number for transplantation in vivo, remaining the cell characteristics. Aminoglycoside ototoxity caused by a 14-day administration of gentamicin to Guinea pigs in a dose of 100 mg/KBW was accompanied by general intoxication: reduced appetite, weight loss, frequent urination, hair falling out. The administration of neuronal stem cells on the first day, before and after aminoglycoside administration, completely, and on 15 partially neutralizes the symptoms.
Fourteen-day administration of gentamicin to Guinea pigs causes a violation of the architectonics and morphology of inner ear microcirculation in psalterial cords.
© Сатжак I.I., ^мен r.E., Семенова В.М., Стайно Л.П., 2017
NSC administration on the first day of simulated aminoglycoside ototoxicity prevented its development if 14-day injections of gentamycin, that is confirmed by ABR and morphologically.
Conclusions. The conducted experiments show the feasibility of the chosen direction to explore the potential use of neuronal stem cells for the prevention of aminoglycoside ototoxic effects in Guinea pigs.
Keywords: sensoneural hearing loss; amynoglycoside antibiotic; Guinea pigs; neuronal steam cells; morphological changes.
Ukrainian Neurosurgical Journal. 2017;(4):55-9.
Влияние эмбриональных нейрональных клеток на структуры внутреннего уха животных при експериментальном ототоксикозе (морфологическая оценка)
Сапижак И.И.1, Тимен Г.Е.1, Семенова В.М.2, Стайно Л.П.2
1 Отдел ЛОР-патологии детского возраста, Институт отоларингологии им. проф. А.С. Коломийченко НАМН Украины, Киев, Украина
2 Лаборатория культивирования тканей, Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМН Украины, Киев, Украина
Поступила в редакцию 31.10.2017. Принята к публикации 15.11.2017.
Адрес для переписки:
Сапижак Ирина Игоревна, Отдел ЛОР-патологии детского возраста, Институт отоларингологии, ул. Зоологическая, 3, Киев, Украина, 03680, e-mail: irina.sapizhak8888@ ukr.net
Цель. Изучить эффективность суспензии эмбриональных нейроклеток (ЭН) при экспериментальном ототоксикозе у гвинейских свинок. Материалы и методы. Исследования проведено на 40 половозрелых гвинейских свинках. Сенсоневральную тугоухость моделировали путем введения аминогликозидного антибиотика гентамицина сульфата в дозе 100 мг /кг на протяжении 14 сут. Суспензию ЭН вводили в объёме 2 млн. клеток в 0,5 мл - интратимпанально и 2 млн. клеток в 0,5 мл
- внутримышечно в 1-е и на 15-е сутки эксперимента. Результаты. Использованная методика отбора и приготовления суспензии ЭН позволило обеспечить их нужное количество для дальнейшей трансплантации in vivo, с неизмененными для этих клеток характеристиками.
Ототоксикоз, моделированный путем 14-дневного введения гентамицина в дозе 100 мг/кг массы тела, сопровождался выраженной общей интоксикацией: ухудшением аппетита, похудением, частым мочеиспусканием, выпадением шерсти. Инъекция суспензии НЭ в первые сутки, до и после введения аминогликозида, полностью, а на 15-е сутки
- частично нивелировала клинические симптомы.
При 14-дневном введении гентамицина возникало нарушение архитектоники и морфологии внутреннего уха, микроциркуляции в сосудистой полоске, что подтверждено данными морфологического исследования.
Введение ЭН в первые сутки после моделирования ототоксикоза предупреждало его прогрессирование при 14-дневных инъекциях гентамицина, что подтверждено данными функци онал ьных и морфологических исследований.
Выводы. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности выбранного направления изучения возможности использования ЭН для предупреждения и лечения ототоксического воздействия аминогликозидов на внутреннее ухо в эксперименте.
Ключевые слова: сенсоневральная тугоухость; аминогликозидный антибиотик; гентамицин; нейральные клетки; морфологические изменения; эксперимент.
Украинский нейрохирургический журнал. 2017;(4):55-9.
Вступ. За даними ВОЗ, у 5-8 % населення Землi виявляють зниження гостроти слуху, у 65-93% з них - дiагностують сенсоневральну приглухуват^ть. В УкраТш бшьш шж у 270 000 пащен^в дiагностують рiз-ж форми сенсоневральноТ приглухуватосп (0,6 % вщ загальноТ юлькост населення), з них майже у 100 000 -глухоту. Поширеними ушкоджуючими чинниками, що часто зумовлюють загибель волоскових кл^ин (ВК) внутршнього вуха, вважають, генетичж в тому числ^ спадков^ аутоiмуннi процеси, бактерiальну та вiрусну шфекщю, ототоксичш лкарсью засоби тощо.
Недостатня ефектившсть медикаментозного лкування захворювання змушуе шукати новi шляхи виршення проблеми [1]. Застосування полтотентних стовбурових ^тин (СК) мае суттевий потеншал в лкуванж сенсоневрального ураження з формуванням приглухуватосп та глухоти [1-5].
Першн спроби вивчення можливост застосування СК в терапи функцюнальних порушень внутршньо-го вуха здшснеш T. Nakagawa (2005). Доведено, що трансплантоваш СК персистують i збер^ають жит-тездатшсть у внутршньому вуа i здатж диферен-
Стаття м'1стить рисунки, як! вдображаються в друкован'1Й версИу в'дт'/нках срого, в електронн'1Й — у кольор'1.
шюватися у фенотипи нейрональних, гл1альних та волоскових кл1тин.
Магомедов М.М. (1997), одним з перших застосував при порушены слуху у людей ембрюнальну нервову тканину у вигляд1 гомогенату ембрюнальних кл1тин. Спостереження проведен! у 14 хворих з нейросен-сорною приглухуват1стю П-Ш-ступеня за тривалост1 захворювання в1д 6 м1с до 3 рок1в. П1сля одноразового застосування в1дзначали покращення слуху за даними тонально!' пороговоТ аудюметрп в середньому на 10 дБ та аудюметрп - в розширеному д1апазон1 частот - на 5 дБ (Магомедов ММ. Применение фетальных тканей в терапии хронической нейросенсорной тугоухости. В книз¡: Матер/'али м'1жнародно/ науково-практично/ конференци, присвячен/'й 75-р'ччю кафедри та кл/'н/'ки отоларингологи Дн/'пропетровсько/' медично/ академи; Дн1пропетровськ, Укра/на; 1997. С. 140-41).
Мета дослщження. Оцшити ефективнють сус-пензп ЕН при ототоксикоз1 в експериментк
Матерiали i методи дослщження. Для вив-чення ефективност1 застосування ЕН при ототокси-коз1 проведен! експериментальш досл!дження на 35 гвшейських свинках масою т!ла 500-900 г без сома-тичних захворювань та ознак запального процесу у зовшшньому та середньому вуа (за даними мкроо-тоскопп), а також за збереженого рефлексу Ргеуег. Залежно вщ способу та строк!в введення ЕН тварини розподтеш на 6 груп (див. таблицю).
В уах тварин на початку експерименту, перед введенням ЕН та по закшченш дослщження проводили обстеження слуху шляхом реестрацп коротко латентних слухових викликаних потенц1ал1в (КСВП) (Тмен Г.Е, Цимбалюк В.1., Белоусова А.О, В/'нничук П.В., Сап/'жак 1.1. Вивчення впливу нейрональних стовбурових кл/'тин на морфо-функц/'ональний стан внутршнього вуха морських свинок п/'сля експери-ментально викликаного ам/'ногл/'козидного ототокси-козу. В Книз¡: Матер/'али щор1чно/' традиц/'йно/' ос/'н-ньо/ конференци Укра/нського наукового медичного товариства л/кар/'в-оториноларинголог/'в «Сучасн/ методи д/'агностики та л/'кування хрон '1чних запальних захворюваньверхних дихальних шлях/'в та вуха»; 1213 жовтня 2015; Дн1пропетровськ, Укра/на. 2015. С. 137). Пщ час першого дослщження КСВП (¡нтактш тварини, а також група II) слух в1дпов1дав норм1 (5-25 dB HL). П1сля 14-денного введення розчину гентамщину сульфату 100 мг/кг маси тша р1вень звукового тиску тдвищився до 65- 85 dB HL, що свщчило про ототоксичний вплив гентамщину. Проте, п1сля введення суспензп ЕН, як штратимпанально, так I субокциттально, спостер1гали зниження р1вня звукового тиску до 25 - 40 dB HL, що св1дчило про ТТ л1кувальну д1ю (рис. 1-3).
Рис. 1. Граф1чне зображення кривоТ КСВП у тварин на початку експерименту. III та V тки достов1рно рееструються 15 dB HL, що в1дпов1дае норм1.
Рис. 2. Крив1 реестрац1Т КСВП у тварин I групи на 14-ту добу експерименту п1сля введення гентам1цину (пояснення в текст1).
Рис. 3. Крив1 реестрац1Т КСВП у тварин III - VI групи. Введення ЕН на15-ту добу експерименту (пояснення в текст1).
Розпод1л експериментальних тварин на групи залежно вщ способу та строюв введення ЕН
Група Умови експерименту Кшьюсть тварин
I 14-разове введення гентамщину (100 мг/кг) 5
II 14-разове введення 1зотон1чного розчину NaQ внутр1шньом'язово 5
III 14-разове введення гентамщину+ ЕН !нтратимпанально у 1-шу добу 5
IV 14-разове введення гентам1цину + ЕН Ытратимпанально на 15-ту добу 5
V 14-разове введення гентамщину + ЕН субокцигнтально у 1-шу добу 5
VI 14-разове введення гентамщину + ЕН субокциттально на 15-ту добу 5
Суспензи НЕ готували в лаборатори культиву-вання кл^ин 1нституту нейрохiрургií.
Перед вилученням ембрюшв (14 дiб гестацií) ваптну самку вводили в наркоз ефнром, обробляли шкiру живота 5% спиртовим розчином йоду та 70% розчином спирту. Тварину фксували на пробковш дошш, робили хiрургiчними ножицями круговий розрiз шкiри пiд переднiми лапками i на бiчних вiддiлах живота, шюру вiдтягували донизу, оголюючи перед-ню черевну стшку. За допомогою ножиць та пiнцета широко розкривали черевну порожнину, вщакали роги матки i переносили ix в стерильний iзотонiчний розчин в чашку Петрк В стерильному боксi вилучали ембрюни з рогiв матки i переносили ix в свiжу порцiю iзотонiчного розчину в чашку Петрi. Структури мозку препарували тд бiнокулярною лупою з використан-ням мiкроiнструментiв в сольовому розчиш PBS (без юшв Са та Mg, Sigma). Мозок вилучали з черепа ембрiона, за допомогою тонких пшце^в i скальпелiв ретельно видаляли мозковi оболонки, по^м видаляли кору великого мозку. Фрагменти кори шкубували в розчинi PBS протягом 5-7 при юмнатнш температур^ подрiбнювали мiкроножицями та дисоцiювали шляхом багаторазового птетування скляними птетками Пастера з оплавленими кiнчиками для запоб^ання пошкодження клiтин. Отриману суспензи клiтин центрифугували при 1000 об.хв, надосад зливали, а осад ^тин ресуспендували в поживному середовищi 1гла (Sigma) [6].
Ступiнь дисоцiацii i стан клiтин контролювали пiд мкроскопом (рис.4-6).
Для визначення концентрацii кл^ин та обчислен-ня кiлькостi живих кл^ин використовували камеру Горяева i забарвлення 0,2% розчином трипанового синього (Sigma). Суспензи ретельно перемiшували, 0,5 мл розводили в 5 раз 0,2% розчином трипанового синього, шкубували при температурi 370 С протягом 3-5 хв. Суспензи знов ретельно перемшували та вводили в камеру Горяева. Визначення життездатносп дисоцшованих ^тин фунтуеться на здатностi трипанового синього забарвлювати тiльки загиблi ^тини. В подальшому клiтини пiдраxовували проводили за формулою:
X=NxSx10000,
де Х - кшьюсть клiтин в 1 см3 суспензи;
N - кшьюсть кл^ин в 25 квадратах;
S - кратнiсть розведення суспензii фарбою;
10 000 - постiйна величина.
Вмют живих клiтин (незабарвлених) тдрахову-вали за формулою:
загальна тлыасгь кттин - клльгасть мертвих кл1тин ^^
Вмiст живих клiтин в суспензii становив 60 - 73%.
Отриману суспензiю кл^ин тримали в СО2-ш-кубаторi (Nuve, Туреччина), при постiйнii темпе-ратурi 37оС, 5% СО2 та 95% вологосп до моменту трансплантацii.
Тварин виводили з експерименту тд наркозом тiопентал-натрiем у дозi 20 мг/кг. Пюля декапiтацii гiльйотиною видiляли блоки скроневих юсток, ф^-сували в 10% розчиш нейтрального формалшу для подальшого морфологiчного дослiдження.
Рис. 4. Дисоцшоваш клiтини кори великого мозку ембрюшв 14 дiб гестацii. (пояснення в тексп). Жива культура. Зб.Х200.
Рис. 5. Дисоцiйованi клiтини кори великого мозку ембрюшв. (пояснення в тексту. Жива культура. Зб.Х400.
Рис. 6. Жива культура кл^ин кори великого мозку ембрюшв. 24 год культивування. Зб.Х200.
Дослщи проводили вщповщно з «Загальними принципами експеримен"пв на тваринах», схваленими III Нацюнальним конгресом з бiоетики i узгодженими з положенням «бвропейськоТ конвенцiТ про захист хребетних тварин, яких використовують для експе-риментальних та шших наукових цiлей».
Результати та |'х обговорення. Патологiчний процес приглухуватостi моделювали з використанням ототоксичного антибiотика амшогл^озидноТ групи гентамiцину сульфату, який вводили з розрахунку 100 мг/кг внутршньом'язово щоденно протягом 14 дiб.
На початку експерименту вс тварини були рух-ливi, активнi, мали блискучу, гладку шерсть. Ознак соматичних та отомкроскотчних порушень не було. Рефлекс Ргеуег позитивний.
У тварин I групи, починаючи з 8-9-Т доби дослщ-ження, з'являлися незначнi прояви штоксикаци, що проявлялося в'ялiстю, зниженням рухливосп, частим дiурезом, рефлексом Ргеуег слабопозитивний.
У тварин II групи на 14-ту добу змш поведшки та патологiчних розладiв не було. Тварин виводили з експерименту через 14 дiб вщ початку введення розчину натр^ хлориду та гентамщину.
У тварин III групи в 1-шу добу експерименту в стерильних умовах тд бiнокулярною лупою при 4-кратному збтьшенш iнтратимпанально шляхом пункци барабанноТ перетинки за допомогою вушноТ воронки та iнсулiнового шприца вводили суспенз^ ЕН 2 млн.клiтин (0,5 мл) в праву та лiву барабаннш порожнини. У подальшому вводили розчин гентамЬ цину сульфату внутршньом'язово з розрахунку 100 мг/кг протягом 14 дiб. Змiн загального стану тварин протягом експерименту не було, вони були активы, рефлекс Ргеуег позитивний.
Пюля введення ЕН на 15-ту добу (IV група) спос-тер^али поступове покращення загального стану тварин протягом 14 дiб до моменту Тх виведення з експерименту. Вщзначали зменшення тяжкост ото-токсикозу, тварини ставали рухливш^ зменшилось випадшня шерстi, покращився апетит, рефлекс Ргеуег залишався слабопозитивним.
Тваринам V групи в 1-шу добу введення розчину гентамщину сульфату з субокциттально вводили суспенз^ ЕН 2млн. кл^ин (0,5 мл) тд наркозом ксилазином в дозi 0,02 мг/кг маси тта. Попередньо у тварин ретельно голили шийно-потиличну дтян-ку, мiсце пункци обробляли 96% розчином спирту тричк В мюц пункцiТ (середина лшп, проведеноТ мiж великим потиличним горбом та остистим вщростком II шийного хребця) проводили м^цеву анестезiю шюри 0,2% розчином лiдокаТну. Встановлювали голку перпендикулярно шкiрi та проколювали м'як тканини до потиличноТ кiстки. Виймали голку на 1-2 мм, тд гострим кутом проколювали мембрану та тверду оболонку головного мозку, виймали ман дрен, отримували спинномозкову рщину, тсля чого вводили ЕН. У подальшому протягом 14 дiб щоденно внутршньом'язово вводили розчин гентамщину сульфату з розрахунку 100 мг/кг маси тта. Протягом перюду експерименту померла одна тварина, решта були в задовтьному стаж, активы.
Тваринам VI групи вводили розчин гентамщину сульфату 100 мг/кг внутршньом'язово протягом 14 дiб. У 4 тварин на 12-ту добу з'явились ознаки загаль-
ноТ штоксикаци: в'ял^ть, випадшня шерст^ схуднен-ня. 5 тварин померли. На 15-ту добу тваринам вводили суспенз^ ЕН 2 млн. ^тин 0,5 мл субокциттально. Протягом 14 дiб вони перебували тд спостереженням. З 18-Т доби вщзначали покращення загального стану, тварини стали рухливш^ зменшилось випадiння шерстi.
Висновки. Отримаш результати свiдчать про доцтьшсть обраного напрямку вивчення можли-вост застосування ЕН для попередження ототоксичного впливу амiногликозидiв на внутршне вухо в експериментi.
Методологiя i критерiТ оцiнки ефектiв ЕН удоско-налюються i потребують подальшого вивчення та мультидисциплшарного комплексного пiдходу.
References
1. Kersigo J, Fritzsch B. Inner ear hair cells deteriorate in mice engineered to have no or diminished innervation. Front Aging Neurosci. 2015 Mar 18;7:33. doi:10.3389/fnagi.2015.00033. eCollection 2015. PubMed PMID: 25852547; PubMed Central PMCID: PMC4364252.
2. Huisman MA, Rivolta MN. Neural crest stem cells and their potential application in a therapy for deafness. Front Biosci (Schol Ed). 2012 Jan 1;4:121-32. Review. doi: 10.2741/s255. PubMed PMID: 22202047.
3. McKay R. Stem cells in the central nervous system. Science. 1997 Apr 4;276(5309):66-71. Review. doi: 10.1126/ science.276.5309.66. PubMed PMID: 9082987.
4. Nishimura K, Nakagawa T, Ono K, Ogita H, Sakamoto T, Yamamoto N, Okita K, Yamanaka S, Ito J. Transplantation of mouse induced pluripotent stem cells into the cochlea. Neuroreport. 2009 Sep 23;20(14):1250-4. doi: 10.1097/ WNR.0b013e32832ff287. PubMed PMID: 19625987.
5. Rivolta MN. New strategies for the restoration of hearing loss: challenges and opportunities. Br Med Bull. 2013;105:69-84. doi: 10.1093/bmb/lds035. Epub 2012 Nov 21. PubMed PMID: 23175701.
6. Bozhkova,VP, Brezhestovsky LA, Buravlev VM. Rukovodstvo po kul'tivirovaniyu tkani. Metody. Tekhnika. Problemy. Moscow: Nauka; 1988. Russian.
