CC BY
29
DOI 10.29254/2077-4214-2018-4-2-147-287-290 УДК 616.36-03.93:617-089:576.36 niemopaK В. I., Булько M. П., Костюк Г. Я.
ОСОБЛИВОСТ1 КЛ1ТИННОГО ЦИКЛУ КЛ1ТИН ПЕЧ1НКИ П1СЛЯ РЕЗЕКЦГГ вгнницький нацюнальний медичний yнiвepcитeт iмeнi М.1. Пиpoгoвa (м. вгнниця)
pivtorakv@gmail.com
Зв'язок публшацп з плановими науково-дослщ-ними роботами. Дослiдження е фрагментом НДР кафедри клЫчноУ анатоми та оперативно! хiрургN Вiнницького нацiонального медичного ушверсите-ту iменi М.1. Пирогова «Структуры змши в органах травноТ та сечостатевоТ систем пiсля проведення оперативних втручань». № державноТ реестрацп: 0114и003688.
Вступ. Резекцiя печшки, у бiльшостi випадмв, за-лишаеться методом вибору i единим способом, що дозволяе домогтися радикального лiкування i збть-шення тривалостi життя пацiентiв [1]. Печшка люди-ни мае значнi регенераторы можливост i вщновлю-еться, нав^ь, пiсля видалення 70% ТТ маси [2]. Однак, операцiйне втручання на печшщ, навiть в малому обсязi може призвести до серйозних наслщшв, в тому числ^ i тому, що ряд факторiв природноТ резис-тентностi синтезуеться саме в печшц [3]. Так, резек-цiя 42 % та бтьше паренхiми печшки призводить до виражених змiн структур дванадцятипалоТ кишки [4]. Найчастiшим ускладненням тсля резекци печiнки е тслярезекцшна печiнкова недостатнiсть, яка про-являеться порушенням синтетичноТ функци печiнки, печшковою енцефалопатiею та в рядi випадмв може привести до смертi [5,6].
Встановлено, що регенеращя печiнки при ТТ хро-нiчному ушкодженнi поеднаною дiею етанолу та СС14 вщбуваеться за механiзмом полтло'Тдизаци ядер гепатоцилв [7]. Гепатоцити вступають у мпогичний цикл, забезпечуючи самопiдтримку популяцп [8]. Визначено, що гепатоцити нормально! печшки во-лодшть потенцiйними властивостями стовбурових клiтин. Вони здатнi до необмеженоТ пролiферацiТ I можуть набувати фенотитчш ознаки стовбурових I прогенiторних кл^ин [9]. У процесi регенерацп печшки беруть участь вс ТТ кл^инш елементи: гепатоцити, синусо'Тдальш кл^ини, клiтини сполучноТ тканини та позакл^инний матрикс [10]. Результати дослiджень ряду авторiв [11] показують, що гiпертрофiя, а не пролiферацiя, е основним мехашзмом, завдяки якому печiнку вщновлюе свiй об'ем при кровотеч1 тсля резекци печiнки.
Сьогоднi ще недостатньо дослiдженi механiзми, якi запускають процеси регенерацп i регулюють Тх вплив у залежност вiд втрати маси органу.
Мета дослщження. Визначити особливост показ-никiв клiтинного циклу клп"ин печiнки, що залишила-ся тсля частковоТ резекци у статевозрiлих щурiв.
Об'ект i методи дослiдження. Експеримент проведено на 42 щурах-самцях масою 200-250 г. Тварин утримували в умовах вiварiю при втьному доступ! до Тж та води на рацюш харчування, що вщповщае нормативам для щурiв. В контрольнш групi шести щурам нiяких втручань не проводили. Вам тваринам дослщно'Т групи (36 щурiв) виконували оперативне втручання резекцш печiнки. Для цього видаляли серединну передню частку печшки та лiву передню
частку печшки (~70% загально'Т маси печiнки). Резек-цiя печiнки у даному дослщженш трактувалася як модель гостроТ печшково'Т недоcтатноcтi [12,13]. Тварин виводили з дослГду по 6 тварин на кожний тер-мiн: через 1, 2, 3, 7, 10, 14 дiб тсля резекци печшки шляхом внутршньо-плеврального введення тюпен-талу-натрГю (50 мг/кг).
Утримання та мантуляци з тваринами проводили у вщповщносп до «Загальних етичних принцитв екcпериментiв на тваринах», ухвалених Першим на-цiональним конгресом з бюетики (КиТв, 2001), також керувалися рекомендацГями «бвропейсько'Т конвен-цп про захист хребетних тварин, ям використовують-ся для експериментальних та шших наукових цтей» (Страсбург, 1985) i положеннями «Правил доклшГч-но'Т оцГнки безпеки фармаколопчних заcобiв (GLP)».
ВмГст ДНК в ядрах клГтин печiнки щурГв визначали методом проточно! ДНК-цитометри. Суспензп ядер з клГтин печiнки щурГв отримували за допомогою роз-чину для дослщження ядерно'Т ДНК CyStain DNA Step 1 (Partee, НГмеччина) вГдповГдно до протоколу-ш-струкци виробника. Даний розчин дозволяе викону-вати екстракцш ядер та маркувати ядерну ДНК дГа-мГдинофенГлГндолом (DAPI). У процеа виготовлення ядерних суспензГй використовували одноразовГ фГльтри CellTries 50 мкм (Partee, НГмеччина). Проточ-ний аналГз виконувався на багатофункцГональному науково-дослГдному проточному цитометрГ «Partee PAS» (Partee, НГмеччина). Для збудження флуорес-ценци DAPI застосовувалось УФ-випромшювання. З кожного зразка нуклеарно'Т суспензи рееструвалось 20 тис. подш.
ЦиклГчний аналГз клГтин виконувався засобами програмного забезпечення FloMax (Partee, НГмеччина), де визначались: G0G1 - вГдсоткове сшввщно-шення клГтин фази G0G1 до вах клГтин клГтинного циклу (вмГст ДНК = 2e); S - вГдсоткове стввщношен-ня клГтин фази синтезу ДНК до вах клГтин клГтинного циклу (вмГст ДНК > 2e та < 4e.); G2M - вГдсоткове стввщношення фази G2M до вах клГтин клГтинного циклу (ДНК = 4e або полтло'Тдш). Визначення фраг-ментаци ДНК (апоптоз) виконано шляхом видтення SUB-G0G1 дГлянки на ДНК-пстограмах - RN2 перед тком G0G1, яка вказуе на ядра клГтин з вмГстом ДНК < 2e.
Статистична обробка отриманих результат була проведена в лщензованому пакетГ «STATISTICA 8» Гз застосуванням непараметричних методГв оцГнки отриманих результатГв. Оцшювали правильнГсть роз-подГлу ознак за кожним Гз отриманих варГацшних рядГв, середнГ значення кожно'Т ознаки, що вивчала-ся, та стандартне квадратичне вГдхилення. ДостовГр-нГсть рГзницГ значень мГж незалежними кГлькГсними величинами визначали за допомогою U-критерГя Мана-УГтнГ. При порГвняльному аналГзГ трьох i бтьше груп за кГлькГсними ознаками використовувався кри-терГй Краскела-УоллГса.
Рис. 1. ДНК-пстограма ядерноТ суспензп клiтин печiнки щурiв до проведення резекцГТ.
дження на другу добу, але у 1,6 раза (р<0,05) бтьшою у порiвняннi з тваринами контрольно! групи. Через ам дiб кiлькiсть клiтин у цш фaзi була бiльшою у 1,3 раза (р<0,05) порiвняно з третьою добою. Через десять дiб порiвняно з сьомою добою виявили меншу кiлькiсть клiтин у 2,7 раза (р<0,05). Через чотирнадцять дiб порiвняно з десятою добою кiлькiсть кл^ин була бiльшою в 1,3 раза (р<0,05) та наближалась до показника у контрольнш групi тварин (рис. 2).
Таким чином, дан можна трактувати як трьохразове зростання синтетично! дiяль-носп клiтин печiнки у найближчому тсля-операцiйному перiодi тсля резекци печiнки. Найбiльше зростання вiдмiчено на другу добу, менше - на сьому добу, ще менше на 14 добу. Така реакщя гепатоцитiв вiдмiчена також iншими дослщниками [13,16,17].
Порiвняння показникiв клiтинного циклу кл^ин печiнки на 10 та 14 добу (табл.) тсля и частково''' резекци з дослiдженнями попе-реднiх термiнiв пiсляоперацiйного перiоду показало, що на тлi зниження частки кли тин фази G0G1 i збiльшення частки клiтин фази G2M iстотно зрiс iндекс пролiферацп (р <0,05). Вщомо, що перехiд кл^ин з фази G0 у фази G1, S, G2M, свiдчить про включення механiзмiв регенераци, спрямованих на збе-реження органу [7].
Збтьшення iндексу пролiферацil' на деся-ту добу (рис. 3) свщчить про включення за-хисних механiзмiв репаративно' регенераци.
За даними вчених [18] використання щу-рячо' та мишачо' моделi резекци 2/3 печiнки показало, що и маса вiдновлюeться до ви-хщного ртня протягом ~ 7 д1б, в той час як
Рис. 2. кiлькiсть клггин ^шки що знаходяться у фaзi S у рiзнi термши пiсля людям потрiбно майже 100 дшв для повного
резекци. . г i
Примггка: рiзниця мiж групами у залежностi вiд термшу тсля резекци статис- в|дновлення маси печ1нки. тично значима (р=0,00002 за крт^ем Краскела-Уоллiса).
Аналiзуючи основнi показники кл^ин-ного циклу, слiд вiдмiтити, що через 14 дiб
Таблиця.
Показники (%) клггинного циклу кл1тин печшки у найближчий п1сляоперац1йний пер1од (ПП) п1сля резекци
Результати дослщжень та Ух обгово-рення. Аналiз показнишв клiтинного циклу i фрагментаци ДНК кл^ин печiнки показав певний баланс процеав синтезу та фрагментаци ядерно' ДНК у клiтинах печшки штак-тних тварин. Спостерiгаeться переважання частки кл^ин, якi перебувають у фазi про-лiферативного спокою (G0G1). У станi проли феративно''' активносп (S фаза, G2+M фази) знаходиться значно менша кiлькiсть клiтин (рис. 1). Отримаш нами результати досли дження вмiсту ДНК у кл^инах печiнки штак-тних тварин цтком узгоджуються з даними iнших дослщнишв [14,15].
Характеризуючи синтетичну дiяльнiсть кл^ин печiнки, потрiбно вiдмiтити статис-тично значуще бiльшу кiлькiсть клiтин у фаз1 S через одну (у 2,9 раза) та двi доби (у 3,8 раза) тсля резекци печшки у порiвняннi з тваринами контрольно' групи. В подальшо-
му через три доби тсля резекцГ' ктьккть „ . „..... „ , . .
' . . Примггки: * - вфопдысть вщмшностей (р<0,05) у пор1внянн1 з контрольною
кл1тин була меншою (у 2,4 раза; р<0,05) по- групою; # - вiрогiднiсть вщмшностей (р<0,05) у порiвняннi з попередшм термн рiвнян0 з тваринами, що виведеш з ДOCЛi- ном тсляоперацшного перiоду.
печшки Me(Q1-Q 13)
Термш дослщження G0G1 S G2M IP
Контроль (n=6) 71,37 (68,98-77,98) 2,38 (2,11-2,59) 26,25 (19,43-28,72) 28,63 (22,16-31,02)
1 доба ПП (n=6) 73,92 (71,22-76,40) 6,90* (6,35-7,52) 19,18 (17,25-21,18) 26,08 (23,60-28,78)
2 доба ПП (n=6) 67,93 (66,31-68,42) 9,08*# (8,76-9,48) 22,99 (22,07-25,15) 32,07# (31,58-33,69)
3 доба ПП (n=6) 86,22*# (80,81-89,95) 3,72*# (3,58-3,91) 10,06* (6,63-15,28) 13,78*# (10,05-19,19)
7 доба ПП (n=6) 81,73* (81,69-83,82) 4,61*# (4,39-4,87) 13,70* (11,79-14,22) 18,31* (16,18-19,27)
10 доба ПП (n=6) 59,84*# (54,79-63,34) 1,73*# (1,60-1,90) 38,43*# (35,07-43,66) 40,16*# (36,67-45,20)
14 доба ПП (n=6) 58,59* (55,76-61,55) 2,18# (1,99-2,22) 39,23* (36,46-42,17) 41,41* (38,45-44,23)
вщбулося вiдновлення показникiв ^тинно-го циклу (G0G1, G2+M та S) до значень, як1 спостерiгалися у грут тварин без резекци печшки (рис. 4).
Знання механiзмiв регенераци печiнки мае важливе практичне значення для роз-робки способiв корекци рiзних патологiчних станiв печiнки.
Висновки
1. Клп"инний цикл клiтин печiнки у стате-возрiлих тварин у найближчому тсляопера-цiйному перiодi пiсля резекци печiнки мае своТ особливостi: кшьмсть клiтин у синтетич-ний перюд клiтинного циклу (фазу S) зростае хвилеподiбно. Перша хвиля зростання (най-бiльша) спостерiгалася на 1-2 добу, друга хвиля - на 7 добу, третя - на 14 добу тсля-операцшного перюду.
2. На 10-14 добу спостереження тсля резекци печiнки виявлено, що кiлькiсть клiтин у фазi G0G1 статистично значуще менше, а у фазi G2+M - статистично значуще бтьше по-рiвняно з показниками бшьш раннього тс-ляоперацiйного перюду.
Перспективи подальших дослiджень. Перспективно вивчити вплив рiзних спосо-бiв корекци патолопчних станiв на клiтинний цикл кл^ин печiнки, з метою комплексноТ оцiнки механiзмiв регуляци регенераци печшки.
1. Kovalenko Yu, Tupikin K, Vishnevskiy V. Prognostic preoperative system for postresection liver failure. HPB. 2016 Apr;18(S1):e298. DOI: https://doi.Org/10.1016/j.hpb.2016.02.764
2. Dieltsova OI, Herashchenko SB, Kulynych HB. Stovburovi klityny i reheneratsiia pechinky. Naukovyi visnyk Uzhhorodskoho universytetu, seriia «Medytsyna». 2012;1(43):175-9. [in Ukrainian].
3. Kiseleva EA, Tsvetikova LN, Andreev AA. Postrezektsionnaya regeneratsiya pecheni. Vestnik Voronezhskogo instituta vyisokih tehnologiy. 2016;2(17):8-12. [in Russian].
4. Tatarchuk LV, Hnatiuk MS, Yasinovskyi OB. Morfometrychna otsinka osoblyvostei remodeliuvannia struktur dvanadtsiatypaloi kyshky pry rezektsiiakh riznykh obiemiv pechinky. Naukovyi visnyk Uzhhorodskoho universytetu. Seriia "Medytsyna". 2016;1(53):92-5. [in Ukrainian].
5. Bernal W, Wendon J. Acute liver failure. N. Engl. J. Med. 2013 Dec 26;369(26):2525-34. DOI: 10,1056 / NEJMra1208937
6. Jin S, Fu Q, Wuyun G, Wuyun T. Management of post-hepatectomy complications. World J. Gastroenterol. 2013 Nov 28;19(44):7983-91. DOI: 10,3748 / wjg.v19.i44.7983
7. Rikalo NA. The mechanisms of reparative regeneration of liver tissue in immature rats at chronic toxic hepatitis. Journal of Education, Health and Sport. 2015 Sep 29;5(9):587-98. Available from: http://dx.doi.org/10.5281/zenodo.31627
8. Oertel M, Shafritz DA. Stem cells, cell transplantation and liver repopulation. Biochimica et Biophysica Acta. 2008 Feb;1782(2):61-74. DOI: 10,1016 / j.bbadis.2007.12.004
9. Paltsev MA. Biologiya stvolovyih kletok i kletochnyie tehnologii. Moskva: Meditsina; 2009. 456 s. [in Russian].
10. Onischenko NA, Lyundup AV, Deev RV, Shagidulin MYu, Krasheninnikov ME. Sinusoidalnyie kletki pecheni i kletki kostnogo mozga kak komponentyi edinoy funktsionalnoy sistemyi regulyatsii vosstanovitelnogo morfogeneza v zdorovoy i povrezhdennoy pecheni. Genyi i kletki. 2011;6(2):78-92. [in Russian].
11. Matot I, Nachmansson N, Duev O, Schulz S, Schroeder-Stein K, Frede S, et al. Impaired liver regeneration after hepatectomy and bleeding is associated with a shift from hepatocyte proliferation to hypertrophy. The FASEB Journal. 2017 Dec;31(12):5283-95. DOI: 10.1096 / fj.201700153R
12. Palmes D, Spiegel HU. Animal models of liver regeneration. Biomaterials. 2004 Apr;25(9):1601-11.
13. Michalopoulos GK. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy. The American Journal of Pathology. 2010 Jan;176(1):2-13. DOI: 10.2353/ ajpath.2010.090675
14. Pivtorak KV. Osoblyvosti klitynnoho tsyklu hepatotsytiv pry eksperymentalnii nealkoholnii zhyrovii khvorobi pechinky ta yii korektsii. Visnyk problem biolohii i medytsyny. 2017;1(135):270-4. [in Ukrainian].
15. Rykalo NA, Yarovenko LO. Doslidzhennia faz klitynnoho tsyklu yader hepatotsytiv u shchuriv riznykh vikovykh hrup pry khronichnomu alkoholnomu ushkodzhenniu pechinky ta medykamentoznii korektsii kvertsetynom i L-arhininom L-hlutamatom. Dosiahnennia biolohii ta medytsyny. 2015;(25):27-31. [in Ukrainian].
16. Elchaninov AV, Bolshakova GB. Proliferatsiya i kletochnaya gibel gepatotsitov regeneriruyuschey pecheni plodov kryis. Tsitologiya. 2012;54(4):313-7. [in Russian].
17. Lyizikov AN, Skuratov AG, Osipov BB. Mehanizmyi regeneratsii pecheni v norme i pri patologii. Problemyi zdorovya i ekologii. 2015;1(43):4-9. [in Belorussian].
18. Cook D, Ogunnaike BA, Vadigepalli R. Systems analysis of non-parenchymal cell modulation of liver repair across multiple regeneration modes. BMC Syst Biol. 2015 Oct 22;9:71. DOI: 10.1186/s12918-015-0220-9. PubMed PMID: 26493454; PubMed Central PMCID: PMC4618752.
FL4 DA PI
Рис. 3. ДНК-пстограма ядерно'Гсуспензп' клггин печшки щур^в через 10 д^б тсля проведення резекци.
FL4 DAPI
Рис. 4. ДНК-пстограма ядерно'Г суспензп' клггин печшки щур^в через 14 д^б тсля проведення резекци'.
Лггература
ОСОБЛИВОСТ1 КЛ1ТИННОГО ЦИКЛУ КЛ1ТИН ПЕЧ1НКИ П1СЛЯ РЕЗЕКЦП
niBTopaK В. I., Булько М. П., Костюк Г. Я.
Резюме. Визначен особливостi ^тинного циклу клiтин печiнки у статевозртих тварин у найближчому тсляоперацшному перюд! пiсля резекци печiнки: кiлькiсть клп"ин у синтетичний перюд клiтинного циклу (фазу S) зростае хвилеподiбно. Вершина зростання спостеркалася на 1-2 добу, друга хвиля зростання - на 7 добу, третя - на 14 добу тсляоперацшного перюду. На 10-14 добу спостереження пiсля резекци печiнки виявлено, що кiлькiсть кл^ин у фазi G0G1 статистично значуще менше, а у фазi G2+M - статистично значуще бiльше порiвняно з показниками бiльш раннього тсляоперацшного перюду.
Ключoвi слова: печiнка, резекщя, регенерацiя, клiтинний цикл.
ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ПОСЛЕ РЕЗЕКЦИИ
Пивторак В. И., Булько Н. П., Костюк Г. Я.
Резюме. Определены особенности клеточного цикла клеток печени у половозрелых животных в ближайшем послеоперационном периоде после резекции печени: количество клеток в синтетический период клеточного цикла (фазу S) растет волнообразно. Вершина роста наблюдалась на 1-2 сутки, вторая волна роста - на 7 сутки, третья - на 14 сутки послеоперационного периода. На 10-14 сутки наблюдения после резекции печени выявлено, что количество клеток в фазе G0G1 статистически значимо меньше, а в фазе G2 + M - статистически значимо больше по сравнению с показателями более раннего послеоперационного периода.
Ключевые слова: печень, резекция, регенерация, клеточный цикл.
FEATURES OF THE CELL CYCLE OF LIVER CELLS AFTER PARTIAL HEPATECTOMY
Pivtorak V. I., Bulko M. P., Kostyuk G. Ya.
Abstract. Introduction. The liver resection, in most cases, remains the method of choice and the only way to achieve radical treatment and increase the life expectancy of patients. The human liver has significant regenerative capacity and is restored, even after removing 70% of its mass. However, surgeries on the liver, even a small amount can lead to serious consequences, including, and because a number of factors natural resistance is synthesized in the liver.
The purpose of the study is to determine the characteristics of the cellular cycle of liver cells remaining after partial resection in sexually mature rats.
Object and methods. The experiment was conducted on 42 male rats weighing 200-250 g. Animals were kept under vivarium conditions with free access to food and water in a diet that meets the standards for rats. In the control group, no rats were given any of the six rats. All animals of the experimental group (36 rats) performed surgical intervention for liver resection. The middle front lobe of the liver and the left lobe of the liver were removed (~ 70% of the total weight of the liver).
Animals were taken out from the experiment of 6 animals for each term: after 1, 2, 3, 7, 10, 14 days after resection of the liver by intra-pleural administration of thiopental-sodium (50 mg/kg).
Maintenance and manipulation of the animals were carried out according to the "General ethical animal experimentation" adopted the first National Congress on Bioethics (Kyiv, 2001), also guided by the recommendations of the "European Convention for the Protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes" (Strasbourg, 1985) and the provisions of the "Rules of preclinical safety evaluation of pharmacological agents (GLP)".
The DNA content of the rat liver cell nuclei was determined by flow DNA cytometry. Liver cell nucleus suspensions from rats were prepared using a CyStain DNA Step 1 (Partec, Germany) nuclear DNA dilution solution in accordance with the manufacturer's protocol. This solution allows for the extraction of nuclei and the labeling of nuclear DNA by diaminophenylindole (DAPI). In the process of making nuclear suspensions disposable filters CellTrics 50 microns (Partec, Germany) were used. Flow analysis was performed on multifunctional research flow cytometer "Partec PAS" (Partec, Germany).
Results and discussion. Analysis of cell cycle and fragmentation of liver cell DNA showed a certain balance of processes of synthesis and fragmentation of nuclear DNA in liver cells of intact animals. There is a predominance of the proportion of cells that are in the phase of proliferative rest (G0G1). In the state of proliferative activity (S phase, G2+M phase) there is a significantly smaller number of cells.
Characterizing the synthetic activity of liver cells, it is necessary to note statistically significantly more cells in the phase S in one (2,9 times) and two days (3,8 times) after liver resection compared with animals in the control group. Subsequently, three days after the resection, the number of cells was smaller (2,4 times; p<0,05) compared with the animals withdrawn from the study for the second day, but 1,6 times (p<0,05) higher in comparison with control animals. After seven days, the number of cells in this phase was greater than 1,3 times (p <0,05) compared to the third day. Ten days later, compared with the seventh day, a smaller number of cells was detected in 2,7 times (p <0,05). In fourteen days compared to the tenth day, the number of cells was 1,3 times larger (p<0,05) and was closer to the indicator in the control group of animals.
Conclusions. The features of the cell cycle of liver cells in the sexually mature animals in the immediate postoperative period after liver resection are determined: the number of cells in the synthetic cycle of the cell cycle (phase S) grows wavelike. The peak of growth was observed for 1-2 days, the second wave of growth - for 7 days, the third - at 14 days postoperative period. At 10-14 days of observation after liver resection, it was found that the number of cells in the G0G1 phase is statistically significantly lower, and in the G2+M phase it is statistically significantly more significant compared to those of the earlier postoperative period.
Key words: liver, hepatectomy, regeneration, cell cycle.
Рецензент - проф. Пронна О. М.
Стаття надшшла 08.10.2018 року
