CC BY
76
УДК 615.21.015.3: 52:577.353:612.82:616-092.9
Валеева Л.А., Кулагина И.Г., Яфаева Э.Г.
Башкирский государственный медицинский университет E-mail: admin@bgmy.ru
ВЛИЯНИЕ ДИАЗЕПАМА НА ДВИГАТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ГРЫЗУНОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВРЕМЕНИ СУТОК И ПЛОТНОСТИ ГАМК РЕЦЕПТОРОВ МОЗГА
Изучено влияние диазепама на двигательную активность крыс при утреннем и вечернем введении. Установлено, что максимальное подавляющее действие препарата на коэффициент подвижности в тесте «открытое поле» наблюдается при вечернем введении на высоте плотности ГАМк рецепторов головного мозга. При утреннем введении угнетающее действие проявляется дважды: непосредственно после введения и в вечерние часы, на фоне увеличения количества рецепторов.
Ключевые слова: коэффициент подвижности, диазепам, хронобиологическая организация, ГАМК-рецепторы, головной мозг.
Диазепам является представителем широкого круга лекарственных препаратов бензоди-азепинового ряда. Он оказывает анксиолити-ческое, седативно-снотворное, противосудорож-ное и центральное миорелаксирующее действие, влияет на двигательную активность [7], [21]. Бензодиазепиновые транквилизаторы успешно вмешиваются во временную динамику поведения и эндокринные ритмы. Хорошо известное гипногенное действие бензодиазепинов легко объясняется нормализацией ими базального ритма сон-бодрствование [17], [18]. Диазепам устраняет, вызываемую стрессом, дизрит-мию у крыс. Под его влиянием нормализуется циркадный ритм двигательной активности, наблюдаются адаптивные сдвиги во временной динамике принудительного плавания. Механизм действия диазепама обусловлен стимуляцией бензодиазепиновых рецепторов супрамо-лекулярного ГАМК-бензодиазепин-хлорионо-фор рецепторного комплекса, приводящей к усилению ингибирующего действия ГАМК на передачу нервных импульсов. Бензодиазепины связываются с а-субъединицей ГАМКд-рецеп-тора и усиливают торможение в центральной нервной системе при состояниях тревоги [13]. Несмотря на важную роль ГАМК-рецепторов в механизме действия бензодиазепинов зависимость эффектов диазепама от плотности ГАМК-рецепторов мозга в суточном ритме изучена недостаточно.
Материалы и методы
Опыты были поставлены на белых беспородных крысах-самцах. Диазепам первой груп-
пе животных (п=10) вводили однократно внут-рибрюшинно в дозе 10 мг/кг веса [8], [15] в 7 часов 30 минут, второй (п=10) - в 19 часов 30 минут. Контрольные животные получали внут-рибрюшинно 0,2 мл физиологического раствора в те же часы (п=20). Опытных и контрольных крыс после инъекции тестировали методом «открытое поле» через каждые 4 часа в течение суток [5].
В индивидуальном поведении крыс выделяли: П - «перемещение», т. е. поступательное перемещение тела в горизонтальной плоскости; С - «сидит»; Ф - «фризинг», т. е. неподвижность. В дальнейшем расчитывали объёмы паттернов (доля одного паттерна среди других поведенческих паттернов с учётом длительности эксперимента) и вычисляли интегральный критерий - коэффициент подвижности по формуле Кп=П/С +Ф [3].
Для изучения плотности ГАМК-рецепто-ров использовали радиолиганд [14С-ГАМК] (224 Сі/шшоі, АшегсЬаш, Англия). Животных забивали декапитацией, выделяли мозг, измельчали ножницами, продавливали через поршневой измельчитель, добавляли суспендирующую среду, в качестве которой использовали 0,25 М раствор сахарозы, приготовленный на 50 мМ трис-НСі буфере (рН 7,4). Ткань мозга растирали в гомогенизаторе Поттера-Эльвейема в течение двух минут при скорости вращения тефлонового пестика 1500 об/мин. Учитывая высокую чувствительность ГАМК-рецепторов к повышению температуры, все манипуляции проводили строго на холоде [16]. Полученный гомогенат фильтровали для освобождения от не-
разрушенных клеток и использовали для выделения мембранной фракции.
С целью получения биологического материала, содержащего наибольшее количество рецепторов гамма-аминомасляной кислоты, выделяли частично очищенную мембранную фракцию методом дифференциального ультрацентрифугирования в гомогенной среде [4].
Полученную фракцию гомогената мозга разводили 50 мМ трис-НС1 буфером (рН 7,4) и использовали для определения мест связывания [14С-ГАМК]. Определение уровня связывания ГАМК со специфическими рецепторами мозговой ткани проводили радиолиган-дным методом с небольшими модификациями
[14], [16], [20].
Для определения уровня общего связывания аликвоты мембранных препаратов с конечным содержанием белка в инкубационной смеси 0,3-1мг/мл инкубировали в триплете с [14С-ГАМК] в концентрации 11,6 нМ.
Объем инкубационной смеси составил 1 мл. Инкубацию проводили 40 мин при 250С в 50 мМ трис-НС1 буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.
Для определения уровня неспецифического связывания реакцию проводили точно так же, но в присутствии 1000-кратного избытка немеченого ГАМК. Реакция была остановлена путем фильтрования проб через фильтры GFC. Фильтры просушивались и помещались во флаконы с 5 мл сцинтиляционной жидкости на основе диоксана. Через 48 часов радиоактивность растворов была измерена на счетчике импульсов Бета-2. Разница между средними величинами общего и неспецифического связывания соответствует специфически связанному лиганду. Белок определяли по Лоури [19].
Содержание мест связывания выражали в фемтомолях лиганда (10-15 М), специфически связанного с 1 мг белка.
Для определения суточных колебаний плотности ГАМК-рецепторов в головном мозге, изучали динамику специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ интактных крыс в течение суток через каждые 4 часа.
Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики [12]. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием ^критерия Стью-дента и непараметрического критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия при
уровне значимости р < 0,05. Ритмологическую обработку данных осуществляли, вычисляя ме-зор и размах колебаний [9]. Использовали пакеты стандартных программ статистического анализа.
Результаты и обсуждения
Сравнение суточной динамики КП крыс, получивших диазепам в 19:30 с КП контрольных животных выявило значительные различия. Так суточная динамика коэффициента подвижности (КП) в контрольной группе описывалась одногорбой кривой (рис.1). Высокие значения КП отмечали в вечернее и ночное время..Мак-симальное значение коэффициента наблюдалось в 20 часов (5,637). В 12 часов двигательная активность контрольных животных была минимальной (0,389). Среднесуточное значение интегрального критерия составило 1,947, размах колебаний равнялся 5,248. В целом, наши результаты согласуются с данными других авторов, которые также отмечали наличие суточных изменений двигательной активности грызунов [6].
У животных, подвергшихся действию диазепама, в 20 часов отмечалось резкое снижение двигательной активности (0,403), КП опыта стал ниже контрольного (5,637) в 14 раз. Подавляющее влияние бензодиазепина сохранилось и в ночные часы, опытные данные в 24 часа были меньше контрольных более чем в 9 раз (опыт - 0,408, контроль - 3,917). О более выраженном действии диазепама при вечернем введении свидетельствуют и другие авторы. Так, введение диазепама в дозе 0,5 мг/кг в вечерние часы у самцов и самок крыс вызывало отчетливое антиконфликтное действие [10].
В целом, под влиянием исследуемого препарата произошло уплощение кривой суточной динамики КП, значительно снизился размах колебаний и почти в 5 раз уменьшился мезор, сместилась акрофаза.
В последующие сутки определяли влияние утреннего введения препарата на суточную динамику интегрального критерия (рис. 2).
Введение диазепама в утренние часы изменило характер суточной динамики КП. Если в контрольной группе она была представлена двугорбой кривой, то в опытной уже описывалась одногорбой. Под действием диазепама двигательная активность снизилась в утренние и
в
ч
-&
-&
Г)
о
а
Время суток (суток)
—д— опыт —•— контр
Рисунок 1. Суточная динамика коэффициента подвижности при вечернем введении диазепама Примечание.* - достоверность различий по сравнению с контролем (р < 0,05). Представлены средние данные (М) из 6-10 опытов.
0 и
аё
5
1 ■& ■& т о И
Время суток (часы) к— опыт —ф— контр
Рисунок 2. Суточная динамика коэффициента подвижности при утреннем введении диазепама Примечание. * - достоверность различий по сравнению с контролем (р < 0,05). Представлены средние данные (М) из 7-10 опытов.
Время суток (ч асы)
Рисунок 3. Суточная динамика специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ Примечание. * - достоверность различий по сравнению с максимальным значением (р < 0,05). Представлены средние данные из 6-7 опытов в % от максимального значения.
ранне-дневные часы. Отсроченный и максимальный эффект наблюдался в 20 часов, препарат снизил КП до 0,237, что было ниже контроля почти в 19 раз (4,434). В остальные сроки достоверных отличий между КП опытных и контрольных крыс не выявлено. Размах колебаний значений двигательной активности в опыте составил 5,723, мезор интегрального критерия был равен 1,689, что не отличается от контроля.
Таким образом, утреннее введение диазепама дважды подавляет двигательную активность крыс(сразу после введения и в 20 часов) и изменяет характер суточной кривой.
Полученные результаты согласуются с данными ряда авторов. Так по результатам исследований Э.Б. Арушанян и Э.В.Бейер [2] у хомяков и крыс диазепам и коротко действующий бензодиазепиновый препарат триазолам способны на несколько десятков минут смещать фазу циркадианной локомоции. Исследования других авторов также свидетельствуют о том, что выраженность и характер действия бензо-диазепинов зависят от времени суток, в которые они были введены [1], [11].
Так как фармакологический эффект лекарственных средств зависит от аффинности и
плотности их специфических рецепторов, мы исследовали характер изменений количества ГАМК-рецепторов головного мозга в течение суток.
Максимальный уровень связывания[14С]-ГАМК наблюдался в 20 часов, далее он постепенно снижался (рис. 3). В 24 часа и 4 часа показатели специфического связывания [14С]-ГАМК составили 64,8% и 82,8% от максимального значения соответственно, в 8 часов - 13,3%. Минимальная плотность сайтов связывания ГАМК определялась в 12 часов (9,9%).
Выводы
Установлено, что плотность ГАМК-рецепторов головного мозга изменяется в течение суток. Увеличение количества рецепторов отмечается в вечерне-ночные часы.
Максимальное подавляющее действие препарата на двигательную активность грызунов отмечается при вечернем введении на фоне максимальной плотности ГАМК-рецепторов головного мозга. При утреннем введении действие проявляется дважды: непосредственно после введения и в вечерние часы, на фоне увеличения количества рецепторов.
14.04.2014
Список литературы:
1. Арушанян Э.Б. Хронобиологические особенности невротических расстройств и анксиолитического эффекта психотропных средств // Российский психиатрический журнал. 2000. №1. - С. 27-32.
2. Арушанян Э.Б., Бейер Э.В. Хронобиологические особенности антистрессорного действия анксиолитических средств // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1998. Т.61. №6. - С. 13-16.
3. Атрошенко О.Н., Лосев А.С., Садыков Р.Ф. [и др.] Влияние беметила, этомерзола и тиеназола на индивидуальное поведение мышей // Здравоохранение Башкортостана. 1999.№2. - С. 53-58.
4. Биологические мембраны /под ред. Дж. Финдлей и У. Эванса. М.: Мир, 1990. - 422 с.
5. Воронина Т.А., Молодавкин Г.М., Бабаев И.И., Смирнов Л.Д. Изучение антистрессорного и анальгетического эффектов мексидола, диазепама, парацетамола и их комбинаций // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006. Т. 69. №4. - С. 6-9.
6. Ердаков Л.Н. Организация ритмов активности грызунов. Новосибирск: Наука, 1984. - 115 с.
7. Зиновьева О.Е., Катушкина Э.А., Мозолевский Ю.В., Голубева В.А., Шенкман Б.С., Чистяков И.Н., Подлубная З.А., Вихлянцев И.М., Яхно Н.Н. Синдром ригидного человека: вопросы патогенеза и лечения // Неврологический журнал. 2009. Т.14. №1. - С. 11-17.
8. Кожечкин С.Н. Сравнительная электроэнцефалографическая оценка анксиолитиков ацефабола и диазепама на инбред-ных крысах линий MR и MNRA с разным уровнем тревожности освещения // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2003. Т.66. №2. - С. 38-15.
9. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. Москва: Триада-Х, 2000. - 488 с.
10. Манвелян Э.А., Батурин В.А. Половые различия в действии диазепама у крыс в тесте конфликтной ситуации // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2008. Т.71. №4. - С. 11-13.
11. Мезенцев В.Е., Ларионов Л.П. Зависимость фармакологического эффекта нейро- и психотропных средств от состояния временной организации рецепторов // Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств: Сборник тезисов докладов I Съезда Российского научного общества фармакологов. Волгоград, 9-13 октября 1995 г. -М., 1995. - С. 274.
12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. Москва: Медиасфера, 2002. - 312 с.
13. Тюренков И.Н., Перфилова В.Н. Роль ГАМК-рецепторов в развитии патологических процессов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2011. Т.74. №2. - С. 47-52.
14. Agle M.W., Dunn M.N. Kinetics of [3H]-muscimol binding to the GABAA-receptor in bovine brain membrane // Biochemistry. 1989. Vol.28. - P.275-285.
15. Flaishon R., Halpern P., Sorkine P. [et al.] Cross-sensitivity between isoflurane and diazepam: Evidence from a bidirectional tolerance study in mice // Brain Res. 1999. Vol. 815. No. 2. - Р. 287-293.
16. Grandison L., Cavagnini F., Schmid R. Aminobutiric acid and benzodiasepine - binding sites in human anterior pituitary tissue // Endocrinol. And metabol. 1982. Vol. 54. No. 3. - P. 597-601.
17. Gusev A.G., Swadlow H. А. The impact of 'bursting' thalamic impulses at a neocortical synapse // Nature Neurosci. 2001. Vol. 4. No. 4. - Р.402-408.
18. Gelatti U., Samani F., Donato F., Covolo L., Mazzaglia G., Cremaschini F., Simon G.. Leggieri G., Balestrieri M. Health-related quality of life in older people using benzo-diazepines: A cross-sectional study // Ann.ig.: Med prev e comunita 2006. Vol. 18. No. 4. -P. 313-326.
19. Lowry.H., Rosenbrough N.J., Farr L. [et al.] Protein meagument with Folin phenol reagent // ^ralChem. 1951. Vol. 193. No. 1. -Р. 265-275.
20. Shyder S.H., Enna S.J. Properties of у -aminobutyris asid (GABA) receptor binding in rat brain synaptic membrane fractions // Mol. Pharmacol. 1977. Vol. 13. - P. 442-453.
21. Vekovischeva Olga, Uusi-Oukari Mikko, Korpi Esa R. Tolerance to diazepam-induced motor impairment. A study with GABAa receptor a6 subunit knockout mice // Neurochem. Res. 2003. Vol. 28. No. 5. - P. 757-764.
Сведения об авторах:
Валеева Лиля Анваровна, декан фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета, доктор медицинских наук, профессор E-mail: admin@bgmy.ru
Кулагина Ирина Геннадьевна, доцент кафедры биологической химии Башкирского государственного медицинского университета, кандидат биологических наук E-mail: coolagin@list.ru
Яфаева Эльвира Гумеровна, старший методист фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета, кандидат медицинских наук
E-mail: yagret@mail.ru
450000, г.Уфа, ул.Ленина, д.3
