Временная организация рецепторов гамма-аминомасляной кислоты головного мозга крыс Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

Физиологические исследования

УДК 616-092.9:57.034:577.3:547.466.34:612.8[32]

Л.А. Валеева, И.Г. Кулагина, Э.Г. Яфаева

ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РЕЦЕПТОРОВ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

Представлена целостная картина хронобиологической организации Г АМК-рецепторов головного мозга интакт-ных крыс. Установлено, что суточная динамика количества мест связывания [14С]-ГАМК в основном имеет два пика - вечерний и ночной, причем зимой и весной преобладал ночной пик, а летом - вечерний. Г одовая динамика характеризовалась значительным повышением количества рецепторов с апреля по август, с максимумом в августе. Минимальное значение показателя отмечалось в марте.

Ключевые слова: хронобиологическая организация, ГАМК-рецепторы, головной мозг.

Биологические ритмы являются детерминантами, которые определяют оптимальное приспособление организма к окружающим условиям. Биоритмы разных уровней целостного организма не синхронны, имеют сложную структуру. Основное внимание уделяется околосуточным и сезонным биоритмам, так как именно в эти периоды наиболее отчетливо улавливаются изменения реактивности организма [1]. Десинхронизация биологических ритмов отдельных органов может провоцировать состояние напряжения, которое со временем трансформируется в то или иное заболевание [2; 3]. Сезонный и суточный характер обострений эпилепсии, депрессии, неврозов исследователи также связывают с изменением структуры и периода биоритмов. Отмечено, что в заболеваемости шизофренией обнаружена выраженная сезонность - начало манифестации заболевания чаще приходится на ранний весенний и поздний осенний месяцы [4], а количество алкогольных психозов существенно повышается с марта по июль (по данным А.В. Немцова и др. [5]).

Одним из важнейших нейромедиаторов головного мозга является ГАМК. Подтипы ГАМК-рецепторов (ГАМКавс ) найдены в различных отделах головного мозга, изучены их свойства [6-10]. Связываясь со специфическими рецепторами, ГАМК участвует в формировании рабочей памяти [11], вовлечена в комплекс изменений двигательной, исследовательской и эмоциональной активности [12-14]. ГАМК используется для коррекции поведенческих реакций на моделях эпилепсии, хронического болевого синдрома [15]. Однако ритмическая организация ГАМК-ергической системы мозга изучена недостаточно.

Хронобиологический подход позволяет лучше понять патогенез заболеваний, а разработка хро-нофармакологичеких схем - повысить эффективность и безопасность применения лекарственных средств [16].

Поэтому целью нашего исследования явилось определение суточных и сезонных колебаний количества ГАМК-рецепторов в головном мозге.

Материалы и методы исследования

Опыты были поставлены на 440 белых беспородных интактных крысах-самцах. Крыс забивали декапитацией под лёгким эфирным наркозом. Выделяли мозг, промывали 0,25М раствором сахарозы, приготовленным на трис-НС1 буфере. Помещали его в стеклянный гомогенезатор Поттера-Эльвейема, добавляли суспендирующую среду. В качестве последней использовали 0,25М раствор сахарозы, приготовленный на 50 мМ трис-НС1 буфере, и гомогенезировали в течение двух минут при скорости вращения тефлонового пестика, равной 1500 об/мин. Все манипуляции проводили быстро, строго на холоде (на льду).

С целью получения биологического материала, содержащего наибольшее количество рецепторов гамма-аминомясляной кислоты, выделяли частично очищенную мембранную фракцию.

Мембранную фракцию гомогената мозга (МФГМ) получали методом дифференциального центрифугирования в гомогенной среде [2]. Качество мембранной фракции контролировали методом

электронной микроскопии. Полученную фракцию гомогената мозга разводили 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,4) и использовали для определения мест связывания [14С]-ГАМК.

Определение уровня связывания ГАМК со специфическими рецепторами мозговой ткани проводили радиолигандным методом с небольшими модификациями [17-19]. Для определения уровня общего связывания [14С]-ГАМК мозговой тканью аликвоты мембранных препаратов с конечным содержанием белка в инкубационной смеси 0,3-1 мг/л инкубировали в триплете с [14С]-ГАМК в концентрации 11,6 нМ (224 Ci/mmol, Amercham, Англия). Объем инкубационной смеси составил 1 мл. Инкубацию проводили 40 мин при 250С в 50 мМ трис-HCl буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА.

Для определения уровня неспецифического связывания реакцию проводили точно так же, но в присутствии 1000-кратного избытка немеченого ГАМК. Реакция была остановлена путем фильтрования проб через фильтры GFC. Фильтры просушивались и помещались во флаконы с 5 мл сцинтиля-ционной жидкости на основе диоксана. Через 48 ч радиоактивность растворов была измерена на счетчике импульсов Бета-2. Разница между средними величинами общего и неспецифического связывания соответствует специфически связанному лиганду. Белок определяли по Лоури [20].

Содержание мест связывания выражали в фемтомолях лиганда (10-15 М), специфически связанного с 1 мг белка. Эту величину рассчитывали по формуле

N=DPM5^DPM—ф

K • Сб ,

где N - количество специфических участков связывания, определяемое при данной концентрации [14С]-ГАМК фмоль/мг белка;

БРМ общ. - средняя величина общего (в отсутствие конкурента) связывания меченого лиганда аликвотой мембранного препарата (распад/мин);

БРМ неспециф. - средняя величина неспецифического связывания в присутствии конкурента (расп/мин);

К - коэффициент пересчёта связанного лиганда из распад/мин в фмоль, зависящий от удельной радиоактивности лиганда;

Сб - концентрация белка в 1 мг/л .

Для определения суточных биоритмов плотности ГАМК-рецепторов в головном мозге изучали динамику специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ интактных крыс в течение трех суток через каждые 4 часа.

Для изучения характера изменений суточных ритмов плотности ГАМК-рецепторов мозга в течение года определяли суточную динамику специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ ин-тактных крыс ежемесячно в течение года в одни и те же числа каждого месяца.

Для выявления годовых колебаний плотности ГАМК-рецепторов помесячно определяли динамику специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики [21]. Оценку значимости различий средних арифметических проводили с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05. В таблице приведены средние величины со стандартной ошибкой (M±m). Ритмологическую обработку данных осуществляли вычисляя мезор и размах колебаний. Использовали пакеты программ статистического анализа «Statistica for Windows», разработанного на основе программы «Statsoft» и «Biostat».

Результаты и их обсуждение

Результаты экспериментов по изучению суточной динамики специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ в течение трех суток представлены на рис. 1. В первые сутки динамика специфического связывания меченого лиганда описывалась двугорбой кривой с пиками в 16 и 24 ч. Для исключения случайного характера колебаний мы повторили суточные эксперименты в последующие два дня. Во вторые сутки пик сайтов связывания в 16 ч оставался таким же высоким, но второй пик перемещался на раннеутреннее время - 4 часа, и значительно превосходил ночное повышение первых суток. В последующие, третьи, сутки максимальное значение специфического связывания меченого

лиганда наблюдали в 16 ч, как и в предыдущие двое суток. Высокое значение специфического связывания [14С]-ГАМК отмечалось в 20 ч.

В целом опыты по специфическому связыванию [14С]-ГАМК с МФГМ крыс выявили устойчивые и повторяющиеся в течение трех суток колебания уровней связывания. Первое повышение регистрировалось в 16 ч; второе - в 24 ч и могло перемещаться на 4 ч в последующие сутки.

0)

I

ГО

ш ^

.0 ^

п

ш

о 1_ <и в ° ^ О О £ ^ ?д

Время суток

-О--1-е сутки; ■ -2-е сутки;--А—3-и сутки

Рис. 1. Суточная динамика специфического связывания [14С]-ГАМК с мембранной фракцией гомогената мозга интактных крыс в течение трех суток

Также мы проанализировали средние значения специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ крыс за трое суток (табл.). В 8 ч наблюдался минимальный уровень специфического связывания (17,09±2,34 фмоль/мг белка). В 12 ч показатель увеличился до 61,85± 9,55 фмоль/мг белка. А в 16 ч определялся максимальный уровень сайтов связывания (249,42±40,26 фмоль/мг белка). В последующие часы отмечалось снижение значений, в 20 ч связывание составило 122,76±21,39 фпмоль/мг белка, в 24 ч 40,82±7,67фмоль/мг. В 4 ч уровень специфического связывания [14С]-ГАМК составил 64,92±11,17 фмоль/мг белка.

Динамика специфического связывания [14^-ГАМК с мембранной фракцией гомогената мозга интактных крыс в течение суток (средние данные за трое суток)

Время су- 8.00 12.00 16.00 20.00 24.00 4.00 Средне-

ток (часы) суточный уровень

Связанный 17,09 61,85 249,42 122,76 40,82 64,92 92,86

[14с]- +2,34 +9,55 +40,26 +21,39 +7,67 +11,17 ±16,41

ГАМК ** * * * * *

(фмоль/мг белка) ** **

Примечание. Представлены средние данные (М±т) из 18 опытов в фмоль/мг белка: * - достоверность различий по сравнению с минимальным значением (р< 0,05);** - достоверность различий по сравнению со среднесуточным значением (р< 0,05).

Таким образом, суточные биоритмы уровня специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ крыс характеризовались повышением значений в 16 ч. Максимальным уровень связывания был в 16 ч, минимальным - в 8 ч.

Суточная динамика количества ГАМК рецепторов головного мозга изменялась на протяжении года (рис. 2).

К

СО

о

часов часов часов

декабрь

Время суток январь ••-афевраль

Время суток

Время суток

март

апрель

июль август

часов часов часов часов часа

сентябрь

Время суток

I--октябрь - --А - -■ноябрь

Рис. 2. Изменения суточной динамики специфического связывания [14С]-ГАМК с мембранной фракцией гомогената мозга интактных крыс в зависимости от месяца года

В зимние месяцы суточная динамика уровня связывания лиганда описывалась двугорбой кривой с пиками в 16 ч и 24 ч, за исключением декабря, когда дневной пик перемещался на 8 ч утра. Весной кривая специфического связывания меченого лиганда также имела два пика - в 16 ч и 24 ч, лишь в апреле суточная динамика количества сайтов связывания лиганда имела один пик, который приходился на 24 ч. Максимальный уровень связывания [14С]-ГАМК в зимние и весенние месяцы приходился на ночное время. В июне колебания специфического связывания [14С]-ГАМК были незначительными на протяжении суток, но в 4 ч уровень связывания резко повысился. В июле и августе динамика количества сайтов связывания приобрела двугорбый характер. Первый пик июля отмечали в 16 ч, в августе - в 20 ч. Второе повышение уровня связывания отмечалось в 4 ч и в 24 ч соответственно. Летние месяцы характеризовались низким значением уровня связывания [14С]-ГАМК в 8 ч утра. В осенние месяцы кривая специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ имела различный характер - в сентябре и октябре она имела двугорбый характер, однако дневной пик с 12 ч в сентябре перемещался на 16 ч в октябре, а вечерний пик с 20 ч в сентябре - на 24 ч в октябре. Ноябрь характеризовался одним повышением специфического связывания лиганда в 8 ч утра.

Резюмируя вышесказанное, можно прийти к выводу, что суточная динамика числа ГАМК-рецепторов в головном мозге интактных крыс зависит от сезона года. Почти во все месяцы года имеется два пика повышения данного показателя: в зимний и весенний периоды - в 16 и 24 ч, в летний период в 16-20 ч и раннеутреннее время - 4 ч. В апреле, июне, июле и ноябре наблюдался только один пик. Максимальный уровень связывания [14С-ГАМК] с МФГМ в основном приходился на ночные часы, и лишь в ноябре на 8 ч, а в мае и августе на 16 ч.

Ежемесячное определение уровня специфического связывания с МФГМ позволило выявить годовую динамику плотности ГАМК-рецепторов головного мозга.

Как показано на рис. 3, в январе, феврале и марте уровень связывания ГАМК был низким и составил в январе 12,8%, в феврале - 10,9% от максимального значения. Наименьшие величины были отмечены в марте (8,7%). В апреле уровень связывания ГАМК повысился до 63,5% от максимального значения. В мае в годовой динамике наблюдался первый пик, уровень специфического связывания ГАМК увеличился до 84,2%. В июне показатель связывания лиганда составил 66,2%. В июле количе-

Временная организация рецепторов гамма-аминомасляной кислоты. БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

ство мест связывания повысилось до 88,4%. В августе отмечалось максимальное значение специфического связывания в годовой динамике. В осенние месяцы отмечался спад уровня связывания; в сентябре уровень связывания лиганда составил 46,2%, в октябре - 40,1%, в ноябре - 36,4%, в декабре снижение показателя специфического связывания усугубилось (16,7% от максимального значения).

Итак, в течение года кривая специфического связывания [14С]-ГАМК с МФГМ интактных крыс описывалась двугорбой кривой с пиками в мае и августе. Минимальный уровень связывания лиганда отмечали в марте.

В целом годовая динамика специфического связывания [14С]-ГАМК характеризовалась значительным повышением показателя в теплое время года (май-август), что свидетельствует о росте количества ГАМК-рецепторов головного мозга в данное время года. Низкие значения количества ГАМК-рецепторов отмечались с декабря по март. В целом высокий уровень специфического связывания [14С]-ГАМК в течение года наблюдали в ранневесенний и летний периоды с резким понижением в осенние и зимние месяцы. Максимальный уровень связывания радиолиганда наблюдали в августе, минимальный - в марте.

<

О £

О ^

М

я

Ш О

2

м

к

ш

о

Месяцы

Рис. 3. Годовая динамика специфического связывания [14С]-ГАМК с мембранной фракцией гомогената мозга интактных крыс

Выводы

1. Количество ГАМК-рецепторов в головном мозге экспериментальных животных подвержено суточным колебаниям. Максимальное значение показателя приходилось на 16 ч, минимальное - на 8 ч утра.

2. Характер суточной кривой ГАМК-рецепторов головного мозга изменяется в течение года. Максимальная плотность ГАМК-рецепторов в суточном ритме выявлена в большинстве месяцев года в вечерне-ночные часы.

3. Число ГАМК-рецепторов в мозге крыс изменяется на протяжении года. Высокий уровень функциональной активности ГАМК-рецепторов наблюдали в ранневесенний и летний периоды с резким понижением в осенние и зимние месяцы. Максимальный уровень показателя по связыванию радиолиганда отмечали в августе, минимальный - в марте.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гайдук В.Е. История биоритмологии, современные проблемы // Биологические ритмы: Междунар. науч.-практ. конф. Беловежская пуща, 1999. С. 13-16.

2. Биологические мембраны / под ред. Дж. Финдлей, У. Эванса. М.: Мир, 1990. 422 с.

3. Арушанян Э.Б. Некоторые аспекты хронофармакологии сердечно-сосудистых средств // Эксперимент. и клиническая фармакология. 2000. Т.63, №6. С. 67-75.

4. Фридман С.Я. Фармакологические стратегии для улучшения когнитивной деятельности при шизофрении // Журн. неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2000. №4. С. 79.

5. Немцов А.В., Нечаев А.К. Сезонность заболеваемости алкогольными психозами // Журн. невропатологии и психиатрии. 1999. Т. 99, №8. С. 43-47.

6. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы. М.; Волгоград, 1999. 640 с.

7. Aller M. I. Distribution of the GABAa receptor complex /32/3 subunits in the brain of the frog Rana pipiens / Maria Isabel Aller, Skirmantas Janusonis, Katherine V. Fite, ArsenioV Fernandez-Lopez // Neurosci. Lett. 1997. Vol. 225, №1. P. 65-68.

8. Bryans J. S., Wustrow D. J. 3-Substituted GABA analogs with central nervous system activity: A review // Med. Res. Rev. 1999. Vol. 19, № 2. P. 149-177.

9. Canton H., Emeson R., Barker E. Identification, molecular cloning and distribution of a short variant of the 5-hydroxytryptamine 2C-receptor produced by alternative splicing // Mol. Pharmacol. 1996. Vol. 50, №4. P. 799807.

10. Pin J.-Ph. , Prezeau L. Allosteric Modulators of GABAb receptors :mechanism of action and therapeutic perspective // Current Neuroparmacology. 2007. №.5. P.195-201.

11. Williams G., Srinivas G., Patricia S., Goldman R.Destruction and creation of spatial tuning by disinhibition: GABAA blockade of prefrontal cortical neurons engaged by working memory // J. Neurosci. 2000. Vol. 20, №1. P. 485-494.

12. Герштейн Л.М., Доведова Е.Л., Попова Н.С., Качалова Л.М., Монаков М.Ю., Сергутина А.В. Морфохимические перестройки в коре больших полушарий мозга крыс и особенности поведения животных, вызванные синтетическим ГАМК-производным в условиях «дофаминовой патологии» // Нейрохимия. 2001. T. 18, №94. С. 304-309.

13. Якимовский А.Ф., Редька Ю.А., Якубенко А.Л. Блокада метаботропных рецепторов глутамата 5-го типа предупреждает нарушения двигательного поведения, вызванного внутристриарным введением пикротокси-на у крыс // Журн. высшей нервной деятельности. 2010. Т.60, №1. С. 90-97.

14. Kriem B., Cagniard B., Bouquet C. [et al.] Modulation by GABA transmission in the substantia nigra compacta and reticulata of locomotor activity in rats exposed to high pressure // NeuroReport. 1998. Vol. 9, №7. P. 1343-1347.

15. Wallace R. Mutations in GABA receptor genes cause human epilepsy // Lancet. Neurol. 2002. Vol. 1, №4. P. 212.

16. Трошин В.Д. Теоретико-методологические основы профилактики нервных и психических болезней // Журн. неврологии и психиатрии им. Корсакова. 2000. №2. С. 45.

17. Agle M.W., Dunn M.N. Kinetics of [3H]-muscimol binding to the GABAA-receptor in bovine brain membrane // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 275-285.

18. Grandison L., Cavagnini F., Schmid R. Aminobutiric acid and benzodiasepine - binding sites in human anterior pituitary tissue // Endocrinol. And metabol. 1982. Vol. 54, №3. P. 597-601.

19. Enna S.J., Shyder S.H. Properties of y-aminobutyris asid (GABA) receptor binding in rat brain synaptic membrane fractions // Mol. Pharmacol. 1977. Vol. 13. P. 442-453.

20. Lowry O.H. Rosenbrough N.J., Farr L. [et al.] Protein meagument with Folin phenol reagent // J^iol.Chem. 1951. Vol. 193, №1. Р.265-275.

21. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М.: Медиасфера, 2002. 312 с.

Поступила в редакцию 20.04.11

L.A. Valeyeva, I. G. Kulagina, E. G. Yafayeva

Chronobiological organization of gamma-aminobutyric acid receptors in rat brain

The article gives a coherent presentation of chronobiological organization of gamma-amino-butyric acid (GABA) receptors of the intact rat brain. The circadian dynamics of C-GABA binding sites number has been found to normally have evening and night peaks, with the evening peak being predominant in summer and the nocturnal peak prevailing in winter and spring. Specific of the annual dynamics, a significant increase in the receptor number in April through August, with its maximum occurring in August, was observed. The minimal parameter value was registered in March.

Keywords: chronobiological organization, GABA receptors, brain.

Валеева Лилия Анваровна, Valeyeva L.A.,

доктор медицинских наук, профессор doctor of medical sciences, professor

E-mail: dekanat.farm@yandex.ru E-mail: dekanat.farm@yandex.ru

Кулагина Ирина Г еннадьевна, Kulagina I.G.,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник candidate of biology

E-mail: kulagina_ig@mail.ru E-mail: kulagina_ig@mail.ru

Яфаева Эльвира Гумеровна, Yafayeva E.G.,

кандидат медицинских наук candidate of medical sciences

ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава»

450000, Россия, г. Уфа, ул. Ленина, 3

Bashkir State Medical University 450000, Russia, Ufa, Lenin st., 3