Влияние блокаторов кальциевых каналов, опиатных анальгетиков и кокаина на кальциевые токи нейронов моллюска Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

ПСИХОНЕЙРОФАРМАКОЛОГИЯ

Резюме_____________

В работе использовали метод внутриклеточного диализа и фиксации мембранного потенциала. С помощью блокаторов кальциевых каналов израдипина, нифедипина, бепридила, омега-конотоксина и гадолиния идентифицированы ^подобные кальциевые каналы нейронов прудовика (Lymnaea stagnalis). Показано дозозависимое и обратимое влияние кокаина, морфина, бупренорфина, селективного агониста к-опиатных рецепторов ^50.488^ промедола, трамадола и буторфанола

на кальциевые токи нейронов моллюска

Ключевые слова

Lymnaea stagnalis; изолированный нейрон; кальциевые каналы; гадолиний; кокаин; морфин; бупренорфин; буторфанол; ^50.488^ промедол; трамадол

© А.И. ВИСЛОБОКОВ, Ю.Д. ИГНАТОВ, В.А. БОРИСОВА, К.Н. МЕЛЬНИКОВ; 2005

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова

ВЛИЯНИЕ БЛОКАТОРОВ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ, ОПИАТНЫХ АНАЛЬГЕТИКОВ И КОКАИНА НА КАЛЬЦИЕВЫЕ ТОКИ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКА

ВВЕДЕНИЕ

В литературе обсуждаются вопросы анальгетического действия опиатов и формирования процессов зависимости людей и животных от некоторых веществ центрального действия, в частности, кокаина, морфина и др. [2, 4, 6, 7, 20]. Механизмы действия опиатов связывают с участием циклических нуклеотидов и ионов кальция, многообразная и важная роль которых, в том числе и как вторичных посредников, в клеточных и системных функциях организма общеизвестна [3, 5, 13, 19].

Имеются данные о том, что опиаты и опиоиды реализуют свой эффект через модуляцию активности различных потенциалоуправляемых ионных каналов нейрональной мембраны. Наиболее распространено представление, что такое влияние происходит опосредованно, через активацию опиатных рецепторов и связанную с ними систему внутримембранных О-протеинов и внутриклеточных посредников [7,

8, 12]. Показано, что к-агонист динорфин А избирательно и налоксо-нобратимо подавляет активность Са2+-каналов Ы-типа в нейронах ганглия заднего корешка мыши, что, в свою очередь, приводит к уменьшению амплитуды и продолжительности кальций-зависимых потенциалов действия в этих нейронах [9, 17].

Установлено, что ц-агонисты взаимодействуют с воротными частицами Са2+-каналов Ы-типа, которое приводит к замедлению активации кальциевого тока, уменьшению вероятности открытого состояния каналов и увеличению времени нахождения каналов в инактивированном состоянии [15]. Опиаты и опиоиды оказывают заметное влияние на различные типы калиевых каналов. Показана активация калиевых каналов, чувствительных к дендротоксину, при действии агониста к-опиатных рецепторов иб9593 в нейронах гиппокампа. Предполагается, что увеличение выхода калия из пресинаптических окончаний ускоряет фазу реполяризации потенциала действия и приводит к уменьшению входа ионов кальция в пресинаптические терми-нали, что, в свою очередь, вызывает уменьшение выделения медиатора пресинаптическими волокнами и нарушению синаптической передачи [7, 9, 20].

Показано, что морфин налоксонобратимо уменьшает выделение субстанции Р при антидромной стимуляции седалищного нерва, что обусловлено активацией Са2+-зависимых К+-каналов, поскольку

в присутствии блокаторов таких каналов эффект морфина не проявляется [15, 20].

998 В плазматической мембране нейронов описано 6 типов кальциевых каналов, отличающихся по ряду параметров [3, 5, 19]. Наряду со сходством аналогичных типов каналов у разных клеток и видов животных между ними имеются и некоторые различия. В соматической мембране нейронов моллюсков имеются кальциевые каналы L-, N- и T-типов, но остается не выясненным вопрос о том, какие типы кальциевых каналов преимущественно встречаются в нейронах прудовика.

Целью данной работы явилась идентификация кальциевых каналов мембраны сомы изолированных нейронов прудовика с помощью блокаторов кальциевых каналов и изучение влияния опиатных анальгетиков в различных концентрациях на кальциевые токи нейронов.

МЕТОДИКА

Объектом исследования были неидентифициро-ванные нейроны брюхоногого моллюска прудовика большого (Lymnaea stagnalis). Из тела моллюска вырезали окологлоточное кольцо нервных ганглиев, которое затем обрабатывали 0,25 % -м раствором трипсина в течение 40 мин. Подробно методика изложена нами ранее [1, 2]. Использовали растворы со следующим ионным составом (мМ):

1) наружные (перфузирующие) растворы для регистрации суммарного входящего тока: NaCl — 100; KCl— 5; CaCl2— 2; MgCl2— 1,5; Tris-OH— 2; рН =7,5 и кальциевого тока— CaCl2— 10; MgCl2— 1,5; CsCl— 100; Tris-ОН — 2; рН=7,5;

2) внутриклеточные (диализирующие) растворы для регистрации суммарного выходящего калиевого тока: KCl— 120; Tris-OH — 2; рН=7,4 и кальциевого тока: CsCl— 120; Tris-ОН— 2; рН =7,4.

Перфузирующий раствор подавался в камеру, где находился нейрон на полиэтиленовой микропипетке, а диализирующий — внутрь этой пипетки. Исследуемые вещества при регистрации кальциевых токов добавляли в перфузирующий раствор.

Для измерения трансмембранных ионных токов применяли метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала [5]. После регистрации суммарных ионных токов производили замену внутриклеточного и наружного растворов на растворы для регистрации кальциевого тока.

Выделение чистых кальциевых токов с их стабильными параметрами, которые принимали за исходные значения, осуществлялось через 3—5 мин после полной замены растворов. Затем раствор в камере, где находился нейрон, заменяли на раствор с исследуемым веществом. Когда изменения ионных токов, вызванные влиянием вещества, стабилизировались через 2—3 мин, вновь регистрировали токи. После этого раствор заменяли на исходный и наблюдали динамику восстановления кальциевых токов.

Для изучения были взяты: бепридил — неселективный блокатор Ь-каналов; израдипин и нифеди-пин — избирательные блокаторы Ь-каналов; оме-га-конотоксин О^А (далее в тексте — омега-коно-токсин) и гадолиний — селективные блокаторы Ы-каналов; морфин, бупренорфин, промедол, тра-мадол и буторфанол — агонисты различных типов опиатных рецепторов; и-50.488Н — селективный агонист к-опиатных рецепторов; а также кокаин, оказывающий разностороннее влияние на нервную систему.

Все вещества исследовали только при внеклеточном приложении в широком диапазоне концентраций от 10-12 до 10-3М.

Кривые ионных токов оценивали на экране осциллографа, вводили в компьютер и распечатывали на принтере. Строили и анализировали вольт-ам-перные, инактивационные характеристики и зависимости «концентрация-эффект». Последние были обработаны статистически с использованием 1-критерия Стьюдента. Во всех экспериментах было исследовано около 200 нейронов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Влияние бепридила, израдипина и нифедипина

На фоне регистрации стабильных параметров кальциевого тока наружный раствор заменяли на раствор с добавлением бепридила в концентрациях от 10-12 до 10-3М. Поддерживаемый потенциал оставался на уровне -100 мВ, тестирующий подбирали таким, чтобы регистрировался максимум тока (от 10 до 10 мВ).

Результаты представлены на рис. 1 (кривая 1) в виде зависимости «концентрация-эффект». Видно, что в малых концентрациях (от 10-12до 10-10 М) ток возрастал до 104 % от исходного. Небольшое подавление тока наблюдалось при действии бепри-дила в концентрации 10-9М. В более высоких кон-

С, 1*10n, M

Рис. 1

Влияние бепридила (1), гадолиния (2) и кокаина (3) на кальциевые каналы нейронов прудовика:

По оси абсцисс— концентрация веществ, по оси ординат— кальциевый ионный ток (I — при действии вещества, !0—до действия), доверительные интервалы при р = 95 %

центрациях препарат усиливал блокирующее действие. Максимальное снижение на 97 % амплитуды кальциевого тока происходило при действии беп-ридила в концентрации 10-3М. Восстановление амплитуды тока наблюдалось через 5 мин от начала отмывания, оно было не полным и дозозависимым: после действия препарата в концентрации 10-7М ток восстанавливался до 70 %, а в концентрации 10-3 М — до 8 % от исходного значения.

При действии бепридила во всех концентрациях неспецифический ток утечки мембраны, положение максимума вольт-амперной характеристики кальциевых токов на оси потенциалов, кинетика их активации и инактивации практически не изменялись. Примечательно, что блокаторы Ь-кальциевых каналов из группы дигидропиридинов — израдипин и ни-федипин в концентрациях от 10-9до 10-4 М — практически не изменяли параметры кальциевых токов.

Влияние гадолиния, омега-конотоксина и кокаина

Гадолиний в концентрациях от 10-12 до 10-7М увеличивал амплитуду кальциевого тока до 126 %, а в концентрации 10-7М подавлял ее (рис. 1, кривая2). Максимальное снижение амплитуды кальциевого тока до 1,7 % выявлено при действии гадолиния в концентрации 10-3М. Восстановление амплитуды тока происходило через 5-7 мин от начала отмывания, было не полным и дозозависимым: после действия препарата в концентрации 10-7Мток восстанавливался до 70-80 % от исходного значения, а после действия вещества в концентрации 10-3 М — лишь до 30 %. При действии гадолиния во всех концентрациях положение максимума вольт-амперной характеристики на оси потенциалов, кинетика активации и инактивации кальциевых токов практически не изменялись. Неспецифические токи утечки мембраны изменялись незначительно и неоднозначно.

Омега-конотоксин в концентрациях 10-5-10-6 М не снижал кальциевые токи, не изменялись и неспецифические токи утечки мембраны.

При действии кокаина в концентрации от 10-12 до 10-6М увеличение амплитуды кальциевого тока происходило при концентрации 10-8М до 107 % от исходного значения (рис. 1, кривая 3). Подавление тока начиналось только при его действии в концентрации 10-5М, а в более высоких концентрациях оно усиливалось. Максимальное снижение амплитуды кальциевого тока до 54,5 % от исходного значения происходило под влиянием кокаина в концентрации 10-3 М. После действия кокаина в концентрациях от 10-12до 10-5М амплитуда кальциевых токов длительное время оставалась увеличенной и лишь через 5-7 мин отмывания возвращалась к исходному значению. После действия кокаина в концентрации 10-3 М восстановление сниженной амплитуды кальциевого тока до 87 % от исходного значения происходило через 5-15 мин.

Во всех случаях максимум вольт-амперных характеристик мембраны наблюдался при тестирующем потенциале 10 мВ и при действии кокаина не смещался (рис. 2А). Однако под влиянием кокаина в концентрации 10-4М он сдвигался в сторону деполяризации вправо по оси потенциалов на 10 мВ. После отмывания в течение 10-15 мин смещение максимума вольт-амперной характеристики сохранялось. Кривые стационарной инактивации кальциевых токов под влиянием кокаина сдвигались в сторону гиперполяризации влево вдоль оси потенциалов примерно на 10 мВ, а положение инактивационных характеристик не изменялось.

Характерный пример изменений амплитуды и кинетики кальциевых токов при действии кокаина в различных концентрациях представлен на рис. 2Б. Видно увеличение тока после приложения кокаина в концентрации 10-8М (кривая 2), уменьшение его при действии кокаина в концентрации 10-3М (кривая 3) и увеличение, последовавшее

A

-30 -20 -10 0 10 20 30 40 V, mV

Рис. 2

Пример изменений кальциевых токов нейронов прудовика под влиянием кокаина:

А — изменения вольт-амперных характеристик:по оси абсцисс— тестирующий потенциал, по оси ординат— кальциевый ионный ток. 1 — контроль; 2— кокаин 10-7 М; 3— отмывание. Б — изменения кинетики и амплитуды: Т0 = Т2 = 100 мс; Т1 = 2 с. 1 — контроль ; 2 — кокаин 10-7 М; 3 — кокаин 10-3 М; 4 — отмывание

Б

после отмывания (кривая 4). Кинетику активации кальциевого тока оценивали по времени достижения его пикового значения. Так, если в норме это время составляло 13,4 мс, при действии кокаина в концентрации 10-6М— 12,0мс, то при действии кокаина в концентрации 10 -3 М — 9,4 мс, то есть наблюдалось ускорение процесса активации кальциевого тока (рис. 2). Кинетика инактивации тока в норме и при действии кокаина по визуальным оценкам может быть описана двумя экспонентами с постоянной времени порядка десятка мс у одной и сотни — у другой. При действии кокаина кинетика инактивации практически не изменялась. Неспецифические токи утечки мембраны под влиянием кокаина изменялись незначительно и разнонаправленно.

Влияние морфина, бупренорфина и U-50.488H

Морфин дозозависимо снижал кальциевый ток, начиная с концентрации 10-6М, достигая уменьшения на 29 % при концентрации 10-3 М (рис. 3). После его действия в концентрации 10-12 — 10-4М восстановление тока было полным, а после действия в более высоких концентрациях — только до 80 % от исходных величин. Нами не установлено антагонизма налоксона в действии морфина на ионные токи нейронов прудовика. Так, при совместном их применении по 500 мкМ не было устранения подавления тока морфином, он снижался на 45—50 % по сравнению с контролем, то есть примерно в 2 раза сильнее, чем при изолированном действии морфина или налоксона. Неспецифический ток утечки под влиянием налоксона и морфина уменьшался.

Бупренорфин, как и морфин, дозозависимо, но сильнее угнетал кальциевые токи (рис. 3). Так под влиянием бупренорфина в концентрации 10-3 М ток снижался почти на 56 %. После его действия в концентрациях 10-12 — 10-5М восстановление токов было полным, но после действия бупренорфина в концентрациях 10-4и 10-3М— только до 80 % от исходных величин.

Влияние и-50.488Н (рис.3) было дозозависимым, обратимым и монофазным. Подавление токов наблюдалось в концентрации 10-5 М и усиливалось в концентрации 10-2М (подавление на 43 % ). После действия препарата в концентрации 10-2 М восстановление токов происходило только до 57 % от исходных значений.

Все три вещества не изменяли кинетику активации и инактивации токов. Неспецифические токи утечки мембраны снижались на 5—7 нА, однако при действии бупренорфина этот эффект был выражен

С, 1 *10", M

Рис. 3

Влияние морфина (1), к-опиатного агониста и-50.488Н (2) и бупренорфина (3) на кальциевый ток нейронов прудовика: по оси абсцисс — концентрация веществ, по оси ординат— кальциевый ионный ток (I— при действии вещества, 10— до действия), доверительные интервалы при р = 95%

слабее и увеличение токов утечки было только на 1 нА. Вольт-амперные характеристики кальциевых токов при действии всех соединений изменялись сходным образом — снижалась амплитуда токов, но не происходило сдвига их максимума.

Влияние промедола, трамадола и буторфанола

Все препараты, как и морфин, начиная с концентрации 1 — 100 мкМ, снижали амплитуду кальциевых токов и максимально подавляли ее в концентрации 1000мкМ (рис. 4А). Буторфанол в диапазоне концентраций 10—1000 мкМ уменьшал амплитуду кальциевого тока в большей степени, чем другие вещества. Обратимость эффекта всех соединений была почти полной, но наиболее быстро и полностью амплитуда кальциевого тока восстанавливалась после действия трамадола и через 0,5—1мин отмывания составляла 99,0 ± 9,72 % от исходной величины. Кинетика тока под влиянием промедола и трамадола во всем диапазоне концентраций практически не изменялась. Было обнаружено, что лишь при действии буторфанола в высоких концентрациях (порядка 100 X 1000 мкМ) наблюдалось некоторое замедление инактивации кальциевого тока (ри-с.4Б). Все анальгетики не смещали вольт-ампер-ные характеристики кальциевых каналов по оси потенциалов, что указывает на отсутствие изменений потенциала фиксированных зарядов мембраны в области этих каналов.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что нейроны моллюсков содержат несколько типов кальциевых каналов в различных соотношениях: высокопороговые и низкопороговые, отличающиеся кинетикой их развития [5, 10, 14], которые, вероятно, можно отнести к Ь-, Ы- и Т-ти-пам каналов. Было показано, что гадолиний дозозависимо блокировал Ы-тип кальциевых каналов клеток нейробластомы в концентрациях от 0,1 до 100 мкМ. Следует отметить, что при высоких концентрациях гадолиния (100 мкМ) происходило подавление также Ь- и Т-типов кальциевых токов [11]. В наших опытах подавление Ы-тока на 50 % происходило при действии гадолиния в концентрациях 10—20 мкМ, что в принципе соответствует данным литературы. Поскольку мы исследовали более широкий диапазон концентраций от 10-12до 10-3М, то обнаружили двухфазный характер действия гадолиния на кальциевые каналы. Под влиянием гадолиния в низких концентрациях происходило увеличение амплитуды кальциевого тока, а подавление его начиналось в концентрации 10-7 М и достигало максимума при концентрации 10-3М.

Из литературы известно, что омега-конотоксин весьма специфично блокирует Ы-тип кальциевых каналов нейронов теплокровных животных, аналогично тому, как тетродотоксин подавляет натриевые каналы [21]. Нам не удалось найти данных литературы о влиянии омега-конотоксина на кальциевые каналы

АБ

С, ткМ

Рис. 4

Влияние промедола (1), трамадола (2) и буторфанола (3) на кальциевые токи нейронов прудовика.

А — зависимости «концентрация-эффект»: по оси абсцисс— концентрация препаратов (мкМ); по оси ординат— отношение амплитуды кальциевого тока при действии веществ к его величине в контроле, %.

Б — кривые кальциевого тока нейрона моллюска в контроле (1), при действии буторфанола

в концентрации 100 мкМ (2) и после отмывания нейрона (3): по оси абсцисс— время, мс; Т1 = 50 мс; Т2 = 200 мс; Т3 = 100 мс; Т4 = 1 с; по оси ординат— амплитуда

нейронов моллюсков, и мы надеялись с помощью оме-га-конотоксина заблокировать и идентифицировать 1002 Ы-тип кальциевых каналов. Однако результаты наших экспериментов оказались довольно неожиданными. Омега-конотоксин не подавлял кальциевые токи нейронов прудовика, сходные по электрофизио-логическим характеристикам с Ы-типом кальциевых токов. На этом основании можно предположить, что фармакологические свойства кальциевых каналов Ы-типа нейронов позвоночных и моллюсков отличаются. Возможно, эти различия обусловлены особенностями субмолекулярной организации каналов,то есть кальциевые каналы нейронов моллюсков не содержат специфических мест связывания для омега-конотоксина. В этом отношении отличия кальциевых каналов нейронов моллюсков от таковых у теплокровных аналогичны отличиям натриевых каналов нейронов моллюсков, не блокирующихся тетродотокси-ном, от натриевых каналов нейронов теплокровных, которые им блокируются [5, 13].

Поданным литературы, бепридил является неселективным блокатором Ь-типа кальциевых каналов [11, 13], однако каких-либо конкретных данных о его влиянии на кальциевые токи нейронов моллюсков в литературе обнаружить не удалось. Нами показано, что дигидропиридины в широком диапазоне концентраций (10-9—10-4М) не оказывают специфического блокирующего действия на кальциевые токи нейронов прудовика. Следовательно, учитывая данные литературы и результаты наших экспериментов, можно предположить, что на мембране нейронов прудовика преобладают кальциевые каналы, которые можно идентифицировать как Ы-подобные. Потенциалзависимые инактивацион-ные и вольт-амперные характеристики этих каналов, представленные в данной работе, подтверждают это предположение. Для Ь-подобных каналов процессы инактивации кальциевого тока должны бы быть более медленными.

Наши результаты о действии опиатных анальгетиков на трансмембранные кальциевые токи нейронов прудовика позволяют утверждать, что все они обладают мембранотропным действием. Установлено, что под их влиянием происходит снижение кальциевых токов. По силе блокирующего действия на кальциевые токи эти соединения можно расположить в следующий ряд:

буторфанол = бупренорфин > промедол >

> трамадол > и-50.488Н >морфин.

Можно предположить, что при действии опиатов снижается количество функционирующих каналов. Снижение ионных токов возможно также по причине уменьшения времени открытого состояния от-

дельных каналов или уменьшения частоты их открывания.

Опиаты не изменяют потенциала фиксированных зарядов на мембране, на что указывает отсутствие смещения максимума вольт-амперных характеристик мембраны, а в случае изменения оно должно происходить [5, 13]. Почти полное и достаточно быстрое восстановление ионных токов после действия препаратов свидетельствует о слабом их связывании со структурами мембраны нейронов.

В литературе есть отдельные данные об увеличении токов под влиянием кокаина [16, 18]. Быстрая обратимость влияния кокаина, которая показана нами, указывает на относительно непрочное связывание с молекулярными структурами мембраны. Отсутствие сдвига максимума вольт-амперных характеристик мембраны вдоль оси потенциалов под влиянием кокаина в концентрации 10-7 Муказыва-ет на неизменность величины потенциала фиксированных зарядов на мембране. Максимум вольт-ам-перных характеристик под влиянием кокаина в концентрации 10-4 М смещался вдоль оси потенциалов в сторону деполяризации от 0до 10 мВ. После отмывания он оставался смещенным на 10 мВ, что свидетельствует об устойчивом изменении потенциала фиксированных зарядов на мембране.

Поданным литературы, кинетика активации и инактивации кальциевого тока нейронов моллюсков имеет сложный характер и может быть описана модифицированными уравнениями Ходжкина—Хаксли [5, 10, 19]. Кинетика активации аппроксимируется переменной m в квадратичной зависимости. В принципе, изменения процесса активации кальциевого тока могут быть обусловлены множеством причин, среди которых существенными являются изменения проводимости одиночных каналов и скоростей их активации и инактивации. Ускорение процесса активации при действии кокаина, возможно, связано с непосредственным влиянием на активационные ворота, что может приводить к увеличению частоты открывания и закрывания одиночных каналов. Существенно отметить, что ускорение активации кальциевого тока происходило как при действии малых (10-6 М), так и высоких (10-3 М) концентраций кокаина. Кинетика инактивации кальциевого тока в норме может быть описана двумя экспонентами, одна из которых имеет постоянную времени в несколько десятков, а другая — в несколько сотен миллисекунд. Наша качественная оценка процесса инактивации подтверждает эти факты.

Можно высказать несколько предположений о причинах увеличения кальциевых токов под влиянием кокаина. Увеличение токов без существенных из-

менений их кинетики может быть связано с увеличением количества открывающихся при действии кокаина ионных каналов, например, с экспрессией дополнительных каналов, с противоинактивационным действием кокаина, с увеличением концентрации цАМФ. Эти предположения основаны еще и на том, что эффекты кокаина наиболее выражены на свежеизолированных нейронах и нейронах с высоким уровнем функционального состояния. Уменьшение кальциевых токов при действии кокаина в более высоких концентрациях— от 10-5 до 10-3М связано либо с насыщением липидного матрикса мембраны молекулами кокаина, в результате чего затрудняется функционирование кальциевых каналов, либо с прямым блокированием кальциевых каналов кокаином.

Наши результаты о действии опиатных анальгетиков в целом соответствуют данным литературы. В ряде исследований показано, что при внеклеточном действии морфин подавлял кальциевые трансмембранные токи, уменьшая вход Са2+ в клетку, и вызывал активацию калиевых каналов, увеличивая выход К+ из нейронов [9, 15]. Оба эти процесса приводят к гиперполяризации нейрональной мембраны, повышению порога возбудимости нервных клеток и нарушению процессов генерации и проведения возбуждения по нервному волокну. Агонисты опиатных рецепторов (в том числе ц-типа) уменьшают вход Са2+ в клетки различных структур мозга, причем этот эффект связывают с уменьшением кальциевой проводимости через потенциалозависимые кальциевые каналы [7, 9, 20].

Имеются данные и о рецептор-независимом действии морфина на мембранные токи в кардиомиоци-тах [15]. Агонисты к-опиатных рецепторов в нейронах гиппокампа вызывают активацию калиевых каналов, чувствительных к дендротоксину. Увеличение выхода калия из пресинаптических окончаний ускоряет фазу реполяризации потенциала действия и приводит к уменьшению входа ионов кальция в пресинаптические терминали, что, в свою очередь, вызывает уменьшение выделения медиатора пресинаптическими волокнами и нарушению синаптической передачи [5, 13]. Существует представление о рецепторопосредованной модуляции агонистами опиатных рецепторов функций потенциалозависимых ионных каналов через О-бел-ки и вторичные посредники [8, 17].

По нашим данным, мембранотропное влияние опиатных анальгетиков имеет сходство с влиянием на нейроны местных анестетиков. Механизм подавления токов при действии анальгетиков на потенциалоуправляемые ионные каналы, вероятно, связан с тем, что, как и при действии анестетиков, снижается количество функционирующих каналов. Снижение

ионных токов возможно также по причине уменьшения времени открытого состояния отдельных каналов или уменьшения частоты их открывания, что не 1003 отвергает возможности взаимодействия исследованных веществ с воротными механизмами каналов, о чем свидетельствуют полученные нами экспериментальные данные. Поскольку скорость активации или инактивации ионных токов определяется степенью функциональной активности соответствующих воротных структур (активационных т-ворот или инактивационных И-ворот) ионных каналов, то не исключена возможность взаимодействия этих анальгетиков непосредственно с воротными частицами кальциевых каналов и каналов задержанного калиевого тока. Такому предположению не противоречат и данные литературы. Установлено, что ц-аго-нисты взаимодействуют с воротными частицами каналов Ы-типа, что проявляется замедлением активации кальциевого тока, уменьшением вероятности открытого состояния Са2+-каналов Ы-типа и увеличением времени нахождения каналов в закрытом (инактивированном) состоянии [8, 12, 15].

Уменьшение кальциевой проводимости оказывает существенное влияние на электрофизиологические характеристики нейрональной активности не только за счет уменьшения суммарного входящего тока, но и в результате опосредованного действия ионов кальция на калиевые токи и его возвратное самоблокиру-ющее действие. В нейрональной соматической мембране присутствует особая популяция кальций-зави-симых калиевых каналов, которые активируются во время деполяризации по мере поступления ионов Са2+ внутрь нейрона по кальциевым каналам. Возможно, что снижение амплитуды выходящих калиевых токов под влиянием анальгетиков происходит вследствие их первичного блокирующего действия на кальциевые каналы и уменьшения входа в клетку ионизированного Са2+, что и приводит к нарушению процесса активации Са2+-регулируемых К+-каналов. Кроме того, ионы кальция, являясь вторичным посредником, играют ключевую роль в реализации биохимических клеточных ответов. Полученные за последние годы данные о том, что действие опиатов тесно связано с О-белками и системами вторичных посредников [8,

12], позволяют предположить, что эта связь может осуществляться и за счет модулирования этими веществами кальциевой проводимости.

Следовательно можно допустить, что анальгетики опосредованно действуют на калиевую проводимость за счет снижения концентрации ионов Са2+ в цитоплазме нервной клетки. Не исключена возможность и сочетанного их действия на калиевые каналы: как непосредственное подавление их активнос-

ти, так и опосредованное через нарушение входа ионизированного кальция. Можно предположить, 1004 что анальгетики, действуя на внесинаптическую мембрану через модуляцию активности потенциалоуправляемых кальциевых и Са2+-зависимых калиевых каналов, могут уменьшать ритмическую активность нейронов центральной нервной системы, частоту генерации ими потенциалов действия и, тем самым, угнетать передачу ноцицептивных сигналов в спинном и головном мозге. Известно, что эти каналы в мембранах нервной клетки локализуются, как правило, во внесинаптической области сомы нейрона, в районе аксонального холмика и далее по аксону, и играют ведущую роль в процессах генерации потенциала действия.

Таким образом, полученные нами результаты позволяют считать, что в нейронах прудовика преобладают Ы-подобные кальциевые каналы, функционирование которых модулируется опиатными анальгетиками и кокаином. Опиатные анальгетики непосредственно взаимодействуют с потенциалоуправляемыми ионными каналами нейрональной мембраны и могут изменять их активность помимо известного действия через специфические рецепторы.

ЛИТЕРАТУРА

1.Вислобоков А.И. и др. Мембранные механизмы действия на нервные клетки анестетиков, анальгетиков и противоарит-мических средств // Мед. акад. журн. — 2001. — Т. 1, № 1. — С. 25-33.

2. Вислобоков А.И., Савоськин А.Л. Влияние опиатных анальгетиков на потенциал-управляемые ионные каналы нейронов прудовика // Эксперим. и клин. фармакол. —

2000. — Т. 63, № 4. — С. 7-12.

3. Вислобоков А.И., Копылов А.Г., Бовтюш-ко В.Г. Кальциевые каналы клеточных мембран // Усп. физиол. наук. — 1995. — Т. 26, № 1. — С. 93-110.

4. Игнатов Ю.Д., Зайцев А.А. Нейрофизиологические механизмы боли // Болевой синдром / Под ред. В.А. Михайловича и Ю.Д. Игнатова. — Л., 1990. — Гл. 1. — С. 7-44.

5. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. — М., 1986. — 256 с.

6. Шабанов П.Д. Основы наркологии. — СПб.: Лань, 2002. — 560 с.

7. Alzheimer C., Bruggencate G.T. Nonopioid actions of the k-opioid receptor agonists U50488H and U69593 on electrophysiologie properties of hippocampal CA3 neurons in vitro // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1990. — Vol. 225. — P. 900-905.

8. Barrett C.F., Rittenhouse A.R. Modulation of N-type calcium channel activity by G-proteins and protein kinase C // J. Gen. Physiol. —

2000. — Vol. 115, N 3. — P. 277-286.

9. Bradford H.F., Crowder J.M., White E.J. Inhibitory actions of opioid compounds on calcium fluxes and neurotransmitter release from mammalian cerebral cortical slices // Br. J. Pharmacol. — 1986. — Vol. 88 — P. 87-93.

10. Chad G., Eckert R., Ewald D. Kinetics of Ca-dependent inactivacion in clamped neurones of Aplysia californica // J. Physiol. (London). — 1984. — Vol. 347. — P. 279-300.

11. Docherty R.J. Gadolinium selectively blocks a component of Ca2+ current in rodent neuroblastoma // J. Physiol. (London). —

1988. — Vol. 398. — P. 33-47.

12. Dolphin A.C. // Pharmacol. Rev. — 2003. — Vol. 55. — P. 607-627.

13. Hille B. Ion channels of excitable membranes. Third Edition. — University of Washington,

2001. — 722 p.

14. Kits K.S., Mansvelder H.D. Voltage gated calcium channels in molluscs: classification, Ca2+ dependent inactivation, modulation and functional roles // Invert. Neurosci. — 1996. — Vol. 2, N. 1. — P. 9-34.

15. North R.A. Opioid receptor types and membrane ion channels // Trends Neurosci. — 1986. — Vol. 9. — P. 114-117.

16. Premkumar L.S. Selective potentiation of L-type calcium channel currents by cocaine in cardiac myocytes // Molecular Pharmacol. — 1999. — Vol. 56. — P. 1138-1142.

17. Shen K.F., Crain S.M. Dual opioid modulation of the action potential duration of mouse dorsal root ganglion neurons in culture // Brain Research. —

1989. — Vol. 491, N 2. — P. 227-242.

18. Vislobokov A.I., Mantsev V.V., Kuzmin A.V. Cocaine, amphetamine and cathinone, but not nomifensine and pargyline increase calcium inward current in internally perfused neurons // Life Sci. —1993. — Vol. 52, N 23. — P. 261-265.

19. White G.B., Pfahnl A., Haddock S., Lamers S., Kits K.S., Mansvelder H.D. Voltage gated calcium channels in molluscs: classification, Ca2+ dependent inactivation, modulation and functional roles // Invert. Neurosci. — 1996. — Vol. 2. — P. 9-34.

20. Xiang J.Z., Adamson D., Brammer M.J., Campbell I.C. The K-opiate agonist U50488H decreases the entry of Ca into rat cortical synaptosomes by inhibiting N- but not L-type caicium channels // Neuropharmacol. —

1990. — Vol. 29, N 5. — P. 439-44.

21. Yochikami D., Bagabaldo Z., Olivera B.M. The ingibitory effects of omega-conotoxins on Ca channels and synapses // Annals N.Y. Acad. Sci. —1989. — Vol. 560. — P. 230-248.