CC BY
25
УДК 577.21
ВЛИЯНИЕ АМИОДАРОНА И ТЕПЛОВОГО СТРЕССА НА СОДЕРЖАНИЕ HSP104P И HSP101P И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE И КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ARABIDOPSIS THALIANA
1 л о л
© Д.В. Пятрикас1, И.В. Федосеева2, Е.Г. Рихванов3, Г.Б. Боровский4
1,2,3,4Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132. 2Иркутский государственный технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83.
Изучено влияние фунгицидного препарата амиодарона на жизнеспособность клеток дрожжей и растений. Установлено, что культура клеток растений более устойчива к обработке агентом, нежели дрожжи. Несмотря на то что амиодарон вызывает гибель, в тех же условиях он увеличивает содержание Hsp104p и Hsp101p в клетках дрожжей и растений соответственно. Однако изучение влияния различных тепловых обработок показало, что повышение содержания Hsp104p наблюдается лишь в тех случаях, когда не происходит гибель клеток. Вероятно, АМД нарушает механизм, регулирующий зависимость между экспрессией HSP и активацией гибели клеток. Ил. 4. Библиогр. 10 назв.
Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae; культура клеток Arabidopsis thaliana; амиодарон; Hsp104p; Hsp101p.
AMIODARONE AND HEAT STRESS EFFECT ON HSP104P AND HSP101P CONTENT AND SACCHAROMYCES CEREVISIAE YEAST CELLS AND ARABIDOPSIS THALIANA CELL CULTURE SURVIVAL D.V. Pyatrikas, I.V. Fedoseeva, E.G. Rikhvanov, G.B. Borovsky
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 132 Lermontov St., Irkutsk, Russia, 664033. Irkutsk State Technical University, 83 Lermontov St., Irkutsk, Russia, 664074.
The effect of fungicidal drug of amiodarone is studied on the yeast and plant cell survival. It is found that plant cell culture is more resistant to agent treatment than yeast. Despite the fact that amiodarone causes death, it, under the same conditions, increases the content of Hsp104p and Hsp101p in yeast and plant cells respectively. However, the study of the effect of various heat treatments showed that the increase in the content of Hsp104p is observed only in those cases when there is no cell death. It is likely that AMD disturbs the mechanism regulating the dependence between HSP expression and cell death activation. 4 figures. 10 sources.
Key worlds: Saccharomyces cerevisiae; Arabidopsis thaliana cell culture; amiodarone; Hsp104p; Hsp101p.
Температура окружающей среды является основным лимитирующим фактором для роста и развития организмов. У всех изученных организмов в ответ на действие умеренно повышенных температур реализуется специфическая программа адаптации, частью которой является остановка синтеза белков, участвующих в метаболизме при нормальных физиологических условиях и запуск экспрессии белков теплового
шока (HSP - heat shock proteins). В результате адаптации в клетке формируется устойчивость к последующему действию жесткого теплового шока, получившая название приобретенная или индуцированная термотолерантность [6]. В клетках дрожжей и растений одну из главных ролей при формировании индуцированной термотолерантности играют белки Hsp104p и Hsp101 p, соответственно. Было продемон-
1Пятрикас Дарья Валерьевна, соискатель, ведущий инженер лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Pyatrikas Darya, Competitor for a Scientific Degree, Leading Engineer of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
2Федосеева Ирина Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Fedoseeva Irina, Candidate of Biology, Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
3Рихванов Евгений Геннадьевич, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией фитоиммунологии, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Rikhvanov Evgeny, Candidate of Biology, Head of the Laboratory of Phytoimmunology, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
"Боровский Геннадий Борисович, доктор биологических наук, профессор, заместитель директора по научной работе, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Borovsky Gennady, Doctor of Biology, Professor, Vice-director, tel.: (3952) 424659, [email protected]
стрировано, что у мутантов с делецией гена HSP104 страдало развитие индуцированной термотолерантности [9]. Мутации в клетках A. thaliana, сопровождающиеся нарушением функционирования №р101р, также приводили к нарушению формирования индуцированной термотолерантности [5]. Важность этих белков показывает также то, что и ^р104р, и ^р101р необходимы для развития устойчивости не только к тепловому шоку, но и к другим типам стресса [2; 9]. На формирование термотолерантности могут также влиять различные химические соединения [8; 9], индуцирующие синтез ^р104р/^р101р, которые, потенциально, могут применяться как для изучения механизмов формирования устойчивости, так и для модулирования этого процесса в биотехнологических или сельскохозяйственных целях. Амиодарон (2-бутил-3-(3,5-дийод-4-диэтиламиноэтоксибензоил)-бензофуран, АМД) (рис. 1) широко используется в медицине в качестве антиаритмического препарата [4]. Показано, что амиодарон активирует экспрессию ряда генов в клетках дрожжей, в том числе стрессовых [10], а также вызывает изменение в балансе ионов Са2+ в клетке [3; 10], однако влияет ли амиодарон на клетки растений, пока не известно. В связи с этим, целью данной работы являлось изучение влияния амиодарона на жизнеспособность и содержание HSP в клетках дрожжей S. cerevisiae и культуры клеток A. thaliana.
использовали дрожжи S. cerevisiae штамма W303-1A (Mata ade2-1 ura3-1 his3-11,15 leu2-3,112 trp1-1 can1-100, SUC2), предоставленные кандидатом биологических наук Д.А. Кнорре (НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова). Дрожжи поддерживали при 30°С на среде YEPD (yeast extract, peptone, dextrose), содержавшей дрожжевой экстракт (0,5%), пептон (1%), глюкозу (2%) и агар (1,5%). Для проведения экспериментов клетки выращивали при 30°С в колбах емкостью 100 мл с 25 мл жидкой среды YEPD до достижения логарифмической фазы роста. Также в работе использовали культуру клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (раса Columbia), полученную из 14-дневных проростков, выращиваемую в темноте при 26°С в МС-среде, содержавшей соли по Murashige и Skoog, 3% сахарозы, 0.5 мг/мл тиамин-хлорида и 0,1 мг/л 2,4 Д. Культуру пересевали каждые 14 дней с разведением свежей средой в 6 раз. Для экспериментов использовали 8-дневную культуру, что соответствовало второй половине логарифмической фазы роста, которая характеризуется
наибольшей физиологической активностью клеток и наименьшим конститутивным уровнем синтеза HSP.
Для изучения влияния АМД на жизнеспособность дрожжей клетки рассевали по 25 мл в конические колбы объемом 100 мл и инкубировали при 30°С 60 мин в присутствии или отсутствии АМД (0-100 мкМ) или подвергали различным температурным обработкам (30°С, 39°С или 45°С). Затем клетки несколько раз промывали средой YEPD. Для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) дрожжевые клетки стандартно разводили и высевали на агаризованную среду YEPD. Через 48 ч инкубирования при 30°С подсчитывали число образующихся колоний.
Для изучения влияния АМД на жизнеспособность арабидопсиса, культуру клеток рассевали по 5 мл в конические колбы объемом 50 мл и инкубировали при 26°С 120 мин в присутствии или отсутствии АМД (0100 мкМ). Затем клетки несколько раз промывали МС-средой для удаления исследуемых веществ, ресус-пендировали в свежей среде и инкубировали при 26°С в течение 120 мин. Выживаемость клеток суспензионной культуры определяли после 48 ч инкубации при 26°С по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ) [1]. Образовавшийся формазан извлекали из клеток этанолом при 65°С в течение 15 мин. Спиртовой раствор формазана колориметрировали при 490 нм на фотоэлектроколориметре ФЭК-46. Экс-
Для изучения влияния АМД и различной температуры на содержание HSP клетки обрабатывали, как указано выше, промывали и хранили при -70°С до момента выделения белка. Клетки размораживали, ре-суспендировали в буфере для выделения белка (0,1 М Трис-HCl, 3 мМ ДДС, 1 мМ в-меркаптоэтанол, pH 7.47.6), замораживали жидким азотом и растирали с кварцевым песком. Грубые клеточные компоненты удаляли центрифугированием (15000 g, 15 мин), белок осаждали трехкратным объемом охлажденного ацетона. Осадок белка трижды промывали ацетоном и растворяли в буфере для образца (0,625 М Трис-HCl, 8 мМ ДДС, 0,1 М в-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,001% бромфеноловый синий, pH 6.8). Концентрацию белка определяли по методу Лоури. После разделения белков путем ДДС-электрофореза в 14%-ом ПААГ и переноса белков на нитроцеллюлозную мембрану, проводили иммуноблоттинг с антителами против Hsp101p («Agrisera» AS07253, Швеция), Hsp60p («US Biological» H1830-77B, США) и Hsp104p («StressGen», SPA 8040, США), визуализацию белков проводили,
Рис. 1. Структура амиодарона (АМД)
Материалы и методы исследования. В работе тинкцию рассчитывали на 1 г сырой массы.
используя в качестве вторичных антитела, конъюгиро-ванные с щелочной фосфатазой («Sigma», США).
Эксперименты повторяли не менее 3 раз. Полученные данные обрабатывали статистически: рассчитаны средние арифметические значения и их отклонения.
Результаты и их обсуждение. Амиодарон - антиаритмический препарат, используемый в медицине для лечения желудочковой аритмии и фибрилляции предсердий. Показано, что обработка амиодароном оказывает токсичное действие на клетки дрожжей [3; 4]. Для изучения влияния АМД на дрожжи штамма W303-1A S. cerevisiae использовали метод определения жизнеспособности по способности клеток образовывать колонии (колониеобразующие единицы, КОЕ) после 48 ч инкубации при 30°С. Обработка АМД приводила к гибели клеток дрожжей, которая возрастала при повышении концентрации агента. Так, если обработка 5 мкМ АМД оказывала незначительное влияние на жизнеспособность (погибало около 15% клеток), то при инкубации с 50 и 100 мкМ количество жизнеспособных клеток снижалось на 90% (рис. 1, а).
На следующем этапе изучали влияние АМД на культуру клеток A. thaliana. Для определения выживаемости культуры клеток использовали метод восстановления 2,3,5-трифенилтетразолийхлорида (ТТХ). Результаты эксперимента показали, что инкубация культуры клеток с 5 мкМ АМД не влияла на жизнеспособность клеток (рис. 1, б). Повышение концентрации агента до 50 и 100 мкМ сопровождалось снижением жизнеспособности клеток на 60 и 70% соответственно. Таким образом, клетки растений гораздо более устойчивы к воздействию АМД (рис. 1, б), нежели дрожжи, поскольку обработка клеток дрожжей 100 мкМ АМД приводила к гибели 90% клеток S. cerevisiae (рис. 1, а).
Согласно литературным данным, АМД активирует экспрессию ряда стрессовых генов у дрожжей [9]. Поэтому на следующем этапе изучали влияние АМД на
содержание HSP в клетках Б. cerevisiae. Дрожжи обрабатывали различными концентрациями АМД (0-100 мкМ) при 30°С.
Результаты эксперимента показали, что обработка АМД клеток дрожжей штамма W303-1A приводила к увеличению содержания ^р104р, которое возрастало с повышением концентрации агента (рис. 2, а). Содержание ^р60р при обработке АМД не изменялось, что позволяет использовать этот критерий в качестве показателя равномерной нагрузки белка на трек. В то же время, инкубация при мягком тепловом стрессе 39°С сопровождалась более высоким содержанием ^р104р, чем в присутствии всех концентраций АМД (рис. 2, а).
Результаты, полученные с помощью вестерн-блоттинга, показали, что при обычной температуре инкубации содержание ^р101р было незначительным, но резко возрастало при действии повышенной температуры (37°С, 120 мин) (рис. 2, б). Значительных изменений количества ^р60р в этих условиях не наблюдалось. Обработка АМД в течение 120 мин при 26°С приводила к повышению содержания ^р101р. Чем выше была концентрация агента, тем выше было количество белка (рис. 2, б). В то же время, содержание ^р101р после инкубации при 37°С было значительно выше, чем при обработке АМД.
Таким образом, АМД повышает содержание ^р104р в клетках Б. cerevisiae (рис. 2, а) и ^р101р в культуре клеток А. МаНата (рис. 2, б), и в этих же условиях происходит гибель части клеток (рис. 1). Ранее нами было показано, что в культуре клеток А. МаНапа синтез ^р101р наблюдался лишь при тех температурных воздействиях, которые не вызывали значимую гибель клеток [7].
Для того чтобы проверить, справедливо ли такое положение для клеток дрожжей, на следующем этапе изучали влияние действия различной температуры на содержание HSP и жизнеспособность клеток дрожжей. Для этого клетки дрожжей подвергали действию 30°С,
120 п
к с;
^ 100 I
о
о 80 -
ш
О 60
JQ
н о
ф
го ш
S
_0 со
40 -
20
5 50 АМД, мкм
100
к с; о
I
<u с; ш о
о о о со
120 100 80 60 40 20 0
б
-1-1-1-1
0 5 50 100
АМД, мкМ
Рис.2. Влияние АМД на жизнеспособность клеток дрожжей S. cerevisiae и культуры клеток A. thaliana
а
0
0
39 °С или 45°С в течение 60 мин и определяли жизнеспособность образовывать КОЕ. Согласно рис. 5, при 39°С жизнеспособность клеток не снижалась, в то время как обработка 45°С сопровождалась гибелью клеток. При изучении влияния различных температур на содержание HSP, повышение содержания ^р104р наблюдали только при 39°С (рис. 3, б) - температуре, не оказывающей негативного влияния на жизнеспособность клеток (рис. 3, а). При обработке дрожжей температурой 45°С, при которой часть клеток дрожжей погибала, повышения содержания ^р104р не наблюдалось (рис. 3, б).
действие на клетки дрожжей (рис. 2, а) и растений (рис. 2, б), повышает содержание №р104р (рис. 3, а) и №р101р (рис. 3, б). Следовательно, дрожжи и растения, погибая при обработке АМД, продолжают экс-прессировать некоторые из индуцибельных HSP, ответственных за развитие индуцированной термотолерантности. АМД - амфифильное соединение, которое состоит из гидрофобного кольца и гидрофильной цепи с заряженными катионными группами - аминами (рис. 1). В силу своего химического строения АМД связывается с липидным бислоем и облегчает проникновение в клетку ионов кальция [3, 10]. В свою очередь, сдвиг
Рис. 3. Влияние АМД на содержание Hsp104p, Hsp101p и Hsp60p в клетках дрожжей штамма W303-1A (а) и культуре клеток A. thaliana (б)
I-
о
140 -,
120 -
ш О
SÉ К
Б *
О X
2 О ф *
га m
л m
100 -
80 -
60 -
40
20
0
30°C 39°C 45°C
Так же, как и в случае с АМД, содержание №р60р не изменялось после инкубации при различных температурных условиях. Таким образом, увеличение содержания №р104р у дрожжей подавляется, когда тепловое воздействие начинает отрицательно влиять на жизнеспособность и эти данные подтверждают результаты, полученные на культуре клеток A. thaliana.
Однако в случае с воздействием АМД такой зависимости не наблюдается. АМД, оказывая летальное
Библиографический список
№р60р
Рис. 4. Влияние различных температур на жизнеспособность и содержание Hsp104p и Hsp60p в клетках дрожжей S. Cerevisiae
концентрации свободного кальция, вероятно, нарушает внутриклеточный механизм, регулирующий зависимость между экспрессией HSP и активацией гибели клеток.
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 8266.
1. Еникеев А.Г., Высоцкая Е.Ф., Леонова Л.А., Гамбург К.З. Об использовании 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток // Физиология растений. 1995. Т.42. С.423-426.
2. Agarwal M., Katiyar-Agarwal S., Grover A. Plant HSP100 proteins: structure, function and regulation // Plant Science. 2002. №.163. P.397-405.
3. Gupta S.S., Ton V.K., Beaudry V., Rulli S., Cunningham K., Rao R. Antifungal activity of amiodarone is mediated by disruption of calcium homeostasis // J. Biol. Chem. 2003. V.278, №31. P.28831-28839.
4. Pozniakovsky A.I., Knorre D.A., Markova O.V., Hyman A.A., Skulachev V.P., Severin F.F. Role of mitochondria in the phero-mone- and amiodarone-induced programmed death of yeast // J. Cell Biol. 2005. V.168, №2. P.257-269.
5. Queitsch C., Hong S.W., Vierling E., Lindquist S. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Ara-bidopsis // Plant Cell. 2000. V.12, №4. P.479-492.
6. Richter K., Haslbeck M., Buchner J. The heat shock response: life on the verge of death // Mol. Cell. 2010. V.40, №2. P.253-266.
7. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial crosstalk during heat shock in Arabidopsis cell culture // Plant J. 2007. V.52, №4. P.763-778.
8. Saidi Y., Finka A., Goloubinoff P. Heat perception and signalling in plants: a tortuous path to thermotolerance // New Phy-tol. 2011. V.190, №3. P.556-565.
9. Sanchez Y., Taulien J., Borkovich K.A., Lindquist S. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress // EM-BO J. 1992. V.11, №6. P.2357-2364.
10. Zhang Y.Q., Rao R. Global disruption of cell cycle progression and nutrient response by the antifungal agent amiodarone // J. Biol. Chem. 2007. V.282, №52. P.37844-37853.
