CC BY
9
Серия «Биология. Экология»
И З В Е С Т И Я
«
s
о
2014. Т. 9. С. 12-20
Иркутского государственного университета
Онлайн-доступ к журналу: http://isu.ru/izvestia
УДК 577.21
Влияние карбонилцианид м-хлорфенил гидразона на содержание Hsp104p и термотолерантность дрожжей Saccharomyces cerevisiae в зависимости от типа энергетического метаболизма
Д. В. Пятрикас, И. В. Федосеева, Е. Г. Рихванов, А. В. Степанов, Н. Н. Варакина, Т. М. Русалева, Г. Б. Боровский
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск E-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Аннотация. Изучали влияние протонофора карбонилцианид м-хлорфенил-гидразона (сагЬопу1 cyanide m-chlorophenyl hydrazone, СССР) на индукцию синтеза шаперона Hsp104p, развитие термотолерантности и продукцию активных форм кислорода (АФК) у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что кратковременная обработка СССР клеток дрожжей, использующих бродильный тип метаболизма, сопровождалась синтезом Hsp104p и развитием устойчивости к последующему жёсткому тепловому шоку. Однако в случае с добавлением агента к клеткам c окислительным типом метаболизма наблюдалось ингибирование индукции синтеза Hsp104p и термотолерантности дрожжей. Не обнаружено чёткой корреляции между эффектом СССР на синтез Hsp104p и продукцию АФК.
Ключевые слова: Saccharomyces cerevisiae, Hsp104p, термотолерантность, СССР, митохондрии.
В ответ на мягкое тепловое воздействие (тепловой стресс) в клетках эу-кариот активируется синтез специфического набора белков, называемых белками теплового шока (БТШ). Такое событие сопровождается развитием устойчивости клеток к более жёсткому тепловому воздействию (тепловому шоку) и получило название индуцированная термотолерантность [7]. Одну из ключевых ролей в развитии индуцированной термотолерантности играет шаперон Hsp104p [7]. Предполагают, что необходимым условием для активации экспрессии генов БТШ является усиление генерации активных форм кислорода (АФК). Основным источником АФК в клетках дрожжей являются митохондрии [5]. Карбонилцианид м-хлорфенил-гидразон (сагЬопу1 cyanide m-chlorophenyl hydrazone, СССР) является протонофором и ингибирует функции митохондрий, нарушая протонный градиент на внутренней мито-хондриальной мембране. Целью настоящей работы явилось изучение влия-
Введение
ния СССР на содержание Hsp104p и термотолерантность дрожжей Saccaro-myces cerevisiae в зависимости от типа энергетического метаболизма.
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. В работе использовали штамм дрожжей S. cerevisiae ¥-74-D694 (MATa ade1-14(UGA) trp1-289(UAG) his3A-200 ura3-52 leu2-3 112 [psi]), предоставленный S. Lindquist (Институт биомедицинских исследований, Уайтхед, США). Дрожжи поддерживали на среде YEPD (дрожжевой экстракт - 5 г/л, пептон - 10 г/л, глюкоза - 20 г/л) или YEPE (дрожжевой экстракт - 5 г/л, пептон - 10 г/л, этиловый спирт - 20 мл/л) [1].
Дрожжи выращивали в течение 14-16 ч при 30 °С на термостатируемой качалке (Biosan, Латвия) в колбах объёмом 100 мл с 25 мл жидкой среды YEPD или YEPE. Для проведения экспериментов использовали дрожжи, находящиеся в середине логарифмической фазы роста.
Для изучения базовой термотолерантности клетки дрожжей S. cerevisiae обрабатывали при 30 °С, затем инкубировали при 50 °С в течение 8 мин. Для развития индуцированной термотолерантности клетки дрожжей S. cerevisiae обрабатывали при 39 °С в течение 30 мин, затем инкубировали при 50 °С в течение 8 мин.
Для изучения влияния агентов на жизнеспособность клетки дрожжей S. cerevisiae инкубировали при 30 или 39 °С (30 мин) в присутствии или отсутствии CCCP, отмывали от них средой роста (3 раза), ресуспендировали в свежей среде и подвергали действию жёсткого теплового шока (50 °С) в течение 0-8 мин. Для подсчёта колониеобразующих единиц (КОЕ) суспензию клеток дрожжей S. cerevisiae десятикратно разводили и высевали на твёрдую питательную среду YEPD. Количество образовавшихся колоний учитывали спустя 48 ч инкубации при 30 °С. Жизнеспособность дрожжей определяли как процент образовавшихся колоний после определённого периода теплового воздействия к количеству колоний до теплового шока.
Флуоресцентная микроскопия. Для качественной визуализации потенциала на внутренней мембране митохондрий использовали потенциал-зависимый краситель TMRM (tetramethylrhodamine methylester) в конечной концентрации 5 мкМ. Результаты фиксировали после инкубации клеток дрожжей с красителем в течение 10 мин.
Для изучения генерации АФК с помощью метода флуоресцентной микроскопии использовали краситель H2DCF DA (2',7'-dichlorofluorescin diacetate) в конечной концентрации 5 мкМ (30 мин).
Флуоресцентную микроскопию проводили на инвертированном флуоресцентном микроскопе AxioObserver Z1 (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCam MRm3. Полученные данные обрабатывали с помощью пакета программного обеспечения для захвата и анализа изображений AxioVision Rel.4.7. В анализе использовали по 10 фотографий каждого варианта, по которым обсчитывали интенсивность флуоресценции.
Выделение суммарного белка и иммуноблоттинг. Для выделения суммарного белка клетки дрожжей обрабатывали СССР (20 мкМ), осаждали
центрифугированием, отмывали 2 раза дистиллированной водой от компонентов среды, для анализа использовали 0,5 г сырой массы. Перед выделением клетки размораживали, ресуспендировали в буфере для выделения белка (0,1 M Трис-HCl, 0,003 M ДдС-Na, 0,001 M В-меркаптоэтанол, pH 7,4-7,6), замораживали жидким азотом и растирали с кварцевым песком. Грубые клеточные компоненты удаляли центрифугированием (15000g, 15 мин), белок из супернатанта осаждали трёхкратным объёмом охлаждённого ацетона. Осадок белка трижды промывали и растворяли в буфере для образца (0,625 M Трис-HCl, 0,008 M ДДС-Na, 0,1 M В-меркаптоэтанол, 10 % глицерин pH 6,8). Концентрацию белка определяли по методу Лоури [6]. После разведения белков методом электрофореза с ДДС-Na в 12%-ном ПААГ проводили иммуноблоттинг с антителами против Hsp104p (SPA-8040, StressGen, США) и Hsp60p (US biological H1830-77B, США).
Эксперименты повторяли не менее трёх раз. Полученные данные были обработаны статистически: с помощью программы Excel рассчитаны среднеарифметические значения и их стандартные отклонения.
Результаты и обсуждение
Обработка СССР клеток с бродильным типом метаболизма (выращенных на среде с добавлением глюкозы) при 30 °C вызывала значительное повышение содержания Hsp104p. Добавление же СССР в клетки с окислительным типом метаболизма (на среде с добавлением этанола), наоборот, приводило к падению содержания Hsp104p ниже контрольного уровня. В то же время добавление CCCP во время теплового стресса (39 °C) ингибировало повышение содержания этого белка (рис. 1, а) в клетках, выращенных на обоих вариантах сред.
Так как белок Hsp104p играет ключевую роль в развитии индуцированной термотолерантности [3], в следующем эксперименте изучали влияние СССР на устойчивость клеток дрожжей к тепловому шоку в зависимости от типа их энергетического метаболизма. Предварительная обработка СССР клеток дрожжей, выращенных на глюкозе, приводила к увеличению их способности выдерживать жёсткий тепловой шок (см. рис. 1, б). Такого результата не наблюдалось при добавлении агента к клеткам, выращенным на этаноле (рис. 1, в). Полученный результат согласуется с данными иммуноблот-тинга. Обработка СССР индуцировала синтез Hsp104p (см. рис. 1, а), и это сопровождалось повышением термотолерантности (рис. 1, б).
Таким образом, хотя обработка СССР сопровождается ростом содержания Hsp104p и повышением устойчивости клеток к повреждающему действию теплового шока, однако это справедливо только для клеток, использующих бродильный тип метаболизма (рис. 1, г). В то же время присутствие СССР во время мягкого теплового стресса, наоборот, снижало индукцию синтеза Hsp104p (см. рис. 1, б) и подавляло способность клеток развивать индуцированную термотолерантность (данные не представлены).
(а)
УЕРй _УЕРЕ_
КЗО СЗО К39 С39 КЗО СЗО К39 С39
Н$р104р НврбОр
УЕРР
100
*
и с а
0 %
и я к
1
л В
УЕРЕ
100
-к -с
0.1
2 4 6 мин при 50 °С
КЗО
СССРЗО
КЗ 9
2 4 6
мин при 50 °С
(Г)
СССР39
и
о 2 ■л
г
с- л
с 4
я =
2
ф Ш
# О ф
• © • '-Г
• •
• ф •
Л
Рис. 1. Влияние СССР на содержание №р104р и термотолерантность клеток дрожжей X сегеуг^чае. Клетки дрожжей выращивали при 30 °С на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали при 30 °С или 39 °С (30 мин) в отсутствие добавок (К30, К39) или при добавлении 20 мкМ СССР (С30, С39), отмывали и выделяли белок (а) или определяли выживаемость после теплового шока (50 °С, 0-8 мин) (б-г). Представлены результаты типичного эксперимента (п = 3)
Известно, что в клетках дрожжей мягкий тепловой стресс сопровождается повышением потенциала на внутренней мембране митохондрий (мтДу) [2]. В наших экспериментах установлено, что СССР эффективно подавляет потенциал на внутренней мембране митохондрий в клетках, выращенных на среде с добавлением глюкозы как при обычной температуре, так и при тепловом стрессе (рис. 2). В клетках же с окислительным типом метаболизма СССР не оказывал заметного эффекта на мтДу при обычной температуре, однако ингибировал повышение потенциала при тепловом стрессе. Вероятно, повышение мтДу приводит к активации экспрессии генов БТШ. Снижение мтДу при обработке СССР во время теплового стресса (см. рис. 2) приводит к ингибированию тепловой индукции синтеза №р104р в клетках дрожжей как на среде с этанолом, так и на среде с глюкозой (см. рис. 1, а). Однако связь между мтДу и экспрессией БТШ выполняется только в условиях теплового стресса. Присутствие СССР при обычной температуре инкубации снижало мтДу (см. рис. 2), что приводило к индукции синтеза №р104р в клетках дрожжей, выращенных на среде с глюкозой (см. рис. 1, а), сопровождавшейся повышением термотолерантности (см. рис.1, б).
в 800
§
г
Е" 700 г И
о 600
С?
500
5 400
о 300
200
100
С.
е
I
Ö
YEPD
nh
С Ol ff о г ff
f) « « t»l « ei
Ь и а. м 0ч И
и и и
и и и
и и и
а.
ü ü о
YEPE
Рис. 2. Влияние СССР на флуоресценцию Mitotracker orange в клетках дрожжей в зависимости от источника получаемой энергии. Клетки дрожжей выращивали при 30 °С на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали в течение 10 мин при 30 °С или 39 °С в отсутствие (К30, К39) или при добавлении 20 мкМ СССР (С30, С39) и измеряли флуоресценцию Mitotracker orange (n = 3)
Известно, что в клетках млекопитающих [4] и дрожжей [9] повышение мтДу может сопровождаться усилением генерации АФК. Однако повышение продукции АФК может наблюдаться и при снижении мтДу [8]. Поэтому на следующем этапе изучали влияние СССР на генерацию АФК в клетках дрожжей. Продукция АФК в клетках с окислительным метаболизмом была на низком уровне при обычной температуре инкубации и возрастала при мягком тепловом стрессе (39 °С) (рис. 3). В клетках с бродильным метаболизмом наблюдалась такая же тенденция, однако, по сравнению с клетками, выращенными на этаноле, уровень АФК был выше. Присутствие СССР оказывало незначительный эффект на продукцию АФК в клетках с бродильным типом энергетического метаболизма, но резко усиливало генерацию АФК в клетках с окислительным типом метаболизма (см. рис. 3).
Измерение продукции АФК показало, что обработка СССР дрожжей, выращенных на глюкозе, очень незначительно усиливала образование АФК (см. рис. 3). Напротив, обработка СССР дрожжей, выращенных на этаноле, заметно стимулировала продукцию АФК (см. рис. 3), но при этом не наблюдалось индукции синтеза Hsp104p (см. рис. 1, а).
Рис. 3. Влияние СССР на продукцию АФК в клетках X свгвуг^чав. Клетки дрожжей выращивали при 30 °С на среде с глюкозой или этанолом, инкубировали при 30 °С или 39 °С (30 мин) в отсутствие добавок (К30, К39) или при добавлении 20 мкМ СССР (С30, С39) и измеряли флуоресценцию H2DCF DA. Представлены результаты типичного эксперимента (п = 3)
Таким образом, не наблюдается положительной зависимости между генерацией АФК и индукцией синтеза Hsp104p при обработке СССР. Однако нельзя исключать, что для активации экспрессии Hsp104p необходим определённый уровень АФК, и превышение его выше определённого порога не активирует, а ингибирует экспрессию Hsp104p.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 1404-31677, 10-04-00921-а) и Минобрнауки РФ (соглашение № 8266). В работе использовано оборудование Байкальского аналитического центра (ЦКП) СО РАН при Президиуме ИНЦ СО РАН.
Список литературы
1. Влияние амиодарона на термотолерантность и синтез Hsp104p у дрожжей Saccharomyces cerevisiae /И. В. Федосеева [и др.] // Биохимия. - 2012. - Т. 77, № 1. -
C. 99-109.
2. Do mitochondria regulate the heat-shock response in Saccharomyces cerevisiae? / E. G. Rikhvanov [et al.] // Curr. Genet. - 2005. - Vol. 48, N 1. - P. 44-59.
3. Hsp104 is required for tolerance to many forms of stress / Y. Sanchez [et al.] // EMBO J. - 1992. - Vol. 11, N 6. - P. 2357-2364.
4. Korshunov S. S. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria / S. S. Korshunov, V. P. Skulachev, A. A. Starkov // FEBS Lett. - 1997. - Vol. 416, N 1. - P. 15-18.
5. Longo V. D. Superoxide dismutase activity is essential for stationary phase survival in Saccharomyces cerevisiae / V. D. Longo, E. B. Gralla, J. S. Valentine // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271, N 21. - P. 12275-12280.
6. Protein measurement with the folin phenol reagent / O. H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1957. - N 193. - P.265-275.
7. Richter K. The heat shock response: life on the verge of death / K. Richter, M. Haslbeck, J. Buchner // Mol. Cell. - 2010. - Vol. 40, N 2. - P. 253-266.
8. Rigoulet M. Mitochondrial ROS Generation and Its Regulation: Mechanisms Involved in H(2)O(2) Signaling / M. Rigoulet, E. D. Yoboue, A. Devin // Antioxid. Redox Signal. - 2011. - Vol. 14, N 3. - P. 459-468.
9. Role of mitochondria in the pheromone- and amiodarone-induced programmed death of yeast / A. I. Pozniakovsky [et al.] // J. Cell Biol. - 2005. - Vol. 168, N 2. - P. 257-269.
Effect of Carbonyl Cyanide m-chlorophenylhydrazone (СССР) on Level of Hsp104p Synthesis and Thermotolerance in the Yeast Saccharomyces cerevisiae Depending on the Type of Energy Metabolism
D. V. Pyatrikas, I. V. Fedoseeva, E. G. Rikhvanov, A. V. Stepanov, N. N. Varakina, T. M. Rusaleva, G. B. Borovskii
'Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS, Irkutsk
Abstract. Studied the effect of protonophore CCCP on level of Hsp104p synthesis, development thermotolerance and ROS production in the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is
shown that short-term treatment of the CCCP yeast cells using the type of fermentation metabolism, accompanied Hsp104p synthesis and the development of resistance to subsequent stringent thermal shock. However, in the case of adding the agent to the cells using the type of oxidative metabolism was observed inhibition of Hsp104p synthesis and yeast thermotolerance. Not found a clear correlation between the ability to induce ROS production and the expression of fusion Hsp104p by the CCCP.
Keywords: Saccharomyces cerevisiae, Hsp104p, thermotolerance, СССР, mitochondria.
Пятрикас Дарья Валерьевна кандидат биологических наук научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Pyatrikas Darya Valeryevna Candidate of Sciences (Biology) Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Федосеева Ирина Владимировна кандидат биологических наук научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел. (3952) 42-46-59 факс (3952) 51-07-54 e-mail: fedoseeva@sifibr.irk.ru
Fedoseeva Irina Vladimirovna Candidate of Sciences (Biology) Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: fedoseeva@sifibr.irk.ru
Рихванов Евгений Геннадьевич доктор биологических наук ведущий научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: eugene@sifibr.irk.ru
Rikhvanov Evgenii Gennadievich Doctor of Sciences (Biology) Leading Research Scientist Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132, Lermontov st., Irkutsk, 664033, tel.: (3952) 42-46-59 fax: (3952) 51-07-54 e-mail: eugene@sifibr.irk.ru
Степанов Алексей Владимирович кандидат биологических наук научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: stepanov@sifibr.irk.ru
Stepanov Aleksey Vladimirovich Candidate of Sciences (Biology) Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033,
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: stepanov@sifibr.irk.ru
Варакина Нина Николаевна ведущий инженер Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, '32 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Русалева Татьяна Михайловна ведущий инженер Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, '32 тел. (3952) 42-46-59 факс (3952) 51-07-54 e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Боровский Геннадий Борисович доктор биологических наук главный научный сотрудник Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132 тел.: (3952) 42-46-59 факс: (3952) 51-07-54 e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
Varakina Nina Nikolaevna Leading Engineer
Siberian Institute of Plant Physiology and
Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Rusaleva Tatyana Mikhailovna Leading Engineer
Siberian Institute of Plant Physiology and
Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: galdasova@sifibr.irk.ru
Borovskii Gennadii Borisovich
Doctor of Sciences (Biology)
Chief Research Scientist
Siberian Institute of Plant Physiology
and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov st., Irkutsk, 664033
tel.: (3952) 42-46-59
fax: (3952) 51-07-54
e-mail: borovskii@sifibr.irk.ru
