CC BY
45
УДК 577.1:581.1
^НТЕЗ БТШ И ГИБЕЛЬ КУЛЬТУР КЛЕТОК РАСТЕНИЙ ПРИ ТЕПЛОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ
© А.В. Федяева1, А.В. Степанов2, Т.П. Побежимова3, Е.Г. Рихванов4
ФГБУН «Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН», 664033, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132.
Синтез белков теплового шока (БТШ; heat shock protein - HSP) играет важную роль в биохимической адаптации растительной клетки к действию повышенных температур. Сравнивается синтез различных классов БТШ и жизнеспособность при тепловом воздействии различной интенсивности у культур клеток Triticum aestivum, Sac-charum officinarum, Arabidopsis thaliana. Показано, что наблюдается зависимость между синтезом БТШ и жизнеспособностью растительных клеток. Увеличение содержания HSP101, HSP70 и sHSP (small HSP) наблюдается при тепловом воздействии, не оказывающем отрицательного влияния на жизнеспособность клеток. Напротив, повышение содержания HSP60 может наблюдаться при действии повреждающих температур. Ил. 2. Библиогр. 10.
Ключевые слова: белки теплового шока; Triticum aestivum; Saccharum officinarum; Arabidopsis thaliana.
HEAT SHOCK PROTEIN SYNTHESIS AND DEATH OF PLANT CELL CULTURES UNDER HEAT EXPOSURE A.V. Fedyaeva, A.V. Stepanov, T.P. Pobezhimova, E.G. Rikhvanov
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, 132 Lermontov St., Irkutsk, 664033, Russia.
Synthesis of heat shock proteins (HSP) is an essential part of biochemical adaptation of a plant cell under high temperatures. The authors compare the synthesis of different HSP classes and cell culture viability of Triticum aestivum, Saccharum officinarum and Arabidopsis under heat effect of various intensity. Relationship is found to exist between HSP synthesis and plant cell viability. Increase in the content of HSP101, HSP70 and sHSP (small HSP) is observed under the heat exposure, which is not harmful for cell viability. Whereas the increased content of HSP60 is observed under the exposure to damaging temperatures. 2 figures. 10 sources.
Key words: heat shock proteins; Triticum aestivum; Saccharum officinarum; Arabidopsis thaliana.
Умеренно повышенные температуры запускают программу защиты клетки, в ходе которой происходит ряд физиолого-биохимических процессов, к числу которых относят синтез белков теплового шока (БТШ, heat-shock proteins или HSP). БТШ - это молекулярные шапероны, которые выполняют протекторные функции в клетке [2]. При действии более высоких температур клетка активирует программу клеточной гибели - программируемую клеточную смерть (ПКС) [8]. Развитие ПКС сопровождается рядом характерных физиолого-биохимических механизмов: синтезом специфических белков de novo, переходом фосфатидил-серина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный, усилением продукции активных форм кислорода (АФК), выходом цитохрома с,
фрагментацией ДНК (laddering) и др. [7]. В работе [9] с использованием клеток млекопитающих показано, что процессы синтеза HSP70 и развития ПКС являются взаимоисключающими событиями. В связи с этим целью данной работы было выяснить, наблюдается ли аналогичная зависимость у растений. Для этого изучали влияние температурных обработок различной интенсивности на синтез белков теплового шока и гибель клеток культур растений арабидопсиса, тростника и пшеницы.
Материалы и методы исследования
В работе использовали семисуточные гетеротрофные суспензионные культуры клеток арабидопси-са (Arabidopsis thaliana L.), озимой пшеницы (Triticum aestivum L. сорта Иркутская), сахарного тростника
1Федяева Анна Валерьевна, аспирант, ведущий инженер лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Fedyaeva Anna, Postgraduate, Leading Engineer of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
2Степанов Алексей Владимирович, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Stepanov Aleksei, Candidate of Biology, Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected] ru
Побежимова Тамара Павловна, доктор биологических наук, доцент, главный научный сотрудник лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Pobezhimova Tamara, Doctor of Biology, Associate Professor, Chief Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]. ru
Рихванов Евгений Геннадьевич, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологической генетики, тел.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
Rikhvanov Evgeny, Doctor of Biology, Chief Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics, tel.: (3952) 424659, e-mail: [email protected]
(Saccharum officinarum L. сорта POJ2878, линия, устойчивая к аноксии). Культура сахарного тростника получена в ИФР РАН и любезно предоставлена канд. биол. наук, с.н.с. лаборатории генетической инженерии СИФИБР СО РАН В.Н. Шмаковым. Культуры клеток озимой пшеницы и тростника выращивали на среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей 3,6% сахарозы, 0,6 мг/л никотиновой кислоты, 0,6 мг/л пиридоксина, 1,2 мг/л тиамина, 3 мг/л 2,4-Д, 120 мг/л инозитола, 6 мг/л дитиокарбамата натрия. Культуру клеток араби-допсиса выращивали на среде МС, содержащей 3,6% сахарозы, 0,6 мг/л пиридоксина, 0,6 мг/л тиамина, 0,12 мг/л 2,4-Д, без добавления никотиновой кислоты, инозитола и дитиокарбамата натрия. Культуры клеток пересаживали каждые 2 недели, с разведением новой средой культуры озимой пшеницы в 3 раза, а культур тростника и арабидопсиса в 6 раз. В экспериментах использовали суспензионные культуры клеток, находящиеся в экспоненциальной фазе роста. Суспензионные культуры клеток подвергались воздействию температурами 37°С (120 мин), 39°С (120 мин), 43°С (60 мин), 46°С (40 мин), 50°С (10 мин). Перед выделением белка клетки инкубировали в контрольных условиях (26°С, 120 мин).
Для определения жизнеспособности клетки суспензионной культуры озимой пшеницы сразу же после теплового воздействия и через 48 ч окрашивали в течение 2 мин флуоресцентными красителями: флуо-ресцеин диацетатом (ФДА 50 мкМ) и пропидий йоди-дом (ПИ 5 мкг/мл). ФДА окрашивает живые клетки в зеленый цвет, а ПИ окрашивает мертвые клетки в красный цвет. Жизнеспособность клеток определяли с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа AxioObserverZ1 (Германия) с цифровой монохромной камерой AxioCamMRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений "AxioVisionRel.4.6" и выражали в процентах от контроля. Жизнеспособность клеток суспензионной культуры арабидопсиса определяли после воздействия вышеуказанными температурами и дополнительной инкубации при 26°С в течение 48 ч по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорида (ТТХ) [1].
Выделение суммарного белка из суспензионной культуры озимой пшеницы проводили по методу [8]. Концентрацию белка определяли по методу Лоури [4].
Разделение белков проводили путем ДДС-электрофореза (12,5%) в модифицированной системе Лэммли [3], используя прибор для электрофореза Mini-PROTEAN III Electrophoretic Cell фирмы BIO-RAD (США). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану («Amersham», США) проводили в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя, используя антитела, полученные против HSP 60 (фирмы «USBio»), HSP 70 (фирмы «StressGen», «Sigma»), HSP 101 (фирмы «Agrisera», «Sigma»), HSP 17,6 (I класс; фирмы «Agrisera») и HSP 17, 6 (II класс, фирмы «Agrisera»).
Опыты повторяли не менее 3 раз. Полученные данные были обработаны статистически: рассчитаны среднеарифметические значения и их ошибки.
Результаты исследования
Содержание БТШ в клетках суспензионных культур растений при тепловом воздействии. Известно, что экспрессия шаперонов HSP101, HSP70, sHSP (small HSP) повышается при тепловом воздействии. Эти БТШ участвуют в восстановлении поврежденных нагреванием белков [2]. Для изучения влияния теплового воздействия на синтез БТШ использовали культуры клеток растений Triticum aestivum L., Saccharum officinarum, Arabidopsis thaliana L. Клетки, выращенные при 26°С, подвергали воздействию при 37, 39, 43, 46, 50°С. Как видно из рис. 1, в контрольных условиях (26°С) содержание HSP101 и sHSP практически не регистрировалось у всех используемых культур клеток. Однако при повышении температуры до 37-39°С содержание данных белков значительно возрастало. В то же время содержание белка HSP70 в контрольных условиях в клетках арабидопсиса (рис. 1, а) и пшеницы (рис. 1, в) было относительно высоким, но при тепловом воздействии (37-39°С) наблюдалось дополнительное повышение его количества.
Температура, при которой наблюдался синтез БТШ, различалась у исследуемых культур клеток. У арабидопсиса максимальное повышение содержания HSP101, HSP70 и sHSP - HSP17.6 (I) и HSP17.6 (II) наблюдалось при 37°С (рис. 1, а). У пшеницы оптимум синтеза этих БТШ наблюдался при 37 и 39°С (рис. 1, в). У тростника максимальное повышение содержания HSP101 и sHSP происходило в диапазоне от 37 до 43°С (рис. 1, б). Более высокие температуры (46 и 50°С) ингибировали синтез этих белков у всех культур клеток (рис. 1).
В отличие от вышеуказанных белков изменение содержания HSP60 происходило другим образом. Температура 37°С не приводила к значительному увеличению количества HSP60 по сравнению с контролем у всех используемых культур клеток (рис. 1). В то же время, повышение температуры теплового воздействия до 39оС и выше сопровождалось увеличением его количества в культуре клеток пшеницы (рис. 1, в) и арабидопсиса (рис. 1, а). Однако такого эффекта не наблюдалось в культуре клеток тростника (рис. 1, б).
Таким образом, минимальным воздействием, вызывающим увеличение содержания HSP101 и sHSP, являлась температура 37°С во всех исследованных культурах клеток. В культуре клеток арабидопсиса и пшеницы повышение температуры до 43°С ингибиро-вало синтез этих белков. Однако в культуре клеток тростника повышение содержания HSP101 и sHSP наблюдалось и при температуре 43°С.
Изучение жизнеспособности клеток после тепловых воздействий различной интенсивности. Как показано выше (см. рис. 1), повышенные температуры индуцируют увеличение содержания БТШ. Однако известно, что действие высоких температур в зависимости от их интенсивности и продолжительности может отрицательно сказываться на жизнеспособности клеток растений [5, 6]. Чтобы определить условия, при которых происходит гибель клеток, была изучена жизнеспособность клеток культуры арабидопсиса и пшеницы при исследуемых температурных обработках.
Для определения жизнеспособности использовали флуоресцентные красители ФДА и ПИ, флуоресценция которых наблюдается соответственно в живых и мертвых клетках. Как видно на рис. 2, б, в контрольных условиях (26°С), когда клетки озимой пшеницы живые, они окрашиваются ФДА. Тепловая обработка при 60°С (10 мин) приводит к гибели клеток, и они уже не окрашиваются ФДА, но окрашиваются ПИ. Изучение влияния теплового воздействия на жизнеспособность клеток показало, что при действии 37 и 39°С не наблюдалось значительной гибели у исследованных культур клеток (рис. 2).
бидопсиса (рис. 2, а), но существенно не влияло на жизнеспособность клеток у пшеницы (рис. 2, в). Высокие температуры (46 и 50°С) приводили к снижению жизнеспособности клеток как у культуры арабидопси-са, так и у культуры пшеницы (рис. 2, а, в), но повреждающее действие этих температур было сильнее выражено у арабидопсиса (рис. 2, а).
Рис. 1. Содержание HSP101, HSP70, HSP60, HSP17.6 в
клетках суспензионных культур A.thaliana S.officinarum (б), T.aestivum (в) при тепловом воздействии различной интенсивности (37"С- 120 мин, 43 "С - 60 мин, 50 "С - 10 мин). Приведены данные характерного эксперимента, п=3
Обработка при 43, 46 и 50°С не приводила к мгновенной гибели клеток пшеницы сразу после воздействия (рис. 2, в). Аналогичные данные получены для арабидопсиса (данные не представлены). Однако определение жизнеспособности после восстановительного периода показало, что гибель клеток пшеницы и арабидопсиса наступает спустя 48 ч инкубации при обычной температуре. Действие температуры 43°С значительно снижало число живых клеток у ара-
37 39
Температура, °С
Рис. 2. Жизнеспособность культуры клеток АЛИаНапа ), T.aestivum (б,в) при тепловом воздействии различной интенсивности. Микрофотография клеток (б) и статически обработанные данные (а, в). Жизнеспособность определяли по восстановлению ТТХ (а) или по окрашиванию ФДА и ПИ (б, в) сразу (в) после воздействия температурным фактором и через 48 часов (а, в). N=3; m+S.E. Масштабная линейка 50 мкМ. СП - светлое поле
Таким образом, обработка культур клеток температурами 37 и 39°С приводила к накоплению содержания HSP101, HSP70 и бИБР, но не вызывала снижения жизнеспособности клеток. Температуры 46 и 50°С ингибировали синтез БТШ (рис. 1) и приводили к гибели клеток (рис. 2, а, в).
Сравнение жизнеспособности культур клеток пшеницы и арабидопсиса указывает на то, что культура клеток арабидопсиса более чувствительна к теплово-
му воздействию, чем культура клеток пшеницы (рис. 2, а, в).
Обсуждение
В отсутствие теплового стресса (26°С) не наблюдалось синтеза HSP101 и sHSP у всех исследованных нами культур клеток растений, однако при тепловом воздействии 37-39°С у арабидопсиса и пшеницы и при 37-43°С у тростника их содержание резко увеличивалось. В отличие от HSP101 и sHSP, содержание HSP70 было достаточно значительным в контрольных условиях, но тепловой стресс приводил к еще большему увеличению его количества. Следует отметить, что при максимальном синтезе HSP101 и sHSP при 37-39°С гибели клеток в суспензионных культурах арабидопсиса и пшеницы не наблюдали. Таким образом, полученные результаты подтверждают то, что HSP101 и sHSP при повышении температуры необходимы клеткам для обеспечения выживаемости, а HSP70 выполняет важную роль не только при стрессе, но и при обычных условиях [2].
Если клетки подвергнуть мягкому неповреждаю-щему тепловому воздействию, вызывающему синтез БТШ, то в последующем они становятся устойчивыми к более высоким повреждающим температурам. Известно, что существует взаимосвязь между синтезом некоторых БТШ и устойчивостью (термотолерантностью). Так, нарушение экспрессии генов ИЗР17,7 моркови [5] и НЭР101 арабидопсиса [6] приводит к снижению термотолерантности. Из представленных в данной работе результатов (рис. 1) следует, что у каждой из изученных культур есть свой температурный оптимум, при котором происходит максимальный синтез HSP101, HSP70 и sHSP. Для клеток арабидопсиса наиболее оптимальной температурой синтеза БТШ являлась обработка при 37°С, для клеток пшеницы -37-39°С, а тростника - 37-43°С. Таким образом, клетки арабидопсиса обладают самым низким оптимумом синтеза вышеуказанных БТШ, а клетки тростника -самым высоким. Оптимум индукции в клетках пшеницы занимает промежуточное положение. Кроме того, полученные данные указывают на то, что оптимум индукции исследуемых БТШ зависит от устойчивости растений к тепловому воздействию. Действительно, клетки арабидопсиса оказались менее устойчивыми к повышенным температурам, чем клетки пшеницы (рис. 2, а, в). Соответственно у клеток арабидопсиса при 39°С наблюдается ингибирование синтеза HSP101 и sHSP. Однако этого явления не происходит в клетках пшеницы (рис. 1, а, в). Следовательно, чем
выше термотолерантность растительных клеток, тем выше температура, при воздействии которой происходит индукция синтеза БТШ.
Сравнение жизнеспособности клеток при тепловом воздействии и изменение синтеза HSP101 и sHSP показало прямую зависимость между этими параметрами. Синтез этих белков происходит при тепловом воздействии, которое не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность клеток растений. Так, синтез HSP101 и sHSP у клеток арабидопсиса наблюдался при 37°С, а у клеток пшеницы - при 37 и 39°С (рис. 1, а, в), однако при этих условиях гибели клеток не наблюдалось (рис. 2, а, в). Таким образом, полученные данные указывают на то, что, явление, описанное на клетках млекопитающих [9], справедливо и для клеток растений. Синтез HSP101, sHSP и гибель клеток культуры после действия теплового шока являются взаимоисключающими явлениями.
Динамика изменения содержания HSP60 при температурных обработках различной интенсивности отличалась от динамики изменения вышеуказанных БТШ. Обработка при температурах 46 и 50°С приводила к увеличению синтеза HSP60 в культуре клеток арабидопсиса и пшеницы (рис. 1, а, в) и к существенному снижению жизнеспособности (рис. 2, а, в). Это может быть связано с тем, что HSP60 играет роль регулятора ПКС в клетках растений. Из литературных данных известно, что HSP60, активируя каспазный каскад, является регулятором ПКС в клетках млекопитающих [10].
Заключение
Повышение температуры приводит к ряду изменений в клетке на физиологическом, биохимическом, морфологическом уровнях. В ответ на воздействие повышенной температуры, как известно, активируется синтез белков теплового шока, которые являются молекулярными шаперонами и играют важную роль в защите клеток. В данной работе установлено, что, чем выше термотолерантность растений, тем при более высокой температуре происходит синтез БТШ. Показана обратная зависимость между синтезом HSP101, HSP70, sHSP и гибелью клеток. Когда тепловое воздействие достигает определенного порога, губительного для клеток, синтез белков теплового шока инги-бируется. HSP60, возможно, является индуктором ПКС в клетках арабидопсиса и пшеницы.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (№14-04-32126).
Библиографический список
Статья поступила 29.11.2013 г.
1. Еникеев А.Г., Высоцкая Е.Ф., Леонова Л.А. Об использовании 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида для оценки жизнеспособности культур растительных клеток / Физиол. растений. 1995. Т.42. С.423-426.
2. Al-Whaibi M.H. Plant heat-shock proteins: A mini review / J. of King Saud University - Science. 2011. V.23. P.139-150.
3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of head bacteriophage T4 / Nature. 1970. V.227. P.680-685.
4. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. Protein measurement with the folin phenol reagent / J. Biol. Chem. 1957. V.193. P.265-275.
5. Malik M.K., Slovin J.P., Hwang C.H., Zimmerman J.L. Modified expression of a carrot small heat shock protein gene, HSP17.7, results in increased or decreased thermotolerance / Plant J. 1999. V20. P.1-11.
6. Queitsch C., Hong S.-W., Vierling E., Lindquist S. Heat shock protein 101 plays a crucial role in thermotolerance in Ara-bidopsis / The Plant Cell. 2000. V.12. P.479-492.
7. Reape T.J., McCabe P.F. Apoptotic-like regulation of programmed cell death in plants // Apoptosis. 2010. V.15. P.249-256.
8. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial crosstalk during heat shock in Arabidopsis cell culture / The Plant Journal. 2007. V.52. P.763-778.
9. Samali A., Holmberg C.I., Sistonen L., Orrenius S. Thermo-tolerance and cell death are distinct cellular responses to stress: dependence on heat shock proteins / FEBS Letters 461. 1999. P.306-310.
10. Xanthoudakis S., Roy S., Rasper D., Hennessey T., Aubin Y., Cassady R., Tawa P., Ruel R., Rosen A., Nicholson D.W. Hsp60 accelerates the maturation of pro-caspase-3 by upstream activator proteases during apoptosis / EMBO Journal. 1999. V.18. P.2049-2056.
УДК 577.15
ОБРАБОТКА СОЛОМЫ ПШЕНИЦЫ В СРЕДЕ СВЕРХКРИТИЧЕСКОГО ДИОКСИДА УГЛЕРОДА
© Хоанг Куанг Кыонг1, Е.С. Фомина2, С.Н. Евстафьев3, Е.А. Привалова4
Иркутский государственный технический университет, 664074, Россия, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 83.
Приведены результаты изучения влияния температуры и давления на выход и состав экстрактивных веществ, выделенных из соломы пшеницы в статических условиях процесса сверхкритическим диоксидом углерода в интервале температур 110-200°С и давления 10-20 МПа, и на реакционную способность соломы к ферментативному гидролизу. Установлено, что увеличение температуры и давления процесса способствует повышению выхода СО2-экстракта. В его составе идентифицировано более 70 соединений, представленных алканами, сложными эфирами, карбоновыми кислотами, альдегидами, кетонами, стеролами и др. Показано, что обработка соломы пшеницы сверхкритическим диоксидом углерода в статических условиях повышает ее реакционную способность к ферментативному гидролизу. Ил. 5. Табл. 1. Библиогр. 4 назв.
Ключевые слова: солома пшеницы; сверхкритический диоксид углерода; ферментативный гидролиз; СО2-экстракт.
SUPERCRITICAL СОг-TREATMENT OF WHEAT STRAW Hoang Quang Cuong, E.S. Fomina, S.N. Evstafyev, E.A. Privalova
Irkutsk State Technical University, 83 Lermontov St., Irkutsk, 664074, Russia.
The article reports on the results of studying temperature and pressure effect on the yield and composition of wheat straw extracts isolated by a supercritical carbon dioxide under static conditions within the temperature range of 110-200°C and pressure of 10-20 MPa. The СОг-treated wheat straw ability to enzymatic hydrolysis is examined as well. It is found that with the raise in pressure and temperature of the process the СО2 extract yield increases. The authors have identifies more than 70 compounds represented by alkanes, esters, carboxylic acids, aldehydes, ketones, sterols and others to compose the extract. Wheat straw subjected to supercritical СО2 static treatment is shown to improve its enzymatic hydrolysis ability. 5 figures. 1 tables. 4 sources.
Key words: wheat straw; supercritical carbon dioxide; enzymatic hydrolysis; СО2 extract.
В настоящее время большинство развитых стран как в качестве исходного сырья использует биомассу,
в той или иной степени развивает альтернативную содержащую аккумулированную в форме углеводоро-
энергетику, поскольку понимает, что классические дов солнечную энергию. Получение биотоплива из
источники энергии исчерпаемы. В этом отношении лигноцеллюлозного сырья является одним из пер-
биоэнергетика обладает явным преимуществом, так спективных способов решения данной проблемы, и
1Хоанг Куанг Кыонг, студент, тел.: 89246244736, е-mail: [email protected] Hoang Quanq Cuonq, Student, tel.: 89246244736, e-mail: [email protected]
2Фомина Елена Сергеевна, старший преподаватель кафедры химии и пищевой технологии, тел.: (3952) 405122, е-mail: [email protected]
Fomina Elena, Senior Lecturer of the Department of Chemistry and Food Technoloqy, tel.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
3Евстафьев Сергей Николаевич, доктор химических наук, профессор, зав. кафедрой химии и пищевой технологии, тел.: (3952) 405123, е-mail: [email protected]
Evstafyev Serqey, Doctor of Chemistry, Professor, Head of the Department of Chemistry and Food Technoloqy, tel.: (3952) 405123, e-mail: [email protected]
"Привалова Елена Андреевна, кандидат химических наук, доцент кафедры химии и пищевой технологии, тел.: (3952) 405122, е-mail: [email protected]
Privalova Elena, Candidate of Chemistry, Associate Professor of the Department of Chemistry and Food Technoloqy, tel.: (3952) 405122, e-mail: [email protected]
