CC BY
8
дился забор адипоцитов ЭЖТ, ПВЖТ и подкожной жировой ткани (ПЖТ) с последующим культивированием и получением супернатанта. Содержание лептина и растворимого рецептора к лептину (LSR) в супернатанте ЭЖТ, ПЖТ и ПВЖТ определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем фирмы BioVendor (США). Расчет индекса свободного лептина (FLI) определяли по формуле: лептин/ LSR*100). В полученном материале проводилась оценка экспрессия генов лептина (LEP) и его рецептора LSR. Экспрессию генов оценивали с помощью количественной полиме-разной цепной реакции с использованием анализа экспрессии генов TaqManTM (Applied Biosystems, США) в системе ПЦР ViiA 7 (Applied Biosystems, США). Данные проанализированы с использованием Statistica 9.0.
Результаты. ЭЖТ характеризовалась самой интенсивной экспрессией гена лептина и, как следствие самой высокой концентрацией лептина в супернатанте как среди пациентов с ИБС, так и с пороками сердца. Адипоциты ПВЖТ характеризовались наиболее низким содержанием лептина в супернатанте, а также экспрессия его гена была ниже, чем в адипоцитах ЭЖТ. Несмотря на то, что экспрессия гена лептина была достоверно ниже в адипоцитах ПВЖТ по сравнению с ЭЖТ, концентрации лептина в супернатанте двух этих культур достоверно не различались. Полученные данные были идентичны для пациентов с пороками сердца. Однако концентрация лептина была достоверно ниже в культуре ЭЖТ и ПВЖТ у пациентов с пороками сердца по сравнению с ИБС. Для адипоцитов ПВЖТ был характерен самый низкий FLI. Причем у пациентов с пороками сердца экспрессия мРНК растворимого рецептора к лептину была в 1,58 раза интенсивнее, чем у пациентов с поражением КА, хотя содержание самого рецептора в супернатанте достоверно не различалось. Наименьшая концентрация растворимого рецептора к лептину обнаружена в культуре ПЖТ, что сопровождалось наибольшим значением FLI по сравнению с адипоцитами ПВЖТ и ЭЖТ.
Заключение. Таким образом, пациенты с ИБС характеризуются наличием периферической лептинорезистентности локальных жировых депо.
Финансирование. Исследование выполнено в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419-2022-0001.
2. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛЬНЫХ
ПУТЕЙ NOTCH И BMP В РЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССАХ СЕРДЦА
Докшин П. М.1, Панферов Е. В.2, Малашичева А. Б.1
1ФГБУ СЗФМИЦ им. В. А. Алмазова Минздрава России, Санкт-Петербург; 2Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
Инфаркт миокарда является распространённым острым заболеванием, приводящем к ухудшению сердечной функции. Возможности регенерации постинфарктного миокарда сильно ограничены, а молекулярно-клеточные механизмы раннего ремоделирования не до конца изучены. В ответ на повреждение отмечалось повышение уровня экспрессии компонентов сигнальных путей Notch и Bmp (в частности, BMP2), как в мезенхимных клетках сердца, так и в зрелых кардиомиоцитах, находящихся в периинфарктной области. Данные передачи сигналов играют важное значение в развитии и поддержании сердечно-сосудистой системы, но влияют ли они на активацию друг на друга в процессах раннего ремо-делирования сердца остаётся неизвестным.
Цель. Изучить уровень экспрессии сигнальных путей Notch и Bmp в ответ на экзогенную активацию in vitro ме-зенхимных клеток сердца (МКС) и эндотелиальных клеток пупочной вены человека (ПВЭК) при моно- и сокультивиро-вании.
Материал и методы. Первичные культуры МКС и ПВЭК
были получены путём ферментативной диссоциации тканей из миокарда левого желудочка сердца и пупочной вены человека, соответственно. Клетки были выведены в культуру, фе-
нотипированы и трижды пассированы. Клеточные культуры были посажены в плотности 10*4 на 3,8 см2, и трансдуциро-ваны лентивирусными векторами, несущими целевые последовательности NOTCH1 (NICD) и BMP2; в качестве контроля влияния вирусной трансдукции использовался вектор без вставки — TRC. Через 48 часов после экзогенной активации, были собраны клеточные лизаты и выделена общая суммарная РНК. Для оценки уровней экспрессии целевых генов использовался метод ПЦР "в реальном времени" с обратной транскрипцией. Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы GraphPad Prism 9.0.0.
Результаты. Экзогенная активация сигнального пути Notch приводит к увеличению экспрессии гена-мишени HEY1 и рецептора NOTCH1 в обеих культурах, но двойная трансдукция NICD/BMP2 оказывает противоположный эффект между МКС и ПВЭК. Данный феномен повторяется и при сокультивировании. Экзогенная активация сигнального пути Bmp приводит к увеличению экспрессии фактора BMP2 в обеих культурах, но при сокультивировании двойная трансдукция оказывает более выраженный эффект на уровень экспрессии BMP2.
Заключение. Активация BMP2 оказывает влияние на экспрессию компонентов сигнального пути Notch в МКС и ПВЭК, что может указывать на его вышестоящее положение в качестве регулятора генной сети, и, наоборот, только при сокультивировании экспрессия BMP2 повышается в присутствии активированного сигнального пути Notch.
Финансирование. Грант НШ-4664.2022.1.4.
3. ВЛИЯНИЕ АКТИВАЦИИ
ПРООСТЕОГЕННОГО ZBTB16 НА ОСТЕОГЕННУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ИНТЕРСТИЦИАЛЬНЫХ КЛЕТОК АОРТАЛЬНОГО КЛАПАНА
Качанова О. С.1, Семенова Д. С.2, Лобов А. А.2, Малашичева А. Б.2
1НМИЦ им. В. А. Алмазова, Санкт-Петербург; 2НМИЦ им. В. А. Алмазова, Институт цитологии российской академии наук, Санкт-Петербургский Государственный Университет, Санкт-Петербург, Россия
Кальцинированный стеноз аортального клапана является третьей ведущей причиной сердечно-сосудистых заболеваний. Механизмы, лежащие в основе патологической каль-цификации, остаются неясными, однако, полагают, что они во-многом имеют сходство с формированием костной ткани во время эмбрионального развития, а также в постнаталь-ном периоде при регенерации. Существует множество подтверждений участия ZBTB16 в развитии скелета. При этом, ряд исследований, проведенных на разных типах клеточных культур, говорит о противоречивом и неоднозначном влиянии ZBTB16 на экспрессию RUNX2. Понимание сходства и различий в механизмах, опосредующих остеогенную диф-ференцировку клеток во время физиологического формирования кости и патологической оссификации тканей может дать предпосылки для возможности управления процессами остеогенной дифференцировки в организме человека. Таким образом, цель данного исследования состояла в изучении динамической вариабельности экспрессии ZBTB16, а также его роли в кальцификации клапана аорты.
Материал и методы. Из кальцинированных аортальных клапанов выделяли интерстициальные клетки, у которых индуцировали остеогенную дифференцировку путём добавления специфических индукторов в среду культвиирования. Для оценки воздействия фактора ZBTB16 на остеодиффе-ренцировку в клетки вносили ZBTB16 на лентивирусном носителе. Степень остеодифференцировки оценивалали окрашиванием ализарином красным. Изменение экспрессии маркеров остеодифференцировки оценивали при помощи полимеразной цепной реакцией в реальном времени. Также был проведнн анализ протеомного профиля модифицированных клеток.
Результаты. Увеличение экспрессии ZBTB16 способствует усилению остеогенной дифференцировки по сравнению с контролем. Блокирование ZBTB16 приводит к ингибиро-ванию остеогенной дифференцировки. По результатам поли-меразной цепной реакции наблюдалось повышение экспрессии маркеров остеодифференцировки RUNX2 и Colla в пробах со сверхэкспрессированным ZBTB16. При сопоставлении протеомных профилей контроля и клеток с избыточной экспрессией ZBTB16 мы выявили два отдельных кластера со сверхэкспрессией ZBTB16 или без нее. Анализ дифференциально экспрессируемых белков выявил 13 белков с по меньшей мере двукратными различиями в уровнях экспрессии.
Заключение. В рамках данного исследования мы показали, что активация транскрипционного фактора ZBTB16 оказывает значимое стимулирующее влияние на течение остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта НШ-4664.2022.1.4.
4. СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ИМПЛАНТАЦИИ БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ СОСУДИСТЫХ ПРОТЕЗОВ МАЛОГО ДИАМЕТРА С ЛЕКАРСТВЕННЫМ ПОКРЫТИЕМ С ПРОТЕЗАМИ GORE-TEX НА МОДЕЛИ ОВЦЫ
Кривкина Е.О, Миронов А. В., Шабаев А. Р., Крутицкий С. С., Ханова М. Ю, Великанова Е. А., Антонова Л. В.
НИИ КПССЗ, Кемерово, Россия
Тканеинженерные сосудистые протезы малого диаметра могут стать перспективой стандартным аутологичным сосудам при проведении сердечно-сосудистых операций.
Цель. Инкорпорирование в состав полимерного каркаса проангиогенных факторов и дополнительная модификация поверхности антиагрегантами и антикоагулянтами, позволит повысить их проходимость, атромбогенность и биосовместимость.
Материал и методы. Протезы 0 4 мм были изготовлены методом электроспиннинга на аппарате Nanon-01A из раствора полимеров 10% поликапролактона (poly(e-caprolactone), PCL) и 5% полигидросибутирата/валериата (polyhydroxybutyrate/valerate, PHBV) в хлороформе, с комплексом биологически активных молекул (GFmix): фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), основной фактор роста фи-бробластов (bFGF) и хемоаттрактантная молекула (SDF-1a). Для повышения тромборезистентных свойств графтов, была проведена дополнительная атромбогенная модификация поверхности части изготовленных протезов антиагрегантами и антикоагулянтами по собственной оригинальной методике.
В сонную артерию овец имплантированы следующие типы графтов: PHBV/PCL/GFmixHep/Ilo (n=8), сроком на 18 месяцев и синтетические сосудистые протезы Gore-Tex (Gore-Tex, США), (n=5), имплантированные на 6 месяцев.
Результаты. Проходимость графтов PHBV/PCL/ GFmixHep/Ilo через сутки после операции составила 62,5% (5 из 8). Через 18 месяцев имплантации проходимость составила 50%. У протезов Gore-Tex через сутки наблюдался 100% тромбоз, через 6 месяцев имплантации проходимость составила 0%. Гистологическое исследование показало, что биодеградируемый каркас графтов PHBV/PCL/GFmixHep/ Ilo полностью резорбировался с образованием аневризм на всем протяжении протеза. На месте биодеградируемых трубчатых каркасов выявлено формирование трехслойного новообразованного сосуда, схожего по своему строению с натив-ной сонной артерией овцы. Однако в отличие от нативного сосуда, в новообразованной сосудистой ткани отсутствовали эластические волокона и четкая вытянутость цитоплазмы гладкомышечных клеток. Также в стенках эксплантирован-ных модифицированных протезов отсутствовал кальций, в отличие от протезов Gore-Tex, в стенке которых наблюдалась массивная кальцификация, несмотря на наличие в них
обтурирующего тромба. По результатам иммунофлуорес-центного исследования в проходимых графтах PHBV/PCL/ GFmixHep/Ilo выявлен эндотелий с признаками эндотели-ально-мезенхимального перехода (одновременная экспрессия CD31 и а-актина, vWF) в проходимых графтах PHBV/ PCL/GFmixHep/Ilo. Также отмечалось наличие коллагенов I, III и IV типов. На основе протезов Gore-Tex формирование новообразованной ткани отсутствовало.
Заключение. Протезы PHBV/PCL/GFmixHep/Ilo обладают высокой долгосрочной проходимостью (в сравнении с синтетическими протезами Gore-Tex). Отсутствие кальци-фицикации в протезах PHBV/PCL/GFmixHep/Ilo на всем сроке имплантации также подтверждает их высокую биосовместимость. Однако в связи с наличием факта аневризмо-образования, требуется проведение дополнительного укрепления каркаса протеза и повышения атромбогенных свойств внутренней поверхности.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке комплексной программы фундаментальных научных исследований СО РАН в рамках фундаментальной темы НИИ КПССЗ № 0419- 2022-0001 "Молекулярные, клеточные и биомеханические механизмы патогенеза сердечно-сосудистых заболеваний".
5. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МАРКЕРЫ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ИНТЕРВАЛА QT У МУЖЧИН
Нестерец А. М, Кузнецов А. А, Малютина С. К., Денисова Д. В., Максимов В. Н.
НИИ терапии и профилактической медицины, филиал Федерального исследовательского центра Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, Новосибирск, Россия
Интервал QT представляет собой электрокардиографический показатель, отражающий процессы деполяризации и реполяризации желудочков. Врожденные, а также приобретенные изменения в работе сердечных ионных каналов могут увеличивать/укорачивать длительность потенциала действия кардиомиоцитов, способствуя ранней постдеполяризации, развитию желудочковых нарушений ритма и повышая риск внезапной сердечной смерти. Наиболее распространенными приобретенными факторами пролонгации интервала QT являются электролитные нарушения, прием лекарственных препаратов, удлиняющих интервал QT, гормональный дисбаланс, наличие морфофункциональных изменений сердца. Кроме того, особую роль в развитии лекарственно-индуцированного удлинения интервала QT играет наличие однонуклеотид-ных полиморфизмов (ОНП) генов, связанных с синдромом удлиненного интервала QT (LQTS): KCNQ1, KCNH2, SCN5A, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CACNA1, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1, KCNJ5, CALM1 и CALM2. Появление новых высокоинформативных методов генетических исследований, включая NGS, GWAS, позволило идентифицировать ряд новых вероятно патогенных вариантов, влияющих на интервал QT.
Цель. Изучить ассоциацию полиморфизмов гена NOS1AP с длительностью интервала QT у мужчин, жителей г. Новосибирска.
Материал и методы. В исследование включено 1353 мужчины в возрасте 25-69 лет, участники проекта HAPIEE и скрининга молодых людей 25-44 года. В дальнейшем выборка была разделена на 9 возрастных подгрупп с интервалом в 5 лет (25-29, 30-34, ..., 65-69), из которых сформированы следующие группы: с самым коротким (185 человек), средним (178 человек) и самым длинным интервалом QT (179 человек). Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний в исследуемых группах статистически значимо не различалась. Выделение ДНК из 10 мл венозной крови выполнено методом фенол-хлороформной экстракции. На основании данных литературы выбраны следующие ОНП: rs12143842, rs45 67139 гена NOS1AP. Генотипирование rs4657139 проведено с помощью ПЦР с ПДРФ, генотипирование rs12143842 — с помощью РВ-ПЦР.
