CC BY
15
УДК 14. 1.017. 1
Маслянко Р.П., професор, Божик Л.Я., ст. викладач, Пукало П.Я., ст. викладач ©
Лъв\всъкий нацюналънийутеерситет еетеринарногмедицини та бютехнологт iмет С.З. Гжицького
ВИЯВЛЕННЯ I РОЛЬ ЦИТОК1НОВОГО ТА Т-КЛ1ТИННОГО ПРОФ1ЛЮ В ПАТОЛОГИ ТВАРИН
В cmammi розглянуто мехатзми внутршнъоклтинног продукцп цитокшв Т-л1мфоцитами та гхролъ в патологи тварин
Ключое1 слова: Т-клтини, цитотни, патолог1я
Цитокши вщносяться до мед1атор1в запалення бшково! природи, яю залучаються до ¿мунорегуляцп лейкоцитарно! вщповда, на шфекцшш, ауто1мунн1, онколопчш та rnmi захворювання. Для дослщжень цитокмв найчастше використовують сучасш методи, основан! на застосуванш специф1чних антитш до цих бшкових структур: ELISA, ELISPOT i внутр1шньокл1тинне забарвлення. nepmi два методи дозволяють визначити сумарну секрецш цитоюшв популящею кл1тин, в цей час як внутр1шньокл1тинне забарвлення дозволяе визначити продукцш цитоюшв на piBHi одше! конкретно! кл1тини.
Дослщження внутршньокл1тинних цитокмв за допомогою проточно! цитометрп виерше проведено i описано в робот1 [5]. Автори показали, що фжсащя параформальдегщом i наступна пермеабшзащя сапоншом дозволяе виявити внутршньокл1тинш цитокши за допомогою специф1чних моноклональних антитш. Кл1тини оброблеш таким чином, вдаеться проанал1зувати за допомогою проточного тиск нтоза або тиск нтозами мжроскопа.
Об'ектом дослщжень були кл1тини р1зного походження , переважно Ti, що на думку дослщниюв, могли бути продуцентами цитоюшв. Серед них найчастше використовувалися л1мфоцити - основш ¿мунокомпетентш кл1тини. Важливою умовою усшшного анал1зу е життездатшсть кл1тин. Кшьюсть живих кл1тин у cycnemii' повинно бути не менше 90%, осюльки внутршньокл1тинний тест1, вимагае стимуляци кл1тин in vitro.
Для виявлення цитоюшв у кров1 антикоагулянтом повинен бути лише гепарин у ф1зюлопчних концентрациях, осюльки часто вживаний для ще! мети ЕДТА зв'язуе Ca , потр1бний для процеЫв активаци кл1тин. Застосування ЕДТА можливо для видшення окремих популяцш кл1тин (наприклад на rpafliemi фколу).
В даний час описано велика юльюсть комерцшних реагенпв в якост1 шдуктор1в продукцп цитоюшв, блокатор1в, умов культивування та фарбування специф1чними антитшами [12]. В них застосовуеться як двоетапна (фжсащя з
© Маслянко Р.П., Божик Л.Я., Пукало П.Я., 2013
123
наступною пермеабЫзащею), так I тиск нтоза (фксащя I пермеабЫзащя одночасно) технолопя. В основ! фжсуючого агента найчастше використовують формальдегщ ( 0,5-2% ), в основ1 пермеабЫзуючого агента - сапонш ( 0,51,0%). Цд реагенти дозволяють проводити дослщження як з видщеними окремими кл1тинами, так I з цшьною кров'ю.
Було встановлено, що для видшення внутршньокл1тинних цитоюшв потр1бно дотримуватися стандартних розчишв специф1чних антитш. Для цього рекомендуеться пряме ¿мунофлюоресцентне забарвлення. Якщо кон'югати антитщ з флюорохромом недоступш, то можна використовувати некон'юговаш антитща з наступним фарбуванням кон'югатом вторинних антитщ з флюорохромом. В якост1 контролю такого фарбування можна використовувати ¿зотиповий контроль - надлишок чи некон'юговаш антитща до цитоюна, тиск нтозами з надлишком рекомбшантного цитоюну або нестимульоваш кл1тини.
Що стосуеться штервал1в норм то 1х визначають за результатами дослщжень донорсько! регюнально! популяцп. Пор1вняння норм, отриманих р1зними дослщниками, досить складно, оскшьки немае поки що стандартного методу постановки цього важливого тесту.
Окремого розгляду заслуговують питания вжових особливостей експресп внутр1шньокл1тинних цитоюшв. Добре вщомо, що наслщок будь-яко! шфекцшно! хвороби залежно вщ вжу може бути р1зним очевидно, значну роль в цьому ввдграе цитоюновий фон, властивий р1зним вжовим групам. Найбшьш чутливими до шфекци е молодняк раннього вжу, а також стар1 тварини: перш1 внаслщок незрщост1 ¿мунно! системи, друп в результат! вжово! шволюцп тимусу та шших ¿мунокомпетентних оргашв.
У новонароджених тварин кщькють потенщальних кл1тин - продуцента цитокмв е значно бщьшою, шж у дорослих, однак ця кщькюна перевага супроводжуеться недостатньою функцюнальною актившстю кл1тин вщповщно низьким р1внем продукцп цитоюшв. Що стосуеться подщу основних ¿мунокомпетентних кл1тин Т-гелпер1в на Т-гелпери 1-го та 2-го титв (вщповщно на Тг1 { Тг2), тут також спостер1гаеться загальна тенденщя: нав1ть у стимульованих культурах л1мфоцит1в юльюсть 1ФН-у - мютимих кл1тин вкрай мало[7]. При цьому у новонароджених число 1Л-2 експресуючих СД4 -л1мфоцш!в бшьше (мабуть за рахунок Т-г О), а вмкт СД41Л-4 менше, шж у дорослих [11].
3 вжом юльюсть 1ФН-у 1Л-4 мютимих кл1тин поступово збшьшуеться. В популяцп людей спостер1гаеться позитивна корелящя вщносно! юлькостс Тг 1 цитотокчичних л1мфоцит1в 1-го типу Тц1 I Тг2 та абсолютно! юлькоси Тг 1 I Тц 1 з вком [14].
Баланс Тг1 Тг2 титв.
Головне клмчне значения в оцшщ ¿мунолопчного захисту в оргашзм1 тварин мае оцшка сшввщношення Тг1 до Тг2. На сьогодшшнш день внутр1шньокл1тинна експреая 1ФН-у I 1Л-4 е найбщьш достов1рним маркером вщповщно Тг1 I Тг2. Власне, д1агностичного значения цей тест не мае ш при
124
однш ¿з вщомих патологш, однак може представляти цшшсть для визначення загального стану пащента та динамжи розвитку хвороби.
Концепщя балансу Тг1/Тг2 з'явилася в 1980- роках. В перше наявшсть таких кл1тин було показано на мишах [18 ], а пот1м адаптовано на модель шших тварин I людини [19]. У вщповщност1 з щею концепщею Тп беруть участь у захист1 проти внутршньокл1тинних патогешв, у протипухлинному ¿муштет1 та реакцп гшерчутливост1 сповщьненого типу. Тг2 зад1яш в ¿муннш вщповвд проти багатокл1тинних паразита. На шзшших етапах дослщжень було показано, що формування цих двох титв кл1тин ¿з "на1вних" неактивних СД4 л1мфоцитта (ТгО), очевидно, залежить вщ поеднання деюлькох фактор1в. До них вщноситься тип I доза АГ, природа антигенпредставляючих кл1тин, контактш взаемодп, розчинш фактори (цитоюни, гормони) [3]. Найбщьш значну роль у диференщаци Т-гелпер1в СД4 надають цитоюнам. Вважаеться, що 1Л-12, який продукуеться антигенпрезентуючими кл1тинами при контакт! з шфекцшними агентами, спрямовуе диференщацш в бш Тг 1. Под1бну, але менш виражену дш виявляе 1ФН-у. Стосовно Тг2, то його розвиток стимулюеться завдяки присутност11Л-4.
Останшм часом видщяють також цитотоксичш л1мфоцити першого I другого титв (Тц1 I Тц2), для яких характерш фенотип СД3, СД8 та продукщя цитоюшв, яю продукуються Тг 1 I Тг 2. Недавно був виявлений ще один тип Т-гелпер1в - ТИ17, який продукуе 1Ь-17[11]. Цим кл1 тинам надають великого значения у розвитку ауто1мунних процеав.
У випадку порушень стввщношень Тг1/Тг2 I переважання одного з них розвиваються р1зш патолопчш стани. Переважання Тг1 виражаеться пщвищеною тиск нтозами ст оргашзму з формуванням
органоспециф1чних ауто1мунних захворювань [3].
Зрушення р1вноваги в б1к Тг2-кл1тин лежить в основ! формування алерпчних реакцш I системних ауто1мунних симптом1в [13].
До захворювань пов'язаних з порушенням Тг1 вщносяться туберкульоз. Т-гелпери 1-го типу вщ1грають важливу роль у боротьб1 з м1кобактер1ями [15]. Порушення продукци фактор1в чи дефект структур, яю впливають на формування Тг1 можуть виражатися на розвитку пщвищено! сприйнятливост1 до збудниюв туберкульозу. Так, за даними [15] замша Т на А в першому тиск н гена 1ФН-у призводить до зниження продукци1ФН-у I пщвищуе ризик розвитку туберкульозу майже в 4 рази. Продукщя 1ФН-у у хворих туберкульозом АА-гомозигот значно нижча, шж у ТА та ТТ-пащент1в, а клмчно хвороба протжае значно тяжче. 1з клшчних спостережень вщомо, що при гострому переб1гу хвороби юльюсть 1ФН-у-мютимих СД3-л1мфоцита (головна частина яких складае Тг1 - кл1тини) у хворих на туберкульоз значно зменшена. В перюд ремки 1х число наближаеться до нормальних величин [1]. Це саме показано для хворих з шшими м1кобактер1альними шфекщями [4].
Другим, широко розповсюдженим серед людей захворюванням е синдром ¿мунодефщиту (СШД). Головним ¿мунним порушенням у В1Л-шфшованих пащента, е значне зниження юлькоси СД4+ Т-гелпер1в, серед яких
125
знаходяться 1ФН-у-продукуюч1 кл1тини. 1ФН-у ввдграе важливу роль у против1русному захистг Внутр1шньокл1тинний анал1з продукцп 1ФН-у I 1Л-4 показуе, що зниження стввщношень Тг1/Тг2 вщбуваеться за рахунок зменшення кшькост1 Тг1 [171. В шших роботах показано, що у В1Л-шф1кованих д1тей теля курсу антиретров1русно! терапп спостер1галося часткове вщновлення продукцп 1ФН-у без збшьшення загального числа СД4-Т-кл1тин [21]. Под1бт наслщки наведен! у д1тей з пом1рним ступенем ¿мунодепресп при шфжування В1Л типу Е 1 пщвищеним вмктом СД4 1ФН-у та СД4 1Л-4+ пор1вняно з нешфжованими д1тьми [24].
При алерпчних захворюваннях атотчних дерматитах вщм1чаеться порушення формування Тг1 або переважання Тг2 в систем! кл1тинного захисту. При вказаних трупах хвороб, як правило, спостер1гаеться зрушення балансу) Тг1/Тг2 в бш Тг2, тому, очевидно, дослщженням внутр1шньокл1тинних цитоюшв при названих хворобах присвячено значна юльюсть роб1т.
При стимуляци кл1тин периферично! кров1 хворих з атошчним дерматитом або алерпчним синдромом неспециф1чними шдукторами дослщники спостер1гали зростання юлькост1 СД4+ 1Л-4-л1мфоцит1в на фот нормальних величин СД4 1ФН-у [14]. В окремих випадках не вщм1чено порушень стввщношення Тг1/Тг2 [16], однак виявлено шш1 змши цитоюнового профшю. Дисбаланс в б1к Тг2 при атонп не означав зниження продукцп 1ФН-у.
Вщм1чено також змши стввщношень Тг1/Тг2 при травмах, запальних процесах на шюр1 та х1рурпчних втручань. Ушкодження шюри створюе додатков1 вхщш ворота для шфекцп та мобЫзуе систему ¿муштету. Швидюсть загоення пошкоджень залежить вщ ефективност1 антимжробного захисту та процеав репарацп. Важю пошкодження, як I оперативш втручання, супроводжуються зрушеннями стввщношення Тг1/Тг2 в б1к Тг2, або за рахунок збшьшення юлькосп Тг2 [20], або за рахунок зниження р1вня Тг1, або за рахунок одночасного зниження вмкту Тг1 I пщвищення р1вня Тг2 [20]. При цьому характер зрушення залежить вщ величини оперативного втручання. Так, в робот1 [19] показано, що вже на 3-й день теля складно! операцп з приводу пухлини шлунка тдвищуеться вмкт Тг1 з периферично! кров1 на вщмшу вщ звичайно! вщкрито! лапаротоми. У тсляоперацшний перюд спостер1гаеться також зниження р1вня 1Л-2 та значне зростання кшькосп СД8-кл1тин.
Таким чином, в перш1 дш теля важких травм або оперативних втручань вщбуваються зрушення стввщношення Тг1/Тг2 в б1к Тг2, очевидно, внаслщок перерозподшу кл1тин ¿мунно! системи у вогнищ1 ураження. Надал1, при сприятливому переб1гу реабштацшного перюду стввщношення повинно вщновлюватися. Вщм1чена залежшеть зниження кшькосп Тг1 чи фактор1в диференщаци цих клпин або пщвищення р1вня Тг2 з частотою шфекцшних ускладнень, що може бути використаною в якост1 прогнозуючого фактора в ктшчнш практищ.
На пщстав1 проведеного анал1зу лператури можна прийти до висновку, що змши цитоюшв на р1вш одте! клпини - перспективний функцюнальний
126
тест, який дозволяе одночасно вивчати цитокшовий профшь i субпопуляцшний кл1тинний склад дослщного матер1алу. Цей метод може бути використаний як для иаукових, так i для клмчних дослщжень i може стати цшним доповиениям до стаидартиих метод1в дослщжень ¿мунно! системи в кшшчнш ¿мунологп.
Л1тература
1. Комогорова З.Э. Уровень СД3+-лимфоцитов, содержащих интерферон-у, у больных туберкульозом легких и его изменение после включения в комплексную терапию полиоксидония / З.Э. Комогорова // Иммунология. - 2004. - №4. - С.210- 212.
2. Маслянко Р. Основи ¿мунобюлогп / Р. Маслянко - Льв1в, Вериткаль. -1999. - 472 с.
3. Останик А.А. Цитокиновый профиль семенной плазмы / А.А. Останик, Б.И. Айзикевич, Е.Р. Черных // Пробл. Репрод. - 2006. - №6 - С.65-74.
4. Пичугина Л.В. Внутриклеточные цитокины: проблемы детекции и клиническое значение / Л.В. Пичугина, Б.В. Пинегин // Иммунология. — 2008. -№1. — С.55-63.
5. Andersson U. Enumeration of IFA-gamma producing cells by flow cytometry. Comparison with fluorescencemicroscopy / U. Andersson, G. Hallden, U. Persson et.al. // J. Immunol. Dreth. - 1988. - V. 112. - P. 139-142.
6. Bellardelli F. Citokines as a link between innate and тиск нт antitumor immunity / F. Bellardelli // Trends Immunol. - 2002. - V.23. - P. 201-208.
7. Buck R.H. Londitudinal study of intracellular Teell cytokine production in infants compared to adults / R.H. Buck, C.T. Cordle, D.J. Thomas et al. // Clin. Exp. Immunol. - 2002. - V. 128 - P.490-497.
8. Dranoff G. Cytokines in cancer pathogenesis and caner therepy / G. Dranoff // Cancer. - 2004. - V. 4. - P. 112-122.
9. Boshyam H. IL-12: a master regulator / H. Boshyam // J. Exp. Med. -2007. - V.204. - P. 969- 971.
10. Fuju K. T-lymphocyte subsets and Th1/Th2 balance affer laparascopy-assisted distal gastroectomy / K. Fuju, K. Sonoda, K. Izumi et.al. // Surg. Endose. -2003. - V. 17. - P. 1440-1444.
11. Hartel C. Cytokine responses correlate differentially with age in infancy / C. Hartel, N. Adam // Clin. Exp. Immunol. - 2005. - V. 142. - P. 446-453.
12. Hedger M.P. Cytokines and the immune - testicular axis / M.P. Hedger, A. Meinhardt // Reprad. Immunol. - 2003. - V. 58. - P. 1-26.
13. Kidd P. Thl/Th2 balance: the тиск нтоз? Its limitations for health and disease / P. Kidd // Altorn Med. Rev. - 2009. - V. 8. - P. 223-246.
14. Kawamoto N. Age - related changes in intracellular cytokine profiles and Th2 dominance in allergic children / N. Kawamoto, H. Kaneko, M. Takemura et al. // Pediatr. Allergy Immunol. - 2006. - V. 17. - Р.125-133/
15. Lopez-Moderuelo D. Interferon-y, IL-10 gene тиск нтозам in pulmonary tuberculosis / D. Lopez-Moderuelo, F. Arnalich, R. Serantes et al. // Am. J. Respir. Care Med. - 2003. - V. 167. - P. 970-975.
16. Machura E. Intracellulace production of IL-2, IL-4, IFN-y by peripheral
127
blood CD3+ and CD4+ T cells in children with atopic dermatitis / E. Machura // Enr. J. Pediatr. - 2007. - V. 166. - P. 789-795.
17. Meyadrd L. Single cell analysis of IL-4 and IFN-gamma production by T cells from HIV - infected individuals: decreased IFN-gamma in the presence of preversed IL-4 production / L. Meyadrd // J. Immunol. - 1996. - V.157. - P. 27122718.
18. Mosmann T.R. Two types of murine helper T cells clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities secreted proteins / T.R. Mosmann, H. Cherwinski, M. Bond et al. // J. Immunol. - 1986. - V. 136. - P. 2348-2357.
19. Mosmann T.R. Thl and Th2 cells: different pattoms of lymphokine secretion lead to different functional properties /T.R. Mosmann, R.L. Coffman // Annu. Rev. Immunol. - 1989. - V.7 - P.145-173.
20. Potter K.J. Thl and Th2 subsets in orthopedic surgery by single - cell cytokine analysis / K.J. Potter // Clin. Lab. - 2003. - V.49. - P.197-202.
21. Reuben J.M. Mognitude of 1FN -y production in HIV-1 infected children is associated with virus suppression / J.M. Reuben, B.N. Lee, M. Paul // J. Allegy Clin. Immunol. - 2002. - V. 110. - P. 255-261.
22. Santa S. Cytokine network at the feto-maternal interface / S. Santa // Repr. Biol. - 2006. - V. 125. - P. 171-176.
23. Sehluns K.S. Cytokine control of memory T cell development and survival / K.S. Sehluns, L. Lefranccis // Nat. Rev. Immunol. - 2003. - V.3. - P. 269279.
24. Sukwit S. Flow cytometric detection of intracellular cytokines in peripheral blood of HIV-1 infected Thai children / S. Sukwit, T. Chuenchitra, R. Samakoses et al. // Arian Pac. J. Allergy Immunol. - 2001. - v. 19. - P.107-113.
Summary
Maslianko R.P., Bozhyk L.Ya., Pukalo P.Ya.
Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnology namedof S.Z. Gzickyj
The article contains data of study of intracellular T cell production cytokines, and its role in animal pathology.
Рецензент - д. б. н., професор Куртяк Б.М.
128
