CC BY
86
challenge for ongoing universal access to antiretroviral treatment and HIV prevention in Cameroon. PLoS One. 2009; 4(11): 7702-7.
8. Damond F., Worobey M., Campa P., Farfara I., Colin G., Matheron S. et al. Identification of a highly divergent HIV type 2 and proposal for a change in HIV type 2 classification. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2004; 20(6): 666-72.
9. Ibe S., Yokomaku Y., Shiino T., Tanaka R., Hattori J., Fujisaki S. et al. HIV-2 CRF01_AB: First Circulating Recombinant Form of HIV-2. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2010; 54(3): 241-7.
10. Peterson K., Jallow S., Rowland-Jones S.L., de Silva T.I. Antiretroviral therapy for HIV-2 infection: recommendations for management in low-resource settings. AIDS Res. Treat. 2011; 2011. Article ID 463704.
11. Matheron S., Pueyo S., Damond F., Simon F., Lepretre A., Campa P. et al. Factors associated with clinical progression in HIV-2 infected-patients: the French ANRS cohort. AIDS. 2003; 17(18): 2593-601.
12. Прасолова М.А., Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Разработка высокочувствительного устойчивого к нуклеотидным несовпадениям ПЦР-теста для качественного и количественного определения РНК ВИЧ-1. Вопросы вирусологии. 2011; 56(1): 24-9. Prasolova M.A., Ivanov M.K., Dymshits G.M. The development of an ultrasensitive mismatch tolerant PCR assay for detection and quantitation of HIV-1 RNA. Voprosy virusologii. 2011; 56(1): 24-9 (in Russian).
13. Finney D.J. Probit analysis. 3-rd. Cambridge: University Press; 1980.
14. Holmes H., Davis C, Heath A. Development of the 1st International Reference Panel for HIV-1 RNA genotypes for use in nucleic acid-based techniques. J. Virol. Methods. 2008; 154: 86-91.
Поступила 18.11.13 Received 18.11.13
A SINGLE-TUBE REAL-TIME RT-PCR ASSAY FOR THE RNA DETECTION AND QUANTIFICATION OF GENETICALLY DIVERSE HIV INCLUDING RARE NON-M GROUP OF THE HIV-1 AND HIV-2
Prasolova M. A.1-2-3, Ivanov M. K. 1-2-3, Gashnikova N. M.4, Netesova E. S.2, Dymshits G. M.3-5
'Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2Vector-Best JSC, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 3Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia; 4State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 5Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia
The RT-PCR method with real-time fluorescence detection was used for development of $ prototype of diagnostic kit for reliable diagnosis of genetic variants of RNA of the HIV-1of groups M, N, O, P and RNA of the HIV-2 in blood plasma and serum. The kit is stable against nucleotide defects, provides broad linear range of concentration of the HIV RNA, 100% analytical specificity and adequate analytical sensitivity: 42 ME/ml (HIV-1 of group M), 45 copies/ml (HIV-2), 92 copies/ml (HIV -1 of group O), 90 copies/ml (HIV -1 of group N). The kit provided successful detection and measurement of HIV RNA concentration in the samples of the international reference panel of the HIV-1 genotype. The results of the test correlate with results of commercial tests.
Key words: HIV-1, group O, HIV-2, stability against nucleotide defects, RT-PCR
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.833.27:578.5].083.2
ЯшинаЛ.Н.1, Малышев Б.С.1, Нетесова Н.А.1, Волынкина А.С.2, ВасиленкоН.Ф.2
ВИРУС КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ, ЦИРКУЛИРОВАВШИЙ В СТАВРОПОЛЬСКОМ КРАЕ В 2011 г.
1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области; 2ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, Ставрополь
Проведен генетический мониторинг вируса крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), циркулировавшего на территории Ставропольского края в 2011 г Методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции с последующим секвенированием генотипированы 14 РНК изолятов вируса, выделенных от больных Крымской геморрагической лихорадкой (КГЛ). Анализ последовательностей фрагмента M-сегмента генома (позиции 2607-2932) вируса ККГЛ подтвердил циркуляцию на территории края европейского генетического типа Европа 1. В дополнение к ранее выявленному генетическому варианту STV/ROS данного генотипа, на территории Ставропольского края выявлен второй генетический вариант VLG/ROS. Ключевые слова: вирус крымской-конго геморрагической лихорадки; генотип; Ставропольский край.
Вирус крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), принадлежащий к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae, распространен на обширной территории Европы, Азии и Африки [2, 5]. На территории России природные очаги КГЛ зарегистрированы в Ставропольском крае, Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, республиках Калмыкия, Дагестан и Ингушетия. В течение последних 13 лет, с 1999 по 2011 гг., наибольшее число случаев КГЛ отмечено
Для корреспонденции: Яшина Людмила Николаевна (Yashina Li-udmila Nikolaevna), зав. лаб. разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», докт. биол. наук; e-mail: yashina@vector.nsc.ru,
For correspondence: Yashina Liudmila Nikolaevna; e-mail: yashina@ vector.nsc.ru
на территории Ставропольского края, где зарегистрировано 548 больных из общего числа 1501 учтенного случая [1]. Клиническая картина заболевания варьировала от легких форм лихорадки без геморрагического синдрома до тяжелых форм, которые в 4,5 % случаев приводили к летальным исходам.
На основании анализа вирусного генома, состоящего из трех сегментов РНК отрицательной полярности, выделяют 7 географически и генетически различающихся генетических типов вируса ККГЛ [2, 3]. На территории Европы циркулирует два генетических типа, один из которых, обозначаемый в разных работах как тип VI, Greece или Европа 2, выявлен в Греции и Турции. Второй генотип, обозначаемый как тип V, Europe/ Turkey или Европа 1, распространен вокруг Черного моря на территории Европы, включая южные регионы России, и в Турции. Исследования инфицированных клещей рода Hyalomma - переносчиков вируса и образцов крови больных ККГЛ, проведенные в 2000 г., показали, что на территории Ростовской, Волгоградской областей и Ставропольского края циркулируют 2 генетически различающихся варианта генотипа Европа 1 [6]. Генетический вариант Волгоград-Ростов (VLG/ROS) выявлен на территории Волгоградской и Ростовской областей вокруг Цимлянского водохранилища, РНК изоляты генетического варианта Ставрополь-Ростов (STV/ROS) обнаружены на территории Ставропольского края и юга Ростовской области.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2014
Рис. 1. Филогенетическое дерево, отображающее взаимосвязи исследованных вариантов вируса ККГЛ из Ставропольского края и штаммов из других регионов мира. Дерево построено на основе нуклеотидных последовательностей М-сегмента генома (позиции 2607-2932) с использованием метода Ш, индексы поддержки рассчитаны для 1000 повторов. Жирным шрифтом выделены исследованные варианты вируса ККГЛ из Ставропольского края.
Целью настоящего исследования явился генетический мониторинг вируса ККГЛ, циркулировавшего на территории Ставропольского края в 2011 г.
Материалы и методы
В работе использовали 25 образцов от больных с диагнозом ККГЛ, собранных в течение 2011 г. в Ставропольском крае. Пробы представляли собой сыворотки крови, взятые на 1-18-й день от начала заболевания.
Выделение суммарной РНК из проб проводили с использованием набора Рибо-преп («Интерлабсервис», Москва), согласно инструкции производителя. Полученные препараты суммарной РНК протестированы методом обратной транскрипции - поли-меразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием ранее описанного набора праймеров, специфичного к M-сегменту генома [6].
Для проведения обратной транскрипции использован набор РЕВЕРТА-L (Интерлабсервис, Москва). Для ПЦР-амплифика-ции использована Taq ДНК полимераза («Сибэнзим», Новосибирск).
ДНК выявляли с помощью метода электрофореза в 1,5% ага-розном геле. Полоски геля, содержащие фрагменты ДНК ожидаемого размера, вырезали и извлекали ДНК, используя набор для очистки QIAquick Gel Extraction Kit («QIAgen GmbH», Германия). Определение нуклеотидных последовательностей каждой из цепей ампликонов проводили на автоматическом анализаторе 3130XL («Applied Biosystems»).
Нуклеотидные последовательности фрагментов М-сегмента генома вируса ККГЛ, определенные в настоящей работе, сравнивали с соответствующими последовательностями других изо-лятов вируса ККГЛ, полученными из базы данных GenBank. Для сравнения использовали последовательности с регистрационными номерами GenBank: DQ211630, DQ211631, AY093620, AY093624, AY093625, AF401645, AF401647-AF401651, AY675511, AY900145, AY093626, AY467769, DQ446216, HQ378186, HM452306, AF467768, DQ019222, DQ211627, DQ211626, AB069675. При построении филогенетических деревьев сравнение последовательностей осуществляли методом ближайших соседей с использованием программы MEGA 4.0 [4]. Вычисления проводили для 1000 итераций.
Установленные нуклеотидные последовательности штаммов вируса ККГЛ зарегистрированы в базе данных GenBank под номерами KF425575- KF425588.
Результаты и обсуждение
Методом ОТ-ПЦР выявлены и проанализированы 14 РНК-изолятов вируса от больных ККГЛ. Для ге-нотипирования выбран фрагмент M-сегмента генома длиной 326 п.о., ранее позволивший идентифицировать два генетических варианта вируса ККГЛ из очагов, расположенных на территории Ростовской, Волгоградской областей и Ставропольского края [6].
Филогенетический анализ полученных последова-
Рис. 2. Географическое расположение мест жительства больных из Ставропольского края, от которых были выявлены варианты вируса ККГЛ. Генетические варианты STV/ROS обозначены треугольниками, генетические варианты VLG/ROS обозначены кружками.
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2014
тельностей, выполненный методом «ближайших соседей», выявил группирование новых РНК-изолятов в составе двух ранее выявленных генетических вариантов вируса ККГЛ: VLG/ROS из Волгоградской и Ростовской областей (район Цимлянского водохранилища) и STV/ROS из Ставропольского края и южных районов Ростовской области (рис. 1). Большая часть РНК изоля-тов, 11 из 14 (5317, 5327, 5339, 5346, 5349, 5353, 5355, 5359, 5371, 5387, 5389), группировались совместно с РНК-изолятами генетического варианта STV/ROS, ранее выявленного на территории Ставропольского края. Однако среди исследованных РНК-изолятов от больных из Ставропольского края были обнаружены 3 образца (5315, 5338, 5382), которые вошли в группу VLG/ ROS, ранее на территории не выявленную. Наиболее вероятным объяснением данного факта является более представительный набор образцов из Ставропольского края, исследованных в настоящей работе, что позволило полнее охарактеризовать варианты вируса, циркулирующего на территории края.
Сравнительный анализ установленных последовательностей фрагмента 2607-2932 M-сегмента генома показал, что различие нуклеотидных последовательностей новых РНК-изолятов из Ставропольского края внутри каждого из генетических вариантов составляет 0,3-1,8%, различие между вариантами - 3,7-5,2%. Эти цифры не превышают ранее выявленные внутри- и межгрупповые различия [6]. Выявленные в 2000-2001 и 2011 г. РНК-изоляты были близки друг другу. Уровень различия последовательностей РНК изолятов 2011 г. с ранее опубликованными последовательностями РНК-изолятов 2000-2001 гг. находился в пределах ранее выявленных и составлял 0,3-2,2% для внутригрупповых и 3,7-4,6% для межгрупповых различий.
Полученные результаты свидетельствуют о стабильности генетических вариантов вируса ККГЛ, циркулирующего в очаге, расположенном на юге европейской части России.
Результаты анализа географического расположения мест проживания больных из Ставропольского края (2011 г.), представленные на рис. 2, показали, что ареалы каждого из генетических вариантов вируса ККГЛ перекрываются. Территория распространения генетического варианта VLG/ROS занимает Волгоградскую, Ростовскую области и захватывает часть Ставропольского края. Геновариант STV/ROS ранее выявлен на территории Ставропольского края и южных районов Ростовской области, что подтверждено данными настоящего исследования. Пограничная территория расположена в северной части Ставропольского края на территории Красногвардейского, Труновского и Туркменского районов. Так, геновари-анты VLG/ROS и STV/ROS были обнаружены у двух жителей села Донское Труновского района, не выезжавших за пределы района.
Какова причина существования двух различающихся вариантов генотипа V (Европа 1) на географически близких и даже перекрывающихся территориях юга России? В настоящее время в литературе выдвинута гипотеза о распространении и формировании очагов ККГЛ на разных территориях в результате единичных случаев заноса вирусов из других территорий, распространения за счет природных миграций клещей-переносчиков вируса ККГЛ и его независи-
мой эволюции в новых очагах [5]. Источником локальных вариантов вируса на территории Европы по предположению авторов является Турция. Если принять эту гипотезу, то формирование двух геновариан-тов вируса произошло в результате двух независимых по времени фактов заноса вируса в южные регионы России и его дальнейшего распространения среди переносчиков вируса, клещей Hyalomma marginatum. Распространение вируса привело к территориальному взаимопроникновению различных вариантов вируса ККГЛ и образованию пограничной территории, на которой можно выявить оба варианта. Полученные данные подтверждают существование двух независимых очагов ККГЛ на территории юга России и уточняют их географическое распространение.
Сведения об авторах:
Яшина Людмила Николаевна (Yashina Liudmila Nikolaevna) - зав. лаб. разработки средств ПЦР-диагнос-тики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», докт. биол. наук; e-mail: yashina@vector.nsc.ru, почтовый адрес 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского р-на, Новосибирской обл., ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Малышев Борис Сотиволдиевич (Malyshev Boris Sotivoldievich) - мл. науч. сотр., отд. разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; e-mail: malyshevb@vector.nsc.ru,
Нетесова Нина Александровна (Netesova Nina Alexan-drovna) - д-р биол. наук, зав. отделом разработки средств ПЦР-диагностики вирусных заболеваний ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»; e-mail: ninanet@vector.nsc.ru,
Волынкина Анна Сергеевна (Volynkina Anna Serge-evna) - мл. науч. сотр., ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт; e-mail: snipchi@ mail.stv.ru; почтовый адрес: ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противо-чумный институт, 355035, г. Ставрополь, ул. Советская, 13-15
Василенко Надежда Филипповна (Vasilenko Nadezhda Philippovna) - д-р биол. наук, вед. науч. сотр. ФКУЗ Ставропольский научно-исследовательский противо-чумный институт. e-mail: snipchi@mail.stv.ru
ЛИТЕРАТУРА/REFERENSES
1. Василенко Н.Ф., Смоленский В.Ю., Волынкина А.С., Варфо-ломеева Н.Г., Заикина И.Н., Малецкая О.В. и др. Особенности эпидемиологической обстановки по Крымской геморрагической лихорадке в Российской Федерации в 2011 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; 111: 22-5.
Vasilenko N.F., Smolensky V.Yu., Volynkina A.S., Varfolomeeva N.G., Zaikina I.N., Maletskaya O.V. et al. Peculiar aspects of epidemiological situation on Crimean hemorrhagic fever in the Russian Federation in 2011. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; 111: 22-5 (in Russian).
2. Deyde V.M., Khristova M.L. Rollin P.E., Ksiazek T.G. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus genomics and global diversity. J. Virol. 2006; 80(17): 8834-42.
3. Hewson R., Gmyl A., Gmyl L., Smirnova S.E., Karganova G., Jamil B. et al. Evidence of segment reassortment in Crimean-Congo haem-orrhagic fever virus. J. Gen. Virol. 2004; 85: 3059-70.
4. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA: molecular evolutionary genetics analysis. Version 4.02 (computer program). University Park, PA: Penn. State Univ.; 1993.
5. Mild M., Simon M., Albert J., Mirazimi A. Towards an understanding of the migration of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. J. Gen. Virol. 2010; 91: 199-207.
6. Yashina L., Vyshemirskii O., Seregin S., Petrova I., Samokhvalov E., Lvov D. et al. Genetic analysis of Crimean-Congo hemorrhagic fever in Russia. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 860-2.
Поступила 03.10.13 Received 03.10.13
CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS IN STAVROPOL REGION IN 2011
Yashina L. N.1, Malyshev B. S.1, Netesova N. A.1, Volynkina A. S.2, VasilenkoN. F. 2
1 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 2Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russia
The genetic analysis of the Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) virus circulating in Stavropol region during 2011 year was suggested. A total of 14 RNA isolates from the Crimean hemorrhagic fever patients were genetically typed. The genetic analysis of the CCHF virus strains based on M-segment sequences (positions 2607-2932) supported the circulation of the genotype Europe 1 in the Stavropol region of Russia. In addition to previously known lineage STV-ROS, the second lineage VLG/ROS was observed in Stavropol region.
Key words: Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, genotype, Stavropol
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.82/.83:577.21.083
Булгаков А. Д.1, Гребенникова Т. В.2, Южаков А. Г.2, Алипер Т. И.2, Непоклонов Е. А.1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИз ГЕНОМОВ ВИРУСОВ РЕСПИРАТОРНО-РЕПРОДУКТИВНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ЦИРКОВИРУСА
второго типа, циркулирующих на территории российской федерации
Московский государственный университет пищевых производств, 125080, Москва; 2НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского
Минздрава России, 123098, Москва
Представлен молекулярно-генетический анализ геномов вирусов респираторно-репродуктивного синдрома свиней (ВРРСС) и цирковируса второго типа (ЦВС-2), циркулирующих на территории РФ. Результаты исследования показали циркуляцию штаммов европейского генотипа ВРРСС, сходных с изолятами, выделенными на территории Франции, Дании с 1998 до 2001 г. Показана гомологичность по фрагменту одного из генов российских изолятов вакцинному штамму, используемому в вакцине Роги^ PRRS (Интервет), что требует дальнейшего изучения. Не обнаружено североамериканских генотипов вируса РРСС. Геномы исследованных ЦВС-2 образуют 3 отдельных группы. Одна формируется изолятами, выделенными на территории Малайзии, Бразилии, Швейцарии, Китая, Словакии, Великобритании, США в период с 2004 г. до настоящего времени (генотип 2Ь). Во вторую группу входят полевые изоляты вирусов, выделенные с 2000 по 2012 г. в Канаде, США, Китае и Южной Корее (генотип 2а). Третья группа формируется высокопатогенными изолятами, выделенными в 2013 г. в Китае (генотип 2с). Показана циркуляция всех 3 известных генотипов ЦВС-2: 2а, 2Ь и 2с на территории РФ.
Ключевые слова: молекулярно-генетический анализ, филогенетический анализ, вирус респираторно-репродуктивного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа.
Серьезный экономический ущерб свиноводческим предприятиям по всему миру наносят нарушения воспроизводительной функции свиней. Заболеваемость поросят респираторными заболеваниями составляет 30-70%, летальность может достигать 40% [1]. Наиболее распространенными вирусными агентами репродуктивных патологий свиней являются вирус рес-пираторно-репродуктивного синдрома свиней (РРСС) и цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2).
РРСС - вирусное контагиозное заболевание, характеризующееся нарушением респираторной и репродуктивной функций. Заболевание известно с 1980 г, впервые зарегистрировано в Канаде. На сегодняшний день РРСС - заболевание, регистрируемое практически на всех континентах с развитым промышленным свиноводством [2]. В последнее время распространение РРСС приобрело характер панзоотии. Исключением можно считать австралийский континент и страны Океании [3].
Возбудитель болезни - РНК-содержащий оболо-чечный вирус, размер генома которого составля-
ет 15,1-15,4 тыс. нуклеотидов (т.н.), относится к роду АНегтгш, семейства Arteriviridae, порядку Nidovirales. К настоящему времени выявлены 2 генотипа РРСС: европейский и североамериканский, прототипами которых являются соответственно штамм «Lelystad» и штамм VR-2332. Эти 2 генотипа вируса РРСС имеют от 50 до 80% гомологии на нуклео-тидном уровне [4, 5]. По-видимому, европейские и североамериканские типы вируса имеют различные эволюционные истории, так как их геномы сильно различаются [6]. Отличительной чертой вируса является вариабельность геномов его изолятов [7, 8]. В настоящее время и на европейском, и на американском континентах присутствуют оба генотипа вируса. Зарегистрировано появление высоковирулентного вируса РРСС в Китае [9].
ЦВБС - вирусное заболевание свиней, главным образом поросят. ЦВС-2 обнаруживается при различных заболеваниях свиней, таких как синдром по-слеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ), синдром дерматита и нефропатии свиней (СДНС), при репродуктивных нарушениях и респираторных болезнях свиней. Ретроспективными серологическими исследованиями показано, что ЦВС-2 циркулирует в свиноводческих хозяйствах с 1969 г. [10].
Возбудитель инфекции ЦВС-2, относится к роду Circovirus, семейства Сirсоviridае. Это мелкий без-оболочечный икасаэдрический вирус, содержащий замкнутую односпиральную геномную ДНК, размером около 1767-1768 нуклеотидов. Помимо патогенного ЦВС-2 также существует непатогенный ЦВС-1, который был обнаружен как нецитопатогенный кон-таминант перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15 [11]. Гомология их геномов составляет 76% [12]. ЦВС-2 подразделяют на основании генетических различий в области второй открытой рамки считывания (ORF2) на генотипы ЦВС-2а, ЦВС-2Ь и ЦВС-2с. Изменения в тяжести, с которой протекают заболевания, в последнее время многие исследователи связывают со сменой генотипов от ЦВС-2а к ЦВС-2Ь и ЦВС-2с [13].
