CC BY
186
CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS IN STAVROPOL REGION IN 2011
Yashina L. N.1, Malyshev B. S.1, Netesova N. A.1, Volynkina A. S.2, VasilenkoN. F. 2
1 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 2Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russia
The genetic analysis of the Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) virus circulating in Stavropol region during 2011 year was suggested. A total of 14 RNA isolates from the Crimean hemorrhagic fever patients were genetically typed. The genetic analysis of the CCHF virus strains based on M-segment sequences (positions 2607-2932) supported the circulation of the genotype Europe 1 in the Stavropol region of Russia. In addition to previously known lineage STV-ROS, the second lineage VLG/ROS was observed in Stavropol region.
Key words: Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, genotype, Stavropol
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 578.82/.83:577.21.083
Булгаков А. Д.1, Гребенникова Т. В.2, Южаков А. Г.2, Алипер Т. И.2, Непоклонов Е. А.1
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИз ГЕНОМОВ ВИРУСОВ РЕСПИРАТОРНО-РЕПРОДУКТИВНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ И ЦИРКОВИРУСА
второго типа, циркулирующих на территории российской федерации
Московский государственный университет пищевых производств, 125080, Москва; 2НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского
Минздрава России, 123098, Москва
Представлен молекулярно-генетический анализ геномов вирусов респираторно-репродуктивного синдрома свиней (ВРРСС) и цирковируса второго типа (ЦВС-2), циркулирующих на территории РФ. Результаты исследования показали циркуляцию штаммов европейского генотипа ВРРСС, сходных с изолятами, выделенными на территории Франции, Дании с 1998 до 2001 г. Показана гомологичность по фрагменту одного из генов российских изолятов вакцинному штамму, используемому в вакцине Роги^ PRRS (Интервет), что требует дальнейшего изучения. Не обнаружено североамериканских генотипов вируса РРСС. Геномы исследованных ЦВС-2 образуют 3 отдельных группы. Одна формируется изолятами, выделенными на территории Малайзии, Бразилии, Швейцарии, Китая, Словакии, Великобритании, США в период с 2004 г. до настоящего времени (генотип 2Ь). Во вторую группу входят полевые изоляты вирусов, выделенные с 2000 по 2012 г. в Канаде, США, Китае и Южной Корее (генотип 2а). Третья группа формируется высокопатогенными изолятами, выделенными в 2013 г. в Китае (генотип 2с). Показана циркуляция всех 3 известных генотипов ЦВС-2: 2а, 2Ь и 2с на территории РФ.
Ключевые слова: молекулярно-генетический анализ, филогенетический анализ, вирус респираторно-репродуктивного синдрома свиней, цирковирус свиней второго типа.
Серьезный экономический ущерб свиноводческим предприятиям по всему миру наносят нарушения воспроизводительной функции свиней. Заболеваемость поросят респираторными заболеваниями составляет 30-70%, летальность может достигать 40% [1]. Наиболее распространенными вирусными агентами репродуктивных патологий свиней являются вирус рес-пираторно-репродуктивного синдрома свиней (РРСС) и цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2).
РРСС - вирусное контагиозное заболевание, характеризующееся нарушением респираторной и репродуктивной функций. Заболевание известно с 1980 г, впервые зарегистрировано в Канаде. На сегодняшний день РРСС - заболевание, регистрируемое практически на всех континентах с развитым промышленным свиноводством [2]. В последнее время распространение РРСС приобрело характер панзоотии. Исключением можно считать австралийский континент и страны Океании [3].
Возбудитель болезни - РНК-содержащий оболо-чечный вирус, размер генома которого составля-
ет 15,1-15,4 тыс. нуклеотидов (т.н.), относится к роду Arterivirus, семейства Arteriviridae, порядку Nidovirales. К настоящему времени выявлены 2 генотипа РРСС: европейский и североамериканский, прототипами которых являются соответственно штамм «Lelystad» и штамм VR-2332. Эти 2 генотипа вируса РРСС имеют от 50 до 80% гомологии на нуклео-тидном уровне [4, 5]. По-видимому, европейские и североамериканские типы вируса имеют различные эволюционные истории, так как их геномы сильно различаются [6]. Отличительной чертой вируса является вариабельность геномов его изолятов [7, 8]. В настоящее время и на европейском, и на американском континентах присутствуют оба генотипа вируса. Зарегистрировано появление высоковирулентного вируса РРСС в Китае [9].
ЦВБС - вирусное заболевание свиней, главным образом поросят. ЦВС-2 обнаруживается при различных заболеваниях свиней, таких как синдром по-слеотъемного мультисистемного истощения (СПМИ), синдром дерматита и нефропатии свиней (СДНС), при репродуктивных нарушениях и респираторных болезнях свиней. Ретроспективными серологическими исследованиями показано, что ЦВС-2 циркулирует в свиноводческих хозяйствах с 1969 г. [10].
Возбудитель инфекции ЦВС-2, относится к роду Circovirus, семейства Сirсоviridае. Это мелкий без-оболочечный икасаэдрический вирус, содержащий замкнутую односпиральную геномную ДНК, размером около 1767-1768 нуклеотидов. Помимо патогенного ЦВС-2 также существует непатогенный ЦВС-1, который был обнаружен как нецитопатогенный кон-таминант перевиваемой культуры клеток почки поросенка РК-15 [11]. Гомология их геномов составляет 76% [12]. ЦВС-2 подразделяют на основании генетических различий в области второй открытой рамки считывания (ORF2) на генотипы ЦВС-2а, ЦВС-2Ь и ЦВС-2с. Изменения в тяжести, с которой протекают заболевания, в последнее время многие исследователи связывают со сменой генотипов от ЦВС-2а к ЦВС-2Ь и ЦВС-2с [13].
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2014
В настоящее время в России не проводится регулярных исследований циркуляции вируса РРСС и ЦВС-2, а данные о характере вариаций вирусных геномов являются неполными. Целью данного исследования явилось проведение филогенетического анализа фрагментов геномов вируса РРСС и ЦВС-2, циркулирующих в различных регионах РФ.
Материалы и методы
Материал для исследования: В ходе работы было исследовано 170 проб сывороток крови поросят 100—110-дневного возраста, полученных из хозяйств 8 различных регионов Российской Федерации. Пробы до исследования хранились без добавления дополнительных реагентов при -70оС. Полученные образцы центрифугировали для очистки от остатков эритроцитов.
Выделение нуклеиновых кислот РРСС и ЦВС-2 проводили с использованием Trizol Reagent («Life Technology», США) и коммерческого набора для выделения ДНК («Ветбиохим», Россия) с использованием неорганического сорбента по методике производителя [14].
Выявление генома вируса РРСС в исследуемых пробах проводили с использованием «Тест-системы для обнаружения вируса РРСС методом ПЦР» («Ветбиохим», Россия) [14]. Реакционная смесь содержала 5 мкл РНК, по 10 пмоль каждого
праймера, 0,25 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 50 ед. MMLV-ревертазы, 40 ед. ингибитора РНКаз, 10мМ трис-HCl (рН 9,0), 50 мМ KCl, 0,1% тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2. Для проведения ОТ-ПЦР использовали следующие температурные режимы: 50оС - 45 мин, 94оС - 5 мин и 25 циклов: 94оС - 30 с, 55оС - 30 с, 72оС - 30 с. После ОТ-ПЦР проводили второй раунд амплификации. ПЦР-II выполняли в конечном объеме 25 мкл. Реакционная смесь содержала 5 мкл продукта ОТ-ПЦР, 10 пмоль каждого праймера для ПЦР-II, 0,25 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 10мМ трис-HCl (рН 9,0), 50 мМ KCl,0,1% тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2. Использовали следующие температурные параметры ПЦР: 25 циклов: 94оС - 30 с, 55оС - 30 с, 72оС - 30 с.
Выявление генома ЦВС-2 проводили с использованием Тест-системы для обнаружения цирковируса свиней II типа методом ПЦР («Ветбиохим», Россия). Реакционная смесь для ПЦР содержала 0,25 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. Taq-полимеразы, 10 мМ трис-HCl (рН 9,0), 50 мМ KCl,0,1% тритон Х-100, 1,5 мМ MgCl2. Использовали следующие температурные режимы: 35 циклов: 94оС - 45 с, 55оС - 45 с, 72оС - 45 с и 1 цикл: 94оС - 45 с, 55оС -45 с, 72оС - 5 мин.
ПЦР и ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия).
Анализ фрагментов ПЦР проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий концен-
24.0
—|-1-1-Г"
20 15 10 5
Nucleotide Substitutions (xl 00)
L......[
1 .seq
3.seq
4.seq
Lelystad.seq
Z92535.1 (1998, FRANCE).seq DQ32471 0.1 (2006, Porcilis,vaccine).seq AY035981.1 (2001, Denmark).seq
6. seq
AY035945.1 (2001, DenmarK).seq AY035946.1 (2001, Denmark .seq AY366525.1 (2004, USA).seq DQ32471 2.1(2006, Pyrsvac, vaccine).seq X92942.1 (2001, Spain).seq JX187609.1 (201 3, Chin a) .seq AJ223078.1 (2001, DENMARK).seq AY035974.1 (2001, DenmarK).seq AF438361.1 (2004, Poland).seq AF438360.1 (2004, Poland).seq Evro GU047345(201 1, China) seq AF438362.1 (2004, Lithuania).seq AF438363.1 (2004, Lithuania).seq 2.seq 8.seq
5.seq
7.seq
GU1 4391 3.1 (2009, China).seq
FJ950744.1 (2009, China).seq
FJ797 690.1 (201 0, China) seq
JQ955657.1 (2013, China).seq
JX91 2249.1 (201 3, Chin a) seq
AF494042.1 (2002, USA).seq
AY545985.1 (2008 USA).seq
EF5 328 01.1 (INGELVAC).seq
JX044140.1(2012. USA).seq
AF1591 49.1 (2000, RespPRRS, vaccine).seq
AF066384.1 (1999, PrimePac PRRS, vacc
Nebraska AF046869.1 (1999, USA).seq
VR-2332.seq
AF 3256 91.1 (2001, USA).seq
Рис. 1. Филогенетическая дендрогамма, полученная на основании сравнительного анализа фрагментоа генома
ОРР-7 ВРРСС (376 п. н.).
Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, полученная на основании сравнительного анализа фрагмента генома ОКТ-2
ЦВС-2 (307 п. н.).
трации 0,4-0,5 мкг/мл. Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор с ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм. Размер фрагмента генома вируса РРСС составлял 403 п.н., фрагмента ЦВС-2-356 п. н. Продукты ПЦР были выделены из геля с использованием набора для очистки продуктов ПЦР GeneClean Kit («Bio-101 Inc.», США) согласно протоколу фирмы-изготовителя, и в них было проведено определение последовательности нуклеотидов. Праймеры для секвени-рования использовали те же, что и для ПЦР-2 - вируса РРСС и ПЦР - ЦВС-2, соответственно.
Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 («Applied Biosystem», США) согласно рекомендациям производителя.
При построении филогенетических дендрограмм нуклео-тидные последовательности ORF-7 ВРРСС и ORF-2 ЦВС-2, представленные в базе данных NCBI GenBank, были выровнены с помощью программы SeqMan («Lasergene», США). Для построения филогенетических деревьев использовали пакет программ DNASTAR v.3.12 («Lasergene», США).
Результаты и обсуждение
Исследованы образцы сывороток крови поросят разных возрастов, полученные из хозяйств различных регионов Российской Федерации. Как видно из результатов, представленных в таблице, во всех 8 обследованных регионах обнаружены как вирус РРСС, так и ЦВС-2. Процент положительных проб при опреде-
лении вируса РРСС варьировал от 20% (Ярославская область) до 65% (Московская область), а в среднем составлял 35,5%. Процент положительных проб по ЦВС-2 варьировал от 20 (Ярославская область) до 80 (Московская область) и в среднем был равен 42,3 (см. таблицу).
Далее для выявления генетических различий между геномами вирусов респираторных заболеваний свиней был проведен анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента ORF-7 вируса РРСС и ORF-2 вируса ЦВС-2 соответственно. Нуклеотидные последовательности вируса РРСС и ЦВС-2, определенные ранее, были получены из банка данных GenBank. Длина секвенированных ПЦР-фрагментов составляла 376 п.н. для РРСС, и 307 п.н. для ЦВС-2.
На рис. 1 представлена филогенетическая дендрограмма, построенная на основании анализа результатов секвенирования фрагмента гена № (ОКР-7) вируса РРСС. Анализ дендрограммы показал, что геномы вирусов 1, 3, 4, 6 (Московской, Тюменской, Свердловской и Ярославской областей) образуют с известными ранее последовательностями (292535, DQ324710, AY035981, М96262) одну общую генетическую группу изолятов европейского типа РРСС. В
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА, МИКРОБИОЛОГИЯ И ВИРУСОЛОГИЯ №4, 2014
Результаты исследования образцов сывороток крови 100-110-дневных поросят на наличие геномов вируса РРСС и ЦВС-2 методом ПЦР
Коли- Количество/% по- Количество/%
Регион чество исследуемых проб ложительных проб на наличие вируса РРСС положительных проб на наличие ЦВС-2
Московская область 20 13/65 16/80
Томская область 10 3/30 6/60
Тюменская область 15 4/26,7 5/33,3
Свердловская область 60 17/28,7 19/31,7
Новгородская область 15 5/33,3 8/53,3
Ярославская область 10 2/20 2/20
Самарская область 25 8/32 7/28
Пермская область 15 7/46,6 9/60
Итого 170 62/35,5 72/42,3
данной группе представлены полевые изоляты вируса РРСС, выделенные на территории Франции, Дании с 1998 до 2001 гг. Наличие гомологии у данных изо-лятов с вакцинным штаммом, используемым в вакцине Рогс1^ PRRS (Интервет), требует дальнейшего изучения. Известно, что эффективность применения живых вакцин осложняется высокой вариабельностью вируса РРСС и возможной реверсией к дикому типу [8, 15]. Так, в Дании в 1996 г. применение живой вакцины RespPRRS/Repгo привело к заражению 40% свиней, так как аттенуированный вирус ревертировал к дикому типу [16].
Вирусы 2, 5, 7, 8 (Томской, Новгородской, Самарской и Пермской областей) образуют отдельную генетическую группу. Они различаются как между собой, так и от всех ранее выделенных последовательностей, в связи с чем можно говорить о существовании отдельной группы изолятов вируса РРСС европейского генотипа, характерной для территории РФ. Интересно, что исследования, проведенные в 2001-2006 гг., показали, что на территории России и Белоруссии циркулировали изоляты европейского генотипа, близкие к изолятам, выделенным в Испании [17]. Исследование российских генотипов вируса РРСС дополнительно подтверждает высокую вариабельность данного вируса.
В данном исследовании мы не обнаружили североамериканских генотипов вируса РРСС. Однако это не значит, что на территории РФ их нет. Возможно, они циркулируют в регионах, которые мы не исследовали.
Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании сиквенса фрагмента гена ORF-2 ЦВС-2, показана на рис. 2. Ее анализ выявил, что последовательности фрагментов генома вирусов 2, 4, 5, 6 (из Томской, Свердловской, Новгородской и Ярославской областей) крайне близки к ранее известным последовательностям ^484415, JX534237, ЕШ46945, GU799576, AY484416, ЕШ45542, КС261600, КС261601, CQ359006, JX512859, JX945576, КС835193, JF690920) и состав-
ляют с ними одну генетическую группу. В эту группу входят вирусные изоляты ЦВС-2, выделенные на территории Малайзии, Бразилии, Швейцарии, Китая, Словакии, Великобритании, США в период с 2004 г. до настоящего времени и относящиеся к генотипу ЦВС-2b. Последовательности вирусов 1 и 3 (Московской и Тюменской областей) сходны со следующими последовательностями из GenBank - FJ870967, FR82345, AF264038, AF027217, AF112862 и относятся к другой генетической группе, в которую входят вирусы, выделенные с 2000 по 2012 г. в Канаде, США, Китае и Южной Корее и относящиеся к генотипу ЦВС-2а. Ранее была показана циркуляция генотипов 2а и 2b на территории РФ [18]. Последовательности изолятов 7 и 8 (Самарской и Пермской областей) близки к последовательностям изолятов, выделенных в 2013 г. в Китае (KC527542 и KC533811), и относятся к новому высокопатогенному штамму ЦВС-2с. По результатам исследования можно говорить о циркуляции на территории РФ всех 3 известных генотипов ЦВС: 2a, 2b и 2с.
Сведения об авторах:
Булгаков Александр Дмитриевич - аспирант Московского государственного университета пищевых производств; e-mail: [email protected]
Гребенникова Татьяна Владимировна - д-р биол. наук, проф., зав. лабораторией Молекулярной диагностики ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России, e-mail: [email protected]
Южаков Антон Геннадьевич - канд.биол.наук, ст. научн. сотр. лаборатории Молекулярной диагностики ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России, e-mail: [email protected]
Алипер Тарас Иванович - д-р биол. наук, проф., зав. лабораторией средств специфической профилактики вирусных болезней ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России, e-mail: [email protected] Непоклонов Евгений Анатольевич - д-р биол. наук, проф. Московского государственного университета пищевых производств; e-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Орлянкин Б.Г., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. Инфекционные респираторные болезни свиней. Ветеринария. 2005; 11: 3-6.
2. Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Фомин А.Е. Атипичный (высокопатогенный) репродуктивно-респираторный синдром свиней (обзор литературы). Ветеринарная патология. 2008; 4: 37-41.
3. Кукушкин С.А. Разработка средств специфической профилактики репродуктивно - респираторного синдрома свиней: Авто-реф. дис.... д-ра вет. наук. Владимир; 2009.
4. Indik S., Valicek L., Klein D., Klanova J. Variations in the major envelope glycoprotein GP5 of Czech strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 2000; 81: 2497-502.
5. Le Gall A., Legeay O., Bourhy H., Arnauld C., Albina E., Jestin, A. Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF 7) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Virus Res. 1998; 54: 9-21.
6. Meng, X.L., Paul, P.S., Halbur, P.C., Lum, M.A. Phylogenetic analyses of the putative M (ORF6) and N (ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): Implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 1995; 140: 745-55.
7. Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I., Mengeling W.L., Lager K.M. et al. Genomic characterization of virulent, attenuated and revertant passages of a North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain. Virology. 2004; 321: 383-90.
8. Nielsen J., Botner A., Bille-Hansen V., Oleksiewicz M.B., Storgaard T. Experimental inoculation of late term pregnant sows with a field isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine-derived virus. Vet. Microbiol. 2002; 84: 1-13.
9. Shi M., Holmes E.C., Brar M.S., Leung F.C. Recombination is associated with an outbreak of novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China. J. Virol. 2013; 87(19): 10904-07.
10. Segales J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis. Virus Res. 2012; 164: 10-9.
11. Орлянкин Б.Г., Мишин А.М., Алипер Т.И. Специфическая профилактика цирковирусных болезней свиней. Свиноводство. 2011; 2: 67-8.
12. Trible B.R., Rowland R.R.R. Genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) and its relevance to vaccination, pathogenesis and diagnosis. Virus Res. 2012; 164: 68-77.
13. Choi Y.K., Goyal S.M., Joo H.S. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs. Can. Vet. J. 2003; 44: 735-7.
14. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Верховский О. А., Орлянкин Б. Г., Алипер Т. И., Непоклонов Е. А. Создание средств лабораторной диагностики репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС). Ветеринария. 2005; 10: 24-6.
15. Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Мусиенко М. И., Men-geling W.L., Lager K.M., Алипер Т. И. и др. Анализ геномных детерминант вирулентности и создание библиотеки полноразмерных инфекционных копий генома аттенуированного штамма вируса репродуктивно-респираторного синдрома. Вопросы вирусологии. 2004; 3: 56-63.
16. Smedegaard Madsen E., Alexandersen S. Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine. Vet. Rec. 1997; 141: 497-499.
17. Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Власова А.Н., Мусиенко М.И., Соколов М.А., Грабовецкий В.В. и др. Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС). 2004; Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-2. - стр. 37-40
18. Елисеева О. В., Латышев О. Е., Зайкова О. Н., Булгаков А. Д., Гребенникова Т. В., Непоклонов Е. А. Разработка тест-системы для обнаружения и дифференциации цирковируса свиней 2-го типа подтипов 2а и 2b на основе множественной ПЦР в реальном времени. Российский ветеринарный журнал. 2013; 3: 24-6
REFERENCES
1. Orlyankin B.G., Aliper T.I., Nepoklonov E.A. Infectious respiratory disease of pigs. Veterinariya. 2005; 11: 3-6. (in Russian)
2. Kukushkin S.A., Baybikov T.Z., Fomin A.E. Atypical (highly) porcine reproductive and respiratory syndrome (review). Veterinarnaya patologiya. 2008; 4: 37-41. (in Russian)
3. Kukushkin S.A. The development of means of specific preventive porcine reproductive - respiratory .syndrome. Diss. Vladimir; 2009 (in Russian).
4. Indik S., Valicek L., Klein D., Klanova J. Variations in the major envelope glycoprotein GP5 of Czech strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 2000; 81: 2497-502.
5. Le Gall A., Legeay O., Bourhy H., Arnauld C., Albina E., Jestin A. Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF 7) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Virus Res. 1998; 54: 9-1.
6. Meng X.L., Paul P.S., Halbur P.C., Lum M.A. Phylogenetic analyses of the putative M (ORF6) and N (ORF7) genes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV): Implication for the existence of two genotypes of PRRSV in the USA and Europe. Arch. Virol. 1995; 140: 745-55.
7. Grebennikova, T.V., Clouser, D.F., Vorwald, A.C., Musienko, M.I., Mengeling W.L., Lager K.M. et al. Genomic characterization of virulent, attenuated and revertant passages of a North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain. Virology. 2004; 321: 383-90.
8. Nielsen J., Botner A., Bille-Hansen V., Oleksiewicz M.B., Storgaard T. Experimental inoculation of late term pregnant sows with a field isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome vaccine-derived virus. Vet. Microbiol. 2002; 84: 1-13.
9. Shi M., Holmes E.C., Brar M.S., Leung F.C. Recombination is associated with an outbreak of novel highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruses in China. J. Virol. 2013; 87(19): 10904-07.
10. Segales J. Porcine circovirus type 2 (PCV2) infections: Clinical signs, pathology and laboratory diagnosis. Virus Res. 2012; 164: 10-9.
11. Orlyankin B.G., Mishin A.M., Aliper T.I. Specific preventive circovirus diseases of pigs. Svinovodstvo. 2011; 2: 67-8. (in Russian)
12. Trible B.R., Rowland R.R.R. Genetic variation of porcine circovirus type 2 (PCV2) and its relevance to vaccination, pathogenesis and diagnosis. Virus Res. 2012; 164: 68-77.
13. Choi Y.K., Goyal S.M., Joo H.S. Retrospective analysis of etiologic agents associated with respiratory diseases in pigs. Can. Vet. J. 2003; 44: 735-7.
14. Grebennikova T.V., Zaberezhnyy A.D., Verkhovskiy O.A., Orlyankin B.G., Aliper T.I., Nepoklonov E.A. Create vitro diagnostic reproductive and respiratory syndrome (PRRS). Veterinariya. 2005; 10: 24-6. (in Russian)
15. Grebennikova T.V., Zaberezhnyy A.D., Musienko M.I. , Mengeling W.L., Lager, K.M., Aliper T.I. et al. The analysis of the genomic determinants of virulence and the creation of a library of infectious full-length copies of the genome of an attenuated strain of porcine reproductive and respiratory syndrome. Voprosy virusologii. 2004; 3: 56-63. (in Russian)
16. Smedegaard Madsen E., Alexandersen S. Appearance of acute PRRS-like symptoms in sow herds after vaccination with a modified live PRRS vaccine. Vet. Rec. 1997; 141: 497-9.
17. Grebennikova T.V., Zaberezhnyy A.D., Vlasova A.N., Musienko M.I., Sokolov M.A., Grabovetsky V.V. et al. Genetic variation in ORF7 encoding nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSv). Molekulyarnaya genetika, mikribiologiya i virusologiya. 2004; 2: 37-40. (in Russian)
18. Eliseeva О. V., Latyshev О. Е., Zaykova О. N., Bulgakov А. D., Grebennikova, T.V., Nepoklonov Е. А. Development of the kit for detection of porcine circovirus type 2 Subtypes 2a and 2b based on multiplex real time PCR. Rossiyskiy veterinarnyy zhurnal. 2013; 3: 24-6. (in Russian)
Поступила 29.01.14 Received 29.01.14
MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF THE GENOMES OF PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME VIRUS AND PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 CIRCULATING IN THE AREA OF RUSSIAN FEDERATION
Bulgakov A. D.', Grebennikova T. V.2, Yuzhakov A. G.2, Aliper T. I.2,
and Nepoklonov E. A.' 1Moscow State University of Food Production, Moscow, Russia;
2Ivanovsky Institute of Virology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow, Russia
The molecular genetic analysis of the genomes of the virus of porcine reproductive respiratory syndrome (VPRRS) and porcine circovirus type 2 (PCV-2) circulating in the area of the Russian Federation was discussed. The results of this work showed the circulation of the strains of the European genotype VPRRS similar to those found in France and Denmark from 1998 to 2001. The homology of the fragment of one of the genes between the Russian isolates and the vaccine strain Porcilis PRRS (Intervet) was found. It requires further study. The strains representing the North American genotype VPRRS were not found. The PCV-2 genomes fall into three separate groups. One (genotype 2b) is formed by isolates in Malaysia, Brazil, Switzerland, China, Slovakia, UK, USA, isolated during the period from 2004 to the present time. The second group consists of sequences of the viruses isolated in 2000-2012 in Canada, the U.S., China, and South Korea (genotype 2a). The third group is formed by highly pathogenic isolates in 2013 from China (highly pathogenic genotype 2c). The circulation of all three known genotypes of PCV-2: 2a, 2b, and 2c in Russian Federation was demonstrated.
Key words: molecular genetic analysis, phylogenetic analysis, porcine respiratory-reproductive syndrome virus, porcine circovirus 2 type
