CC BY
90
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 578.833.27:578.5].083.2
Куличенко А.Н.1, Волынкина А.С.1, Котенев Е.С.1, Писаренко С.В.1, ШапошниковаЛ.И.1, Лисицкая Я.В. 1, ВасиленкоН.Ф.1, Цыганкова О.И.1, Евченко Ю.М.1, Тохов Ю.М.1, Савельев В.Н.1 ,Тихонов С.Н.2, Пеньковская Н.А.3
НОВЫЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ВАРИАНТ ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ, ВЫЯВЛЕННЫЙ В КРЫМУ
'ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, 355035, Ставрополь, Россия; 2ФГКУЗ «Противочумная станция Республики Крым» Роспотребнадзора, 295023, Симферополь, Россия; 'Межрегиональное управление Роспотребнадзора по Республике Крым и городу федерального значения Севастополю, 295034, Симферополь, Россия
В работе представлены результаты генетической идентификации изолятов вируса крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), выявленных на территории Крымского федерального округа, при проведении эпидемиологического расследования завозного случая крымской геморрагической лихорадки из Крыма в 2015 г. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на наличие РНК вируса ККГЛ исследована 1 проба сыворотки крови больной и 61 пул (506 особей) иксодовых клещей, собранных при проведении эпизоотологического обследования шести административных районов Крымского федерального округа. В сыворотке крови больной и 10 пробах иксодовых клещей выявлена РНК вируса ККГЛ. Генетическую идентификацию изолятов вируса ККГЛ осуществляли методами секвенирования фрагментов S-, M- и Г-сегментов генома. На основании результатов молекулярно-генетического анализа установлена высокая степень гомологии РНК вирусов ККГЛ в пробе сыворотки крови и 3 пробах суспензий клещей и принадлежность их к новой генетической подгруппе «Крым» (Vd) генотипа «Европа-1». Выполнено полногеномное секвенирование 2 изолятов вируса ККГЛ подгруппы «Крым» (Vd). Варианты вируса ККГЛ подгруппы «Крым» (Vd) генотипа «Европа-1» описаны впервые и являются эндемичными для территории Крымского полуострова. Ключевые слова: крымская геморрагическая лихорадка, молекулярная эпидемиология, полногеномное секвенирование, филогенетический анализ, Крымский федеральный округ.
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-76-80
Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) — особо опасная природно-очаговая вирусная инфекция, характеризующаяся спорадической заболеваемостью с возникновением через непредвиденные периоды времени внезапных вспышек с высоким уровнем летальности. Этиологическим агентом КГЛ является вирус крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), принадлежащий к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae.
КГЛ является эндемичным заболеванием для стран Африки, Азии, юго-восточной Европы и ряда регионов юга европейской части России, в том числе и Крымского федерального округа (КФО), где данная инфекция была впервые обнаружена. Первая эпидемическая вспышка КГЛ была зафиксирована в мае 1944 г. в степных районах Крыма. Заболеваемость носила спорадический характер, характеризовалась выраженной весенне-летней сезонностью, летальность составила 8% [1]. Новые случаи заболевания КГЛ в Крыму были выявлены в 1945—1946 гг. В 1947—1969 гг. отмечались единичные случаи КГЛ, диагностируемые на основании анализа клинико-эпидемиологических данных.
Осложнение эпидемической ситуации по КГЛ в Крыму в 1944—1946 гг. связано с небывалым увеличением численности иксодовых клещей вида Hyalomma marginatum [1], являющихся основным переносчиком вируса ККГЛ. Первое эпизоотологиче-ское обследование природного очага КГЛ в Крыму проводилось в 1969—1973 гг. В 1969—1970 гг. были выявлены единичные положительные пробы на наличие антител к вирусу ККГЛ у крупного рогатого скота, свидетельствующие о циркуляции вируса. В 1972—1973 и 1986—1989 гг. проводилось вирусологическое ис-
Для корреспонденции: Волынкина Анна Сергеевна, научный сотрудник лаборатории природно-очаговых инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, E-mail: volyn444@mail.ru
следование иксодовых клещей, собранных на территории Крымского полуострова, в результате было выделено 33 штамма вируса ККГЛ из клещей видов H. marginatum (28 штамов), Ixodes ricinus (2 штамма), Haemaphysalis punctata, Rhipicephallus bursa, R. san-guineus (по 1 штамму) [1].
Сведений об эпидемических и эпизоотических проявлениях КГЛ на территории Крыма в период с 1990 г. по 2012 г. не имеется. В августе 2013 г. зарегистрирован один завозной случай КГЛ из Крыма (г. Керчь) в Москву1. В 2015 г. вновь выявлен случай завоза КГЛ с территории КФО, также при проведении эпи-зоотологического обследования установлена циркуляция вируса ККГЛ на территории Крымского полуострова.
Вирус ККГЛ является одним из наиболее генетически разнообразных представителей рода Nairovirus. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК негативной полярности, состоит из трех сегментов: малого (S), размером 1670 п.о., среднего (М) — 5360 п.о. и большого (Г) — 12160 п.о. Малый (S) сегмент генома кодирует белок нуклеопротеина размером 482 аминокислотных остатка (аа), средний (М) сегмент полипротеин — белок-предшественник поверхностных гликопротеинов Gn и Gc (1688 aa), большой (Г) сегмент — РНК-зависимую РНК-полимеразу (3945 аа) [2, 3].
На основании частичных и полных нуклеотидных последовательностей S- и Г-сегментов генома вируса ККГЛ выделяют 7 генотипов вируса, имеющих корреляцию с географическим местом выделения: «Африка-1» (I), «Африка-2» (II), «Африка-3» (Ш),»Азия-1» (IVa), «Азия-2» (iVb), «Европа-1» (V), «Европа-2» (VI) [3-5]. Молекулярно-генетический анализ частичных и полноразмерных последовательностей M-сегмента также позволяет выделить 7 генетических групп: М-1, М-2, М-3, М-4, М-5, M-6 и M-7, частично совпадающих с генотипами, идентифицированными при анализе S- и Г-сегментов. Штаммы, относящиеся к генотипу «Европа-1», входят в состав группы M-4 [2, 4, 5].
Вирус ККГЛ генотипа «Европа-1» распространен в России, Турции, странах Балканского полуострова. Выявлены генетические различия между штаммами вируса ККГЛ генотипа «Европа-1», циркулирующими в локальных природных очагах. На основании анализа нуклеотидных последовательностей S-, M- и Г-сегментов генома вируса в пределах генотипа «Европа-1» выделяется несколько подгрупп (субтипов): российские штаммы вируса ККГЛ принадлежат к трем подгруппам: «Ставрополь-Ростов-Астрахань» (Va), «Волгоград-Ростов-Ставрополь» (Vb), «Астрахань-2» (Vc) [6, 7], в отдельные подгруппы выделяются штаммы из Косово, Албании, Болгарии и Турции [8].
К настоящему времени сведения о генетических особенностях вируса ККГЛ в Крыму отсутствуют. Целью данной работы является проведение молекулярно-генетического анализа изо-лятов вируса ККГЛ, циркулирующих на территории КФО, выявленных в клиническом материале и пулах иксодовых клещей, собранных при проведении эпидемиологического расследования случая заражения КГЛ в Крыму в 2015 г.
Материал и методы
Эпидемиологический анамнез больной КГЛ. Больная (29 лет), в период с 16 по 23 мая 2015 г. находилась в туристическом походе в Крыму, маршрут следования: г. Судак — гора Ай-Петри
1 Информационное письмо Департамента здравоохранения Москвы
от 07.02.14 № 1-18/141.
— п. Форос. При прохождении маршрута 18, 20 и 21 мая больная отмечала укусы клещей, 23 мая из Симферополя вылетела в г.Москву, откуда поездом прибыла в Воронеж. 25 мая 2015 г. обратилась за медицинской помощью и была госпитализирована в областную инфекционную больницу с предварительным диагнозом «лихорадка неясного генеза, укус клеща». 30 мая в сы-
Нуклеотидные последовательности штаммов вируса ККГЛ, использовавшиеся при проведении филогенетического анализа и оценки нуклеотидных и аминокислотных раз
личий штаммов
Штамм Место Год Источ- Номер доступа в GenBank
выделения выде- ник вы-
ления деления S-сегмент M-сегмент L-сегмент
«Африка-1» (I)
ArD8194 Сенегал 1969 клещ DQ211639 DQ211626 DQ211613
ArD15786 Сенегал 1972 МРС DQ211640 DQ211627 DQ211614
«Африка-2» (II)
Semunia Уганда 1958 DQ076413 DQ094832 DQ076412
Congo3010 Конго 1956 DQ144418 DQ019222 DQ099335
«Африка-3» (III)
IbAr10200 Нигерия 1966 клещ CHU88410 CHU39455 NC005301
SPU4/81 ЮАР 1981 DQ076416 DQ157175 DQ076417
SPU415/85 ЮАР 1985 человек DQ211648 DQ211635 DQ211622
Sudan-AB1-2009 Судан 2009 человек HQ378179 HQ378187 HQ378183
«Азия-1» (IV a)
Matin Пакистан 1976 человек AF527810 AF467769 AY422208
«Азия-2» (IV b)
TADJ/HU8966 Таджикистан 1990 человек AY049083 AY179962 AY720893
C-68031 Китай 1968 МРС DQ211642 DQ211629 DQ211616
79121M18 Китай 2004 клещ GU477494 GU477493 GU477492
«Европа-1» (V)
подгруппа «Ставрополь-Ростов-Астрахань» (Va)
30908 РФ, Астраханская область 2002 клещ AY675240
STV/HU29223 РФ, Ставропольский край 2000 человек AF481802 AF489586
5170-R0S/HU- РФ, Ростов- 2011 человек KR814854 KR814873 KR814892
2011 ская область
81-R0S/HU-2014 РФ, Ростовская область 2014 человек KR814846 KR814865 KR814884
подгруппа «Волгоград-Ростов-Ставрополь» (Vb)
R0S/HUVLV-100 РФ, Ростовская область 2003 человек DQ206447 DQ206448 AY995166
R0S/TI28044 РФ, Ростовская область 2000 клещ AY277672
Kashmanov РФ, Ростовская область 1967 человек DQ211644 DQ211631 DQ211618
VLG/TI29414 РФ, Волгоградская область 2000 клещ AY179961
52-R0S/HU-2014 РФ, Ростовская область 2014 человек KR814843 KR814862 KR814881
5180-R0S/HU- РФ, Ростов- 2011 человек KR814855 KR814874 KR814893
2011 ская область
36-STV/HU-2014 44-STV/HU-2010
Kosova-Hoti
Turkey200310849 Turkey-Kelkit06
AP92
подгруппа «Астрахань-2» (Ус) РФ, Ставро- 2014 человек КИ814838 польский край
РФ, Ставро- 2010 человек КИ814840 польский край
подгруппа балканских штаммов Косово 2001 человек DQ133507
подгруппа турецких штаммов
Турция Турция
Греция
2003 человек 2006 человек «Европа-2» (VI) 1975 клещ
DQ211649 GQ337053
воротке крови больной выявлены РНК вируса ККГЛ и антитела класса IgM к вирусу в титре > 1:1600, поставлен диагноз «КГЛ с геморрагическими проявлениями, тяжелое течение».
Обследованная территория. Эпизоотологическим обследованием охвачена территория 6 административных районов КФО (Алуштинского, Бахчисарайского, Белогорского, Судакского, Ялтинского, Симферопольского), осуществлен учет численности клещей и сбор полевого материала для последующего лабораторного исследования. Клещей в лабораторию доставляли живыми, помещенными в стеклянные пробирки, упакованные в тканевые мешочки.
Материал для исследований. Исследована 1 проба сыворотки крови больной КГЛ и 61 пул (506 особей) иксодо-вых клещей видов H. marginatum и R. bursa, собранных с крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Клещи были предварительно рассортированы по виду, полу, стадии развития и объединены в пулы, содержащие до 5 полунапитавшихся имаго, до 50 полунапитавшихся личинок и нимф, полностью напитавшиеся особи исследовались индивидуально. Клещей в пулах омывали в 70% этаноле, затем в стерильном 0,15 М растворе NaCl и растирали в фарфоровых ступках с добавлением 1 мл 0,15 М раствора NaCl. Перед исследованием суспензии клещей осветляли центрифугированием при 10000 g в течение 1 мин. Образцы полевого и клинического материала хранили при t -70°C.
Индикация РНК вируса ККГЛ в материале. Индикацию вируса ККГЛ в клиническом материале и пулах клещей осуществляли методом ПЦР с использованием набора реагентов для выявления РНК вируса ККГЛ «АмплиСенс® CCHFV-FL» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия), согласно инструкции производителя. Экстракцию РНК из образцов клинического и полевого материала и получение комплементарной ДНК производили с помощью наборов реагентов «РИБО-преп» и «РЕВЕРТА-Ь-100» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).
Секвенирование ПЦР-фрагментов. Генетическую идентификацию вируса ККГЛ проводили методом секвенирова-ния трех участков генома вируса: фрагментов 115-652 кодирующей области малого (S) сегмента генома (538 п.о.), фрагмента 4620-5075 кодирующей области среднего (М) сегмента генома (435 п.о.) и фрагмента 105-541 кодирующей области большого (L) сегмента генома (437 п.о.) с последующим филогенетическим анализом (позиции фрагментов приводятся по полноразмерным последовательностям S-, M-, и L-сегментов генома штамма R0S/HUVLV-100, GenBank DQ206447, DQ206448, AY995166, соответственно). ПЦР-продукты получали с использованием праймеров: S-100f и S-680r [6], 24 и 25 [9], L-100f: gattggactcaggtgattgctggtra L-540r:
gcctccctcgtgtctgtttc. При постановке реакции секвенирования использовали прай-мер L-100-1f: faccgtaggttcaatatctc(c/t)gat-ta вместо праймера L-100f. Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвена-
KR814857 KR814876
KR814859 KR814878
EU037902 EU044832
DQ211636 GQ337054
DQ211623 GQ337055
DQ211638 DQ211625 DQ211612
Рис. 1. Эпизоотологическое обследование территории КФО на выявление циркуляции
вируса ККГЛ в 2015 г.
торе «ABI 3130 Genetic Analyser» (Applied Biosystems, США) с набором реагентов «Big Dye Terminator Kit v.3.1.».
Полногеномное секвенирование. Полноразмерные S-, M- и Г-сегменты генома вируса ККГЛ амплифицировали в виде 20 перекрывающихся фрагментов (размером 650—1465 bp) с использованием авторского набора праймеров. Концентрацию ампликонов оценивали при проведении электрофореза в 1% агарозном геле. Эквивалентные количества ПЦР-продуктов объединяли, осуществляли очистку ДНК с использванием набора AxyPrep™ PCR Cleanup Kit (Axygen Biosciences, США) и использовали для создания shotgun-библиотек. Подготовку библиотек со средней длиной ридов 200 п.о. и их секвенирование с использованием генетического анализатора Ion Torrent Personal Genome Machine («Ufe Technology», США) осуществляли с использованием наборов Ion Xpress™ Plus DNA Fragment Tibrary Preparation, Ion Xpress Barcode Adapters 1-16 Kit, Ion One Touch 200 Template Kit v 2 D^ Ion PGM 200 Sequensing Kit, Ion 314Chip Kit согласно рекомендациям производителя.
Биоинформационная обработка данных. Сборку контигов и
определение их взаимного расположения проводили в программах Newbler Assembler 2.9, Newbler Mapper 2.9 (454 life-Science), и Vector NTI 8.0. Нуклеотидные последовательности фрагментов и полноразмерных сегментов генома изолятов вируса ККГЛ, полученные в данной работе, сравнивали с имеющимися последовательностями штаммов вируса, полученными из базы данных GenBank (см. таблицу). Анализ уровня генетического родства и построение филогенетических деревьев проводили в программе Mega 5.05. с использованием метода Neigh-boor joining по алгоритму Kimura-2, статистическую достоверность топологии филогенетических деревьев проверяли с помощью Bootstrap анализа, вычисления проводили для 1000 повторов.
Результаты
В мае 2015 г. в Воронежской области зарегистрирован завозной случай КГЛ из КФО. При лабораторном исследовании сыворотки крови больной методом ПЦР в пробе клинического материала выявлена РНК вируса ККГЛ.
При анализе данных эпидемиологического анамнеза установлено, что заражение больной вирусом ККГЛ произошло в результате укуса клещом при пребывании в природном биотопе на территории Крыма. Для выявления возможного источника инфекции в июле 2015 г. проведено эпизоотологическое обследование территории шести административных районов Крымского федерального округа, где проходил маршрут следования туристической группы (рис. 1).
При эпизоотологическом обследовании с осмотренных животных (крупного и мелкого рогатого скота (КРС и МРС), лошадей) и в открытых биотопах собраны 1947 особей иксодовых клещей, представленных 7 видами: H. marginatum — 17,8% от общего количества иксодид, Haem. punctata — 1,79%, R. bursa — 76,06%, R. turanicus — 3,03%, R. sanguineus — 0,1%, I. ricinus— 0,82%, Dermacentor marginatus — 0,36%. Индекс встречаемости иксодовых клещей на КРС составил 82,8%, индекс оби-
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное по фрагменту S-сегмента генома (Neighbor joining, Kimura-2). Здесь и на рис. 3, 4: черными точками отмечены исследуемые в данной работе изоляты. Справа указаны субтипы и генотип вируса.
лия — 4,2; на лошадях индекс встречаемости — 100%, индекс обилия — 9,8; на МРС — 78,0% и 0,9 соответственно. Индекс обилия иксодид на 1 фл/км был равен 30,0. В местах обитания H. marginatum при отсутствии крупных прокормителей, на учетчика за 1 ч нападало в среднем 6 имаго, что является эпидемически значимым показателем.
Методом ПЦР на наличие РНК вируса ККГЛ исследовано 506 особей (61 пул) клещей, собранных при эпизоотологическом обследовании, относящихся к видам H. marginatum и R. bursa. РНК вируса ККГЛ выявлена в 10 пулах клещей, снятых с лошадей и КРС в окрестностях с. Лучистое Алуштинского района, принадлежащих к видам H. marginatum (6 проб) и R. bursa (4 пробы).
Выполнено секвенирование фрагментов S-, M- и L-сегментов генома изолятов вируса в пробе клинического материала — 1-CRIMEA/HU-2015 и 3 пробах суспензий клещей с достаточной вирусной нагрузкой: 1193-CRIMEA/TI-2015 (H. marginatum 1 особь, снята с лошади), 1231-CRIMEA/TI-2015 (H. marginatim 8 особей, снятых с КРС), 1237-CRIMEA/TI-2015 (R. bursa 50 особей, снятых с КРС). При анализе полученных хроматограмм не обнаружено двойных пиков, что свидетельствует о выявлении в исследуемых образцах индивидуальных изолятов вируса ККГЛ. Секвенированные последовательности депонированы в базу данных GenBank под номерами: KU161576-KU161581.
При проведении филогенетического анализа секвениро-ванных последовательностей генома вируса установлено, что исследуемые образцы принадлежат к генотипу «Европа-1», к которому также относятся штаммы, циркулирующие на юге европейской части России, в Турции, странах Балканского полуострова. На филогенетических деревьях, построенных по фрагментам S-, M- и L-сегментов генома в пределах генотипа «Европа-1» выделяется 4 основных кластера: группа российских штаммов (подгруппы «Ставрополь—Ростов—Астрахань» (Va) и «Волгоград—Ростов—Ставрополь» (Vb)), группа турецких штаммов, группа балканских штаммов, кроме того, на филогенетическом дереве по фрагменту S-сегмента также выделяется подгруппа «Астрахань-2» (Vc). Варианты вируса ККГЛ, выявленные в настоящей работе, не кластеризуются с ранее описанными подгруппами генотипа «Европа-1» и формируют на филогенетическом дереве отдельный кластер, названный нами «Крым» (Vd), наиболее близкий к группе российских и турецких штаммов на филогенетическом дереве по фрагменту S-сегмента (рис. 2), штаммам Балканской подгруппы — на филогенетическом дереве по фрагменту M-сегмента (рис. 3, см. 3-ю пол. обложки), группе российских штаммов — на филогенетическом дереве по фрагменту L-сегмента (рис. 4, см. 3-ю пол. обложки).
Для двух изолятов вируса: 1-CRIMEA/HU-2015, выявленного в пробе клинического материала, и 1231-CRIMEA/TI-2015, выявленного в суспензии клещей, было выполнено полногеномное секвенирование (последовательности депонированы в GenBank под номерами KU161582-KU161587).
При сравнении секвенированных последовательностей было выявлено 15 нуклеотидных замен в пределах S-сегмента (0,9%), 52 замены в M-сегменте (0,9%) и 78 замен в L-сегменте (0,7%). Анализ выведенных аминокислотных последовательностей белков исследуемых образцов вируса позволил выявить 31 аминокислотную замену (2 в белке нуклеопротеина, 11 в белке-предшественнике поверхностных гликопротеинов и 18 в РНК-зависимой РНК-полимеразе).
Сравнение нуклеотидных последовательностей полноразмерных сегментов генома и выведенных аминокислотных последовательностей и белков изолятов вируса ККГЛ подгруппы «Крым» (Vd) со штаммами генотипа «Европа-1» показало, что вирусные изоляты подгруппы «Крым» (Vd), имеют 1,7—2,3% нуклеотидных и 0,2—0,8% аминокислотных отличий от штаммов генотипа «Европа-1» при исследовании по S-сегменту, 4,8—5,8% и 3,7—5,0% — по M-сегменту, 2,9—3,5% и 1,1— 1,5% — по L-сегменту. Различия нуклеотидных последовательностей штаммов вируса ККГЛ в пределах основных подгрупп генотипа «Европа-1»при сравнении последовательностей S-, M- и L-сегментов не превышало 1,0%. Отличия изолятов вируса ККГЛ подгруппы «Крым» (Vd) от штаммов других генотипов вируса («Африка 1-3», «Азия 1-2», «Европа-2») по нуклеотид-ным и аминокислотным последовательностям составили 10,4— 17,0 и 3,7—7,4% по S-сегменту соответственно, 19,1—29,9 и
14,6—25,7% по M-сегменту соответственно, 10,3—21,2 и 3,1— 9,3% по l-сегменту соответственно. Таким образом, сравнение полноразмерных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей сегментов генома вируса подтверждает обоснованность выделения исследуемых образцов в отдельный кластер в пределах генотипа «Европа-1».
Обсуждение
Результаты молекулярно-генетического типирования изолятов вируса ККГЛ, выявленных в пробе клинического материала и суспензиях клещей, анализ клинико-эпидемиологических данных о больной КГЛ и результатов эпизоотологического обследования территории КФО позволил подтвердить факт заражения вирусом ККГЛ на южном побережье Крыма с последующим заносом инфекции в Воронежскую область.
Изоляты вируса ККГЛ, формирующие подгруппу «Крым» (Vd) генотипа «Европа-1», выявленные в сыворотке крови больной и суспензиях клещей, собранных в КФО, описаны впервые и являются эндемичными для территории Крымского полуострова. Принадлежность вариантов вируса ККГЛ, циркулирующих в Крыму к генотипу «Европа-1», согласуется с ранее установленными ареалами распространения генотипов вируса в мире. Штаммы вируса ККГЛ генотипа «Европа-1» циркулируют на территории юга европейской части России, Турции и стран юго-восточной Европы, причем для каждой из перечисленных территорий характерны штаммы различных субтипов генотипа «Европа-1». Крымский полуостров расположен в центре ареала распространения генотипа «Европа-1», является географически изолированной территорией, что объясняет формирование в данном регионе вариантов вируса, отличающихся от других штаммов генотипа «Европа-1». Несоответствие топологии филогенетических деревьев, построенных на основе нуклеотидной последовательности S-, M- и l-сегментов генома вируса ККГЛ, свидетельствует о происходящем процессе генетического обмена сегментами между российскими, крымскими штаммами и штаммами, циркулирующими на Балканском полуострове.
Территория КФО является рекреационной зоной, привлекательной для туристов, что повышает риск завоза КГЛ в регионы РФ и другие страны. Уровень инфицированности иксодовых клещей в Алуштинском районе КФО, установленный при проведении эпизоотологического обследования южного побережья Крыма, составил 32,3%, что свидетельствует об активной циркуляции вируса ККГЛ в данном районе. Для оценки эпидемического потенциала природного очага КГЛ в Крыму требуется регулярное проведение эпизоотологического обследования территории Крымского полуострова, а также выполнение дальнейших молекулярно-генетических исследований популяции вируса ККГЛ в очаге.
Финансирование. Работа выполнена за счет базового государственного финансирования ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Сведения об авторах:
Куличенко Александр Николаевич (Kulichenko Alexander) — д-р мед. наук, проф., директор института, e-mail: kulichenko_an@list.ru
Волынкина Анна Сергеевна (Volynkina Anna) — научн. сотр. лаборатории природно-очаговых инфекций, e-mail: volyn444@mail.ru
Котенев Егор Сергеевич (Kotenev Egor) — канд. биол. наук, зав. лаб. природно-очаговых инфекций, e-mail: egor_ kotenev@mail.ru
Писаренко С.В. (Pisarenko Sergey) — канд. хим. наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии, e-mail: pisarenko_sv@mail.ru
Шапошникова Людмила Ивановна (Shaposhnikova Ludmila) — канд. биол. наук, зав. лабораторией медицинской паразитологии
Лисицкая Яна Владимировна (Lisitskaya Yana) — канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории природно-очаговых инфекций, e-mail: yanich.ka@mail.ru
Василенко Надежда Филипповна (Vasilenko Nadezhda)
— д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории эпидемиологии, e-mail: nfvasilenko@mail.ru
Цыганкова Ольга Ивановна (Tsygankova Olga) — д-р мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории сибирской язвы
Евченко Юрий Михайлович (Evchenko Yuriy) — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории подготовки специалистов
Тохов Юрий Мухаммедович (Tokhov Yuriy) — д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории медицинской паразитологии, e-mail: tochov@mail.ru
Савельев Вилорий Николаевич (Saveljev Viloriy) — д-р мед. наук, зав. лабораторией холеры и др. кишечных инфекций
Тихонов Сергей Николаевич (Tihonov Sergey) — канд. мед. наук, директор противочумной станции
Пеньковская Наталья Александровна (Penkovskaya Natalia) — канд. мед. наук, руководитель управления
ЛИТЕРАТУРА
1. Смирнова С.Е. Крымская геморрагическая лихорадка (этиология, эпидемиология, лабораторная диагностика). М.: АТиСО; 2007.
2. Bente D.A., Forrester N.L., Watts D.M., McAuley A.J., Whitehouse C.A., Bray M. Crimean-Congo hemorrhagic fever: History, epidemiology, pathogenesis, clinical syndrome and genetic diversity. Antiviral Res. 2013; 100 (1): 159—89. doi:10.1016/j.antiviral.2013.07.006.
3. Flick R. Molecular biology of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. In: Crimean—Congo Hemorrhagic Fever: a Global Perspective / Eds. O. Ergonul, C.A. Whitehouse. Dordrecht (Ш): Springer; 2007: 35—44.
4. Carroll S.A., Bird B.H., Rollin P.E., Nichol S.T. Ancient common ancestry of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Mol. Phylogenet. Evol. 2010; 55 (3): 1103—10. doi:10.1016/j.ympev.2010.01.006.
5. Hewson R. Molecular epidemiology, genomics, and phylogeny of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Jn: Crimean-Congo Hem-orrhagic Fever: a Global Perspective / Eds. O. Ergonul, C.A. White-house. Dordrecht (Ж): Springer; 2007: 45—55.
6. Волынкина А.С., Куличенко А.Н. Генетический мониторинг вируса Крымской—Конго геморрагической лихорадки на юге Европейской части России в 2011 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2012; [4 (114)]: 80—5.
7. Карань Л.С., Платонов А.Е., Смирнова С.Е., Вышемирский О.И., Журавлев В.И., Еременко Е.И. и др. Генетические исследования при КГЛ: от диагностики до молекулярной эпидемиологии. В кн.: Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: ЗАО «Гриф и К»; 2007. 57—61.
8. Sherifi K., Cadar D., Muji S., Robaj A., Ahmeti S., Jakupi X. et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus clades V and VI (Europe 1 and 2) in ticks in Kosovo, 2012. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014; 8 (9): e3168. doi: 10.1371/journal.pntd.0003168.
9. Kuhn J.H., Seregin S.V., Morzunov S.P., Petrova I.D., Vyshemirskii O.I., Lvov D.K., et al. Genetic Analysis of the M RNA Segment of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Strains Involved in the Recent Outbreaks in Russia. Archives of Virology, 149 (2004), 2199—2213 dx.doi.org/10.1007/s00705-004-0354-3.
Поступила 18.01.16
REFERENCES
1. Smirnova S.E. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (Etiology, Epidemiology, Laboratory Diagnosis). Moscow: ATiSO; 2007. (In Russian)
2. Bente D.A., Forrester NT., Watts D.M., McAuley A.J., Whitehouse C.A., Bray M. Crimean-Congo hemorrhagic fever: History, epidemiology, pathogenesis, clinical syndrome and genetic diversity. Antiviral Res. 2013; 100 (1): 159—89. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.07.006.
3. Flick R. Molecular biology of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. In: Crimean—Congo Hemorrhagic Fever: a Global Perspective / Eds. O. Ergonul, C.A. Whitehouse. Dordrecht (Ш): Springer; 2007: 35—44.
4. Carroll S.A., Bird B.H., Rollin P.E., Nichol S.T. Ancient common ancestry of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Mol. Phylogenet. Evol. 2010; 55 (3): 1103—10. doi: 10T016/j.ympev2010.01.006.
5. Hewson R. Molecular epidemiology, genomics, and phylogeny of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. Jn: Crimean-Congo Hemorrhagic Fever: a Global Perspective / Eds. O. Ergonul, C.A. Whitehouse. Dordrecht (NL): Springer; 2007: 45—55.
6. Volynkina A.S., Kulichenko A.N. Genetic monitoring of Crimean-Congo hemorrhagic fever virus in the South of the European Part of Russia. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2012; [4 (114)]: 80—5. (in Russian)
7. Karan' L.S., Platonov A.E., Smirnova S.E., Vyshemirskiy O.I., Zhuravlev V.I., Eremenko E.I. et al. Genetic studies at the CCHF: from diagnosis to molecular epidemiology. In: Arboviruses and Arbovirus Infection. Moscow: ZAO «Grief and K»; 2007: 57—61. (in Russian)
8. Sherifi K., Cadar D., Muji S., Robaj A., Ahmeti S., Jakupi X. et al. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus clades V and VI (Europe 1 and 2) in ticks in Kosovo, 2012. PLoS Negl. Trop. Dis. 2014; 8 (9): e3168. doi: 10.1371/journal.pntd.0003168.
9. Kuhn J.H., Seregin S.V., Morzunov S.P., Petrova I.D., Vyshemirskii O.I., Lvov D.K., et al. Genetic Analysis of the M RNA Segment of Crimean-Congo Hemorrhagic Fever Virus Strains Involved in the Recent Outbreaks in Russia. Archives of Virology, 149 (2004), 2199—2213 dx.doi.org/10.1007/s00705-004-0354-3.
A NEW GENETIC VARIANT OF THE CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS ISOLATED IN CRIMEA
A. N. Kulichenko', A. S. Volynkina1, E. S. Kotenev', S. V. Pisarenko', L. I. Shaposhnikova', Y. V. Lisitskaya', N. F. Vasilenko', O. I. Tsygankova', Y. M. Evchenko', Y. M. Tohov', V. N. Savel'ev', S. N. Tihonov2, N. A. Penkovskaya3
'Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russia ; 2Anti-Plague Station of the Republic of Crimea, Simferopol, Russia; 3
Department of Rospotrebnadzor in the Republic of Crimea and the Federal City of Sevastopol, Simferopol, Russia
This work represents the results of the genetic identification of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHF virus) strains isolated in the Crimean Federal District in conducting the epidemiological survey of the imported case of CCHF from Crimea in 2015. One sample of the serum from a patient and 61 pools (506 specimens) of ticks collected during the epizootiological survey of 6 administrative districts of the Crimean Federal District were tested using PCR for the presence of the CCHF virus RNA. RNA of the CCHF virus was detected in serum from a patient and 10 samples of ticks. The genetic identification of the CCHF virus was performed by sequencing the virus genome S-, M-, and L-segments. The result of the molecular-genetic analysis revealed a high degree of identity between the samples of the CCHF virus in human serum and three samples of ticks and their belonging to a new genetic Crimea subclade (Vd) of the genotype Europe 1. Whole genome sequencing of two samples of CCHF virus belonging to the Crimea subgroup (Vd) was performed.
CCHF virus variants of the Crimea subclade (Vd) of the Europe-1genotype were described for the first time. These variants were endemic to the territory of the Crimean peninsula.
Keywords: Crimean-Congo hemorrhagic fever, molecular epidemiology, whole genome sequencing, phylogenetic analysis, Crimean Federal District
DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-2-76-80
Funding. This work was supported by basic government funding of the Stavropol State Anti-Plague Institute.
Conflicts of interest. The authors declare that there is no conflict of interest.
