CC BY
115
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 578.833.1:578.52(575.3)
И. Д. Петрова1, Ю. В. Кононова1, Е. В. Чаусов1, А. М. Шестопалов1, Ф. Х. Тишкова2
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ВИРУСА КРЫМСКОЙ-КОНГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ, ЦИРКУЛИРОВАВШИЕ В 2009 г. В ЭНДЕМИЧНЫХ
РАЙОНАХ ЮЖНОГО ТАДЖИКИСТАНА
1ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор", пос. Кольцово, Новосибирская область; 2Таджикский НИИ профилактической медицины Минздрава Республики Таджикистан, Душанбе
В двух эндемичных по крымской-конго геморрагической лихорадке (ККГЛ) районах Таджикистана собрано и обследовано 506 клещей Hyalomma anatolicum. С помощью иммуноферментного анализа и ОТ-ПЦР в 3,4% пулов клещей из района Рудаки были выявлены антиген и РНК вируса ККГЛ. В пулах клещей из района Турсунзаде вирусный антиген обнаружен в 9% проб, а вирусная РНК - в 8,1% проб. Проведенные с целью сравнения со штаммами вируса ККГЛ из базы данных GenBank множественные выравнивания полученных нуклеотидных последовательностей участка S-сегмента генома вируса ККГЛ длиной 287 (996-1282) нуклеотидов и выведенных аминокислотных последовательностей исследованных образцов, а также их филогенетический анализ позволили сделать заключение, что на территории Таджикистана циркулируют варианты вируса ККГЛ генотипов Азия 1 и Азия 2. Важно отметить, что варианты вируса генотипа Азия 1 выявлены в Таджикистане впервые.
Ключевые слова: вирус ККГЛ, зараженность клещей, филогенетический анализ, генотип
Вирус крымской-конго геморрагической лихорадки (ККГЛ) принадлежит к роду Nairovirus семейства Bunyaviridae. Циркуляция вируса в очаге происходит по цепочке клещ - позвоночное животное - клещ. За все время проведения исследований было зарегистрировано выделение вируса ККГЛ от представителей 2 видов аргасовых и 7 родов иксодовых клещей, однако главными переносчиками вируса считаются клещи рода Нуа1отта [18]. В природных очагах основными прокормителями разных стадий клещей являются дикие и домашние позвоночные животные: крупный и мелкий рогатый скот, зайцы, ежи, тушканчики и другие мелкие млекопитающие. Птицы являются прокормителями предимагинальных стадий клещей и могут участвовать в распространении переносчиков на большие расстояния [3].
Вирус ККГЛ имеет широкое распространение: число стран Европы, Азии и Африки, где выявлена его циркуляция, достигает 4 десятков [18, 27]; ареал распространения вируса почти полностью совпадает с ареалом клещей рода Hyalomma [18]. Поддержание циркуляции вируса и его распространение на эндемичной территории зависят от климата, факторов окружающей среды и деятельности человека [20].
В России циркуляция вируса отмечена в некоторых субъектах Южного и Северо-Кавказского федеральных округов (ЮФО и СКФО): в Астраханской, Волгоградской, Ростовской областях, Ставропольском и Краснодарском краях, в Калмыкии, Ингушетии, Дагестане [1]. По данным Роспотребнадзора, за период 1999-2011 гг. в эндемичных по ККГЛ районах ЮФО и СКФО с 1999 по 2007 г. отмечался рост числа заболевших, а с 2008 по 2011 г. наблюдалось снижение заболеваемости [10]. В то же время в сезон 2011 г. общее число заболевших ККГЛ в эндемичных районах было на 43,5% больше по сравнению с аналогичным периодом 2010 г., что
связано с погодно-климатическими условиями зимы 2010-2011 гг., которые благоприятствовали перезимовке клещей [9]. В целом за 13 лет в ЮФО и СКФО выявлен 1501 больной ККГЛ и у 68 (4,5%) больных заболевание закончилось летально [10].
У человека вирус ККГЛ вызывает тяжелую лихорадку и, как правило, с геморрагическим синдромом. Заражение вирусом происходит при присасывании клеща, а также при контакте незащищенных кожных покровов с насосавшимися клещами или кровью больных людей и инфицированных животных. Заболевание начинается внезапно - с резкого подъема температуры до 39-40°С. Отмечаются сильная головная боль, слабость, боли в мышцах и суставах, гиперемия кожи лица, шеи, верхней половины туловища. Дополнительные симптомы могут включать головокружение, нарушение сознания, тошноту, рвоту, боли в эпигастральной области. При дальнейшем течении заболевания развивается геморрагический синдром - появляется геморрагическая сыпь на коже и слизистых оболочках, возможны носовые, желудочные, кишечные или маточные кровотечения, кровохарканье, кровоточивость десен [2, 13]. Летальность среди заболевших ККГЛ может достигать 5-50% [20, 30]. Случаи заболевания людей обычно отмечаются в пределах ареала циркуляции вариантов вируса ККГЛ, однако возможны завозные случаи [5].
Геном вируса ККГЛ представлен тремя фрагментами одноцепочечной РНК отрицательной полярности: малым (Б-сегмент), средним (М-сегмент) и большим ^-сегмент), имеющими размеры около 12 200, 5360 и 1670 нуклеотидов соответственно. В настоящее время определены полноразмерные последовательности геномов 15 штаммов вируса ККГЛ и установлены полные или частичные нуклеотидные последовательности L-, М- и Б-сегментов генома десятков изолятов и штаммов вируса [8, 15, 17, 26]. Наиболее изученным является Б-сегмент вирусного генома. Согласно принятой классификации, варианты вируса ККГЛ по последовательности Б-сегмента генома объединены в 7 генотипов, кластеризующихся на филогенетическом древе в основном по географическому принципу [14, 21, 22]. Исходя из предложенной классификации, для изолятов вируса ККГЛ, выделенных в Таджикистане от клещей и больных людей, ранее была установлена принадлежность к генетической группе Азия 2, к которой также относились штаммы вируса ККГЛ из Казахстана, Узбекистана и Китая [7, 11].
Данная работа посвящена исследованию зараженности клещей в эндемичных районах Таджикистана (Рудаки и Турсунзаде, где в июле 2009 г. произошла вспышка ККГЛ) и определению генотипов циркулирующих там вариантов вируса ККГЛ.
Материалы и методы
Обследованная территория. Для исследования были выбраны эндемичные по ККГЛ районы Таджикистана - Турсунзаде и Рудаки (рис. 1).
Материал для исследований. Материалом для исследований служили иксодовые клещи, собранные с крупного и мелкого рогатого скота в загонах для скота и кошарах в нескольких кишлаках выбранных районов. Транспортировку и хранение клещей вплоть до начала тестирования осуществляли в криопробирках объемом 2 мл ("Nunc", Дания) в сосудах Дьюара с жидким азотом.
Детекция антигена вируса ККГЛ в пробах. Для последующего анализа клещи были рассортированы по полу, возрасту, степени насыщения (для самок) и объединены в пулы, содержащие в среднем по 3 особи. Клещей в пулах растирали в фарфоровых ступках в присутствии жидкого азота с последующим добавлением 1 мл физиологического раствора. Перед проведением иммуноферментного анализа суспензию клещей осветляли в течение 10 мин центрифугированием при 10 000 об/мин и 4°С. Осветленную суспензию клещей анализировали на наличие антигена вируса ККГЛ с использованием тест-системы «ВектоКрым-КГЛ антиген» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Анализ образцов и учет результатов проводили согласно инструкции производителя.
Обратнотранскриптазная полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) и секвенирование. Все положительные на антиген вируса ККГЛ образцы суспензий клещей и несколько отрицательных, выбранных случайным образом, использовали далее для анализа методом ОТ-ПЦР. Для выделения РНК из суспензии клещей использовали набор «РИБО-сорб» («ИнтерлабСервис», Москва) согласно инструкции производителя. Для проведения обратной транскрипции использовали набор RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase («Fermentas», Литва) со случайным гекса-мерным праймером согласно инструкции производителя. ПЦР выполняли с набором праймеров при условиях, описанных ранее [7]. Анализ ПЦР-продуктов проводили путем электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 0,002% бромистого этидия. Очистку ПЦР-продуктов осуществляли с помощью набора для экстракции QIAEX II Gel Extraction Kit («Qiagen»).
Определение нуклеотидных последовательностей выделенных ПЦР-фрагментов проводили на автоматическом анализаторе «Applied Biosystems 3130XL» («Applied Biosystems», США) с использованием набора «BigDye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Kit» («Applied Biosystems», США) согласно инструкции производителя.
Компьютерная обработка нуклеотидных последовательностей. Для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей использовали программы BioEdit v.7.0 [16] и ClustalX v.1.8 [29]. Список использованных нуклеотидных последовательностей вируса ККГЛ (название и номер последовательности в базе данных GenBank http://www. ncbi.nih.gov): TAJUK#7 (JN086996), TAJ/HU8966 (AY049083.2), TAJ/HU9115 (AY297690), TAJ/HU9112 (AY297688), TAJ/HU8978 (AY297691), C-68031 (DQ211642), TAJ/HU8975 (AY297692), KAZ/HU0148 (DQ063581), KAZ/HU0151 (DQ063582), KAZ/ HU2015 (AF362743), TAJ/TI0212 (AY277669), TAJ/TI0213 (AY277668), Uzbek/TI10145 (AF481799.1), YL04057 (FJ562093.1), 79121M18 (GU477494.1), Afg09-2990 (HM452305.1), SR3 (AJ538198.1), Oman (DQ211645.1), Iran-52 (DQ446212.1), Iran-53 (DQ446213.1), Baghdad/12 (AJ538196.1), Matin (AF527810.1), STV/HU29223 (AF481802.1), R0S/HUVLV-100 (DQ206447.1), Kashmanov (DQ211644.1), Bul/HU517 (AY277676.2), Turkey/200310849 (DQ211649.1), R0S/TI28044 (AY277672.1), Tur-key-Kelkit06 (GQ337053.1), АР92 (DQ211638.1), ArD15786 (DQ211640.1), ArD8194 (DQ211639.1), Congo 3010 (U88416.1), Semunya (DQ076413.1), SPU128/81/7 (DQ076415.1), SPU97/85 (DQ211646.1), SPU103/87 (DQ211647.1),ArD39554 (DQ211641.1), SPU4/81 (DQ076416.1).
Филогенетический анализ и расчет генетических расстояний между группами штаммов вируса ККГЛ выполняли методом объединения ближайших соседей с помощью программы Mega
v.5 [28] с использованием двухпараметрической модели нуклеотидных замещений Кимуры [19] и перестановочного анализа по 1000 итераций.
Результаты и обсуждение
Большая часть территории Республики Таджикистан, на которой ежегодно регистрируются случаи заболевания людей [1, 4, 6], является эндемичной по ККГЛ. Согласно статистике заболеваемости по районам, с 2001 по 2008 г. в районе Рудаки регистрировалось от 1 до 4 случаев ККГЛ в год, в 2009 г. случаи заболевания не были зарегистрированы. В районе Турсунзаде случаи заболевания людей с 2001 по 2008 г. не отмечались, однако в июле 2009 г. произошла вспышка ККГЛ.
Приводим выписку из описания вспышки. Первый больной поступил в районную больницу в тяжелом состоянии - высокая температура, сильная головная боль, боль в пояснице, носовое кровотечение, дегтеобразный стул и рвота цвета кофейной гущи, на коже живота сыпь. Вечером этого же дня на фоне нарастающих явлений геморрагического синдрома больной скончался. Клинический диагноз «ККГЛ тяжелой формы с полостными кровотечениями» поставлен ретроспективно.
В больнице за больным ухаживали 7 медицинских работников. При проведении тампонады носа при непрерывном кровотечении и других процедурах (инъекции и туалет) не все 7 человек использовали перчатки и маску.
На 6-е сутки после контакта заболел заведующий инфекционным отделением. Заболевание протекало в тяжелой форме с полостными кровотечениями, и на 6-й день болезни при явлениях нарастающей сердечнососудистой недостаточности врач скончался.
На 8-е сутки после контакта заболел врач-инфекционист. Он был госпитализирован в состоянии средней тяжести (повышение температуры, слабость, головная боль). Через 2 сут температура нормализовалась и состояние улучшилось. Диагноз «ККГЛ легкой формы» поставлен при подтверждении увеличения титра специфических антител ^М в парных сыворотках более чем в 4 раза.
Рис. 1. Места сбора клещей в Таджикистане в 2009 г.
Всего было госпитализировано 12 медицинских работников, контактировавших с погибшими первым больным и заведующим отделением. Ни у кого не было ни жалоб, ни клинических проявлений заболевания. По выявлению специфических антител ^М и более чем четырехкратному росту титра антител в парных сыворотках был поставлен диагноз «ККГЛ легкая форма без геморрагического синдрома» 4 медицинским работникам: медсестре, лаборантке и двум санитаркам. У них в парных сыворотках были выявлены также и антитела IgG.
С первым больным контактировали 5 родственников. Один родственник, ухаживавший за ним, заболел остро, на 5-й день контакта. С такими же симптомами, как и у первого больного, он был госпитализирован на 2-й день болезни. При осмотре дополнительно выявлена кровоточивость десен и петехиальная сыпь на передней стенке груди и живота. В анализе крови отмечены лейкопения и тромбоцитопения. Через сутки пациент умер. Клинический диагноз «ККГЛ тяжелой формы с полостными кровотечениями» подтвержден выявлением в сыворотке крови специфических антител ^М методом ИФА.
В это же время с жалобами на легкую головную боль, общую слабость и незначительное повышение температуры была госпитализирована родственница первого больного. При осмотре никаких изменений селезенки, печени, дыхания не выявлено. Стул и диурез не нарушены. Через 10 дней больная была выписана в удовлетворительном состоянии. В сыворотке крови были обнаружены специфические антитела
^М.
Большинство случаев заражения ККГЛ, относящихся к этой вспышке, были внутрибольничными и произошли из-за отсутствия надлежащей спецодежды. Отмечались также случаи контактного заражения среди родственников. Из 18 человек, вовлеченных в эту вспышку, ККГЛ переболели 9 человек: 3 погибли, 1 врач перенес ККГЛ средней степени тяжести, 1 родственница переболела легко, а 4 медицинским работникам, не имевшим клинических проявлений болезни, на основании результатов ИФА был поставлен диагноз «легкая форма ККГЛ».
Анализ эпидемической ситуации в регионе Среднего Востока показал, что в течение 1-го десятилетия XXI века на территориях сопредельных с Таджикистаном государств тоже имели место случаи заболевания людей ККГЛ. Так, в Пакистане случаи ККГЛ были зарегистрированы в декабре 2005 г. и октябре 2006 г. [24, 25], в Иране - в декабре 2008 г. [12], в Афганистане - в 2009 г. [23]. В Пакистане и Иране все первые заболевшие были местными жителями, по ро-
ду деятельности связанными с сельским хозяйством. В Иране также имели место случаи внутрибольнич-ного заражения. Заболевший в Афганистане был американским военнослужащим; сведения о пути заражения отсутствуют [23]. Таким образом, на момент возникновения вспышки ККГЛ в Таджикистане в сопредельных странах природные очаги ККГЛ были активными.
С целью выявления источников вируса ККГЛ в различных сельских общинах района Турсунзаде были собраны клещи рода Hyalomma и обследованы на наличие вирусного антигена. Были также проведены сбор и обследование клещей в районе Рудаки. В районе Турсунзаде наиболее распространенным видом был H. anatolicum (95,5%) и лишь 4,5% составили клещи вида Н. detritum; в районе Рудаки все собранные клещи относились к виду H. anatolicum. По данным литературы [3], на долю клещей Н. апаШНсит в очагах ККГЛ приходилось свыше 80% от общего количества всех обнаруженных клещей, а в эпидемический сезон в большинстве случаев обнаруживается только этот вид членистоногих. Обилие клещей Н. апаШПсит объясняется их адаптацией как к природным, так и к синантропным биоценозам. Они в значительных количествах обнаруживаются и на пастбищах и в животноводческих помещениях. Кроме того, теплый климат в южной части Таджикистана обеспечивает развитие до двух поколений этих клещей в течение года, поэтому в этой зоне летом на одном животном может быть обнаружено более 100 экземпляров клещей Н. апаШНсит. Следует отметить, что в предгорьях и низкогорьях, где обилие пастбищ позволяет содержать значительно большее поголовье, чем в долинах, основная роль в поддержании стойкой популяции клещей принадлежит скоту личного пользования. При этом животные ночью и зимой обычно содержатся в глинобитных помещениях, в трещинах которых постоянно встречаются все стадии развития клещей Н. апаШНсит [6].
Результаты тестирования клещей Н. апаШНсит на зараженность вирусом ККГЛ с использованием ИФА для выявления вирусного антигена представлены в табл. 1. Всего было исследовано 506 клещей, объединенных в 175 пулов.
Как видно из приведенных в таблице результатов, средняя антигенположительность пулов в различных местах сбора (без учета пола) варьировала от 9,1 до 40%, а соответствующий показатель для клещей - от 3,3 до 15,6% (при этом считали, что в зараженном пуле инфицирован 1 клещ). Средняя антигенположи-тельность клещей по району Турсунзаде составляла 9,0, а аналогичный показатель для самок был выше
Таблица 1
Зараженность клещей по результатам ИФА на антиген вируса ККГЛ
Район сбора клещей Количество клещей/пулов Положительные пулы Зараженность клещей/пулов, %
самок самцов самок самцов самок самцов общая
Рудаки 27/11 90/32 1 3 3,7/9,1 3,3/9,4 3,4/9,3
Турсунзаде 128(24*)/50 251/82 20(7*) 14 15,6/40 5,6/17,1 9,0/25,8
Всего... 165/61 341/114 21 17 12,7/34,4 5,0/14,9 7,5/21,7
Примечание. Звездочкой отмечены сытые самки.
Таблица 2
Сравнение нуклеотидных последовательностей участка в 287 п. о. S-сегмента генома вируса ККГЛ (996-1282)
Генотип Генотип (число образцов в группе)
Азия 1 (16) Азия 2 (21) Африка 1 (2) Африка 2 (2) Африка 3 (5) Европа 1 (7) Европа 2 (1)
Азия 1 - генотип 1** 27/9,4* 26,8 25,4 23,3 19,9 18,8 18,5
Азия 2 - генотип 2 77 59/20,6 25,8 24,7 27,2 27,9 25,8
Африка 1 - генотип 7 73 74 2/0,7 19,5 18,8 18,8 15,3
Африка 2 - генотип 5 67 71 56 11/3,8 19,2 15,7 15,0
Африка 3 - генотип 3 57 78 54 55 19/6,6 18,5 16,4
Европа 1 - генотип 4 54 80 54 45 53 14/4,9 17,1
Европа 2 - генотип 6 53 74 44 43 47 49 0
Примечание. В таблице указаны максимальные числа нуклеотидных замен в геногруппах (числитель) и между генетическими группами (знаменатель). В числителе указан % отличий нуклеотидных последовательностей. * - максимальный % различий внутри группы; ** - обозначение генотипа по предложению M. Mild [21].
примерно в 2,8 раза. Примечательно, что из всех 12 пулов с сытыми самками 58,3% оказались антигенпо-ложительными, что почти в 1,5 раза выше показателя для пулов с ненасосавшимися особями. По району Рудаки средняя антигенположительность клещей составляла 3,4%, что в 2,6 раза меньше этого показателя в районе Турсунзаде.
Полученные по этим двум районам показатели антигенположительности клещей как минимум в 10 раз выше отмечавшихся ранее для других эндемичных по ККГЛ районов Таджикистана [7]. Таким образом, установленные нами уровни вирусофорности клещей свидетельствуют о повышенной активности природных очагов ККГЛ в обследованных районах в указанном году.
Все антигенположительные пулы клещей из района Турсунзаде (34) и Рудаки (4), а также 5 произвольно выбранных отрицательных пулов исследовали в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса ККГЛ. В 5 антигенотри-цательных и 4 антигенположительных пулах из района Турсунзаде вирусная РНК обнаружена не была.
Из 12 произвольно выбранных антигенположи-тельных пулов (9 из района Турсунзаде, 3 из района Рудаки) с помощью ОТ-ПЦР получили фрагменты кДНК К-гена, которые затем были секвенированы. Все установленные нами нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в базе данных GenBank. Последовательности из района Турсунзаде представлены нами в GenBank под номерами Ж402313-Ж402321, а из района Рудаки - под номерами ^421100-^421102. На рис. 2 показано филогенетическое древо, построенное по нуклеотидным последовательностям участка 996-1282 S-сегмента генома вируса ККГЛ методом объединения ближайших соседей.
Сравнение депонированных нами нуклеотидных последовательностей с аналогичными последовательностями других штаммов и изолятов вируса ККГЛ показало принадлежность определенных в данной работе последовательностей из района Рудаки к генотипу Азия 2, а из района Турсунзаде - к генотипу Азия 1, к которому относятся штаммы вируса ККГЛ, циркулирующие в Афганистане, Пакистане, Ираке, Иране, Омане, ОАЭ и на Мадагаскаре (см. рис. 2). При этом варианты вируса генотипа Азия 1 выявлены в Таджикистане впервые. В наших ранних публикациях сооб-
щалось, что штаммы вируса ККГЛ из Таджикистана, выделенные как от больных, так и от клещей в более ранние годы, относились к группе Азия 2 и подразделялись вместе со штаммами вируса ККГЛ из Ирана, Китая, Казахстана, Узбекистана и Туркменистана внутри нее на 2 генетические подгруппы [11].
В табл. 2 приведены результаты сравнения нукле-отидных последовательностей исследуемого участка S-сегмента генома для 54 образцов вируса ККГЛ.
Внутри групп максимальные различия варьируют от 2 до 59 нуклеотидов. Между генетическими группами число различий лежит в диапазоне от 43 до 80 нуклеотидов на участке в 287 нуклеотидов. Внутри генотипа 1 максимальное число различий в нуклеотидных последовательностях достигает 27, а число отличий от вирусов других генотипов варьирует от 53 до 77 или от 18,5 до 26,8%. Эти величины немного выше аналогичных величин для полных нуклеотидных последовательностей малого сегмента (от 9,4 до 19,8%). Полученные данные множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей указывают на принадлежность вариантов вируса из района Турсунзаде к генетической группе Азия 1.
Кроме того, на рис. 3 представлено множественное выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей фрагмента N-белка исследованных нами образцов вируса ККГЛ с последовательностями штаммов и изолятов этого вируса из других регионов мира. На этом рисунке видны все выявленные нами аминокислотные замены. Двадцать один из 54 анализируемых нами вирусных образцов имел идентичную изоляту SPU97 последовательность фрагмента белка N; некоторые образцы из 21 на рис. 3 не приведены.
Для всех исследованных нами полевых изолятов из района Турсунзаде была характерна радикальная замена Gln^Leu (405 а. о.). Она встречается у всех задепонированных в базе данных GenBank штаммов вируса ККГЛ из группы Азия 1 и только у них, что говорит об уникальности данной аминокислоты для этой генетической группы. S-сегмент генома вируса ККГЛ достаточно консервативен. В выведенных полных последовательностях N-белка вирусов различных генетических групп число уникальных аминокислотных позиций варьирует от 2 до 5. Таким образом, наличие уникальной аминокислоты Leu в позиции
Рис.2. Филогенетическое древо, построенное по нуклеотидной последовательности участка 996-1282 S-сегмента генома вируса
ККГЛ.
Определенные в данной работе образцы отмечены черными точками. Справа указаны генотипы вируса. Внизу дана шкала генетических расстояний (нуклеотидных замен на сайт). На древе показаны значения надежности узлов от 70% и выше.
315 325 335 345 355 365 375 385 395 405
БРи97-АфЗ УКАСУТРЕТЕ РТУЗ(2ЕЬЕЕЬ СЮЭРКСГККМ ККАЬЬЗТРМК ЙГСККЬУЕЬЕА ООЭЕООЫБНУ МНРАУЬТАбК 13ЕМСУСЕ6Т 1РУАЫР0БАА ОСЗб
Аг0395-Аф3 ...................................Т..........................................................
КАг/Ни0151-Аз2 .............................. И...............................................................
КАИ/Ни2 015-Аз2 ...............................................................................А..............
КАг/Ни01148-Аз2 ........А...............................................................К.....................
С-68 О 31-Аз2 ..............................................................................................
ТАЛЖ# 7 /10-Аз2 ..............................................................................................
иг/НойгЬа-Аз2 ...................................................................... V. . .В...................
ТАСГ/Ни8 97 8-Аз2 ....И.........................................................................................
ТАСГ/Ни8966-Аз2 ....................................................................................Б.........
7 9121М18-Аз2 ......................................Ь.......................................................
УЬО 4 0 5 7-Аз2 ......................................Ь.......................................................
ТА:г/Ни8975-Аз2 ..............................................................................................
ТАа/Т1ТазЬ2-Аз2 ..............................................................................................
ТА^Т1ТазЬ7-Аз2 ..............................................................................................
ТА:г/Т12±а7-Аз2 ..............................................................................................
Ви1/Ни517-Евр1 ............I.................................................................................
Тиг/Ке1-Евр1 ............I........Е........................................................................
Тиг2 О 0 3-Евр1 ..............................................................................................
Аг0819-Аф1 АР92-Евр2
Kashmanov-Eвpl ............I.
И2 8 0 4 4-Евр1 ............I.
УЬУ100-Евр1 ............I.
НЦ2 922 3-Евр1 ............I.
£ СопдоЗ 010-Аф2 .....Б.................................................Е.
1гап-53-Аз1 .......Б.
1гап-52-Аз1 .......Б.
Зетипуа-Аф2 .....Б.................................................Е......................................
Отап/97-Аз1 .......Б....................................................................................................................................................................Ь. . .
ВадЬс1ас112-Аз1 ......................Н......................................................................................................................................Ь...
..............................................................................................................................................................Ь. . .
..............................................................................................................................................................ь.. .
А£д2990-Аз1 .......Э....................................................................................................................................................................Ь. . .
НиЗКЗ-Аз1 .......Б. . .А............................................................................................................................................................Ь...
Matin-Aзl .......Б....................................................................................................................................................................Ь. . .
Таj9б-Аз1 ....................................................................................................................................................................................Ь...
Taj78-Aзl ....................................................................................................................................................................................Ь...
Таj99-Аз1 ....................................................................................................................................................................................Ь. . .
Таj25-Aзl .......Э....................................................................................................................................................................Ь...
Taj71-Aзl .......Б...........Е ............................................................................................................................................Ь. . .
Tajl04-Aзl .......Б......Н......................................................................................................................................................Ь. . .
Та^09-Аз1 ........Б..................................................................................................................................................................Ь...
Tajlll-Aзl ........Э..................................................................................................................................................................Ь...
Та^06-Аз1 ........Б..................................................................................................................................................................Ь...
Рис. 3. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей участка Ы-белка вируса ККГЛ (315—409 а. о.). Жирным шрифтом выделены исследованные в данной работе вирусные образцы.
N-белка 405 у образцов вируса из района Турсунзаде является дополнительным подтверждением того, что эти образцы относятся к генетической группе Азия 1. На основании этого мы можем предположить, что вспышка ККГЛ в 2009 г. в районе Турсунзаде связана с циркуляцией на этой территории вариантов вируса генетической группы Азия 1.
В заключение можно сделать следующие выводы. Установленный нами уровень вирусофорности клещей H. anatolicum являлся показателем повышенной активности природных очагов ККГЛ в районах Турсунзаде и Ру-даки на момент исследования. Филогенетический анализ полевых изолятов вируса ККГЛ от собранных в 2009 г. в двух районах Таджикистана клещей H. anatolicum показал их принадлежность к генетическим группам Азия 2 и Азия 1, представители последней выявлены нами в Таджикистане впервые. В связи с этим можно утверждать о расширении ареала генетической группы Азия 1. Группой ученых [21] была предпринята попытка понять пути миграции вируса ККГЛ в мире. Исходя из результатов филогенетического и филогеографического анализа, они предположили, что странами-донорами вируса ККГЛ генотипа 4 (Европа 1) является Турция, генотипа 2 (Азия 2) - Китай, генотипа 1(Азия 1) - ОАЭ. Таким образом, можно считать, что вирус генотипа 1 распространялся из ОАЭ на северо-восток до Ирана, Пакистана и Афганистана, имеющего протяженную границу с Таджикистаном. Выявление нами вируса ККГЛ генотипа 1 на территории южной части Таджикистана хорошо вписывается в предложенную авторами модель распространения вируса. Возможно, мигрировавший вместе с животными вирус закрепился на территории Таджикистана в связи с изменением климатических условий или расширением использования земли под пастбища.
До сих пор исследования вирусных образцов из района Турсунзаде на молекулярном уровне не проводились, нуклеотидные последовательности вариантов вируса из этого района в базе данных GenBank отсутствуют. В связи с этим наши первые данные о выявлении вируса ККГЛ генотипа Азия 1 на юге Таджикистана требуют дополнительных молекулярно-эпидемиологических исследований, направленных в том числе на определение последовательностей других участков генома выявленных вариантов вируса и изучение вирусных образцов, полученных от заболевших во время упомянутой вспышки ККГЛ и в последующих вспышках.
Авторы выражают благодарность сотруднику отдела биохимии вирусов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора С. В. Серегину за предоставление контрольного образца для постановки ОТ-ПЦР, а также за ценные советы и замечания при подготовке нас-тоящей статьи к публикации.
Работа выполнена за счет базового финансирования ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Сведения об авторах:
Петрова Ирина Дмитриевна - вед. науч. сотр., канд. биол. наук; ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел микроскопических исследований, e-mail: idpetr@ vector.nsc.ru, pizulja@mail.ru;
Кононова Юлия Владимировна - науч. сотр., канд. биол. наук, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора,
отдел зоонозных инфекций и гриппа, e-mail: kononova@ vector.nsc.ru, yuliavk@list.ru;
Чаусов Евгений Владимирович - зав. сектором молекулярной диагностики, канд. биол. наук; ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов, e-mail: echausov@vector.nsc.ru;
Шестопалов Александр Михайлович - зав. отделом, д-р биол. наук; ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, отдел зоонозных инфекций и гриппа, e-mail: shestopalov@ vector.nsc.ru, shestopalov2@ngs.ru;
Тишкова Фарида Хаматгалиевна - зав. лаб., д-р биол. наук, Таджикский научно-исследовательский институт профилактической медицины Минздрава Республики Таджикистан, лаборатория вирусологии, e-mail: ftishkova@gmail.com.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аристова В. А., Колобухина Л. В., Щелканов М. Ю., Львов Д. К. Вопросы вирусологии. 2001;4: 1-14.
2. Геморрагическая лихорадка Крым-Конго. URL:http://www. infectology.ru/nosology/infectious/viral/krim_kongo.aspx
3. Котти Б. К., Дятлов А. И. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005; 4: 98-102.
4. Куйма А. У., Пак Т. П. В кн.: Медицинская вирусология: Труды ИПВЭ АМН СССР. М.; 1915; 22 (3): 101-13.
5. Куличенко А. Н., Малецкая О. В., Антоненко А. Д. и др. Проблемы особо опасных инфекций. 2008; 95: 5-9.
6. Пак Т. П., Михайлова Л. И. Душанбе: Ирфон; 1913. 154 c.
1. Онищенко Г. Г., Туманова И. Ю., Вышемирский О. И. и др. Вопросы вирусологии. 2005. 1: 23-26.
8. Петрова И. Д., Серегин С. В., Петров В. С. и др. Вопросы вирусологии. 2003; 2: 8-11.
9. Письмо от 01.11.2011 № 01/13850-1-32 «Об итогах надзора за КГЛ в эпидсезон 2011 года». URL: http://rospotrebnadzor.ru/ documen/letters.
10. Приложение к Письму от 09.04.2012. № 01/3620-12-32 «Об эпидемиологической ситуации по КГЛ в 2011 году и прогнозе заболеваемости на 2012 год». URL: http://rospotrebnadzor.ru/documen/letters.
11. Серегин С. В., Туманова И. Ю., Вышемирский О. И. и др. Доклады Академии наук. 2004; 398 (5): 1-4.
12. Chinikar S., Ghiasi S. M., MoradiM. et al. Euro Surveill. 2010; Vol. 15-N41 - Pii: 19120; Erratum in: Euro Surveill. 2011; 16 (18): Pii: 19858.
13. Crimean-Congo Hemorrhagic Fever. URL: http://www.cdc.gov/nci-dod/dvrd/spb/mnpages/dispages/cchf.htm.
14. Deyde V. M., Khristova M. L., Rollin P. E. et al. J. Virol. 2006; 80: 8834-42.
15. Duh D., Nichol S. T., Khristova M. L. et al. Virol. J. 2008; 5: 1.
16. Hall T. A. Nucl. Acids Symp. Ser. 1999; 41: 95-8.
11. Honig J. E., Osborne J. C., Nichol S. T. ^mean. Virology. 2004; 321 (1): 29-35.
18. HoogstraalН. J. Med. Entomol. 1919; 15 (4): 301-411.
19. KimuraM. J. Mol. Evol. 1980; 16: 111-20.
20. Maltezou H. C., Papa A. BMC Medicine. 2011; 9: 131-49.
21. Mattias Mild, Melinda Simon, Jan Albert, Ali Mirazimi. J. Gen. Virol. 2010; 91: 199-201.
22. Morikava S., Saijo M., Kurane I. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 2001; 30: 315-89.
23. Olschläger S., Gabriel M., Schmidt-Chanasit J. et al. J. Clin. Virol. 2011; 50 (1): 90-2.
24. Rai M. A., Khanani M. R., Warraich H. J. et al. J. Med. Virol. 2008; 80 (6): 1004-6.
25. Saleem J., Usman M., Nadeem A. et al. Int. J. Infect. Dis. 2009; 13 (3): 121-3.
26. Seregin S. V., Samokhvalov E. I., Petrova I. D. et al. Virus Genes. 2004; 28 (2): 181-93.
21. Swanepoel R., Shepherd A. J., Leman P. A. et al. Am. J. Trop. Med.
Hyg. 1981; 36 (1): 120-32. 28. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. Mol. Biol. Evol. 2011; 28 (10): 2131-9.
29. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F. et al. Nucl. Acids Res. 1997; 24: 4876-82.
30. Whitehouse C. A. Antiviral Res. 2004; 64 (3): 145-60.
nocTynuna 08.06.12
GENETIC VARIANTS OF THE CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGIC FEVER VIRUS CIRCULATING IN ENDEMIC AREAS OF THE SOUTHERN TAJIKISTAN IN 2009
I. D. Petrova1, Y. V. Kononova', E. V. Chausov1, A. M. Shestopalov1, F. H. Tishkova2
1 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 2 Tajik Research Institute of Preventive Medicine, Ministry of Health of the Republic of Tajikistan, Dushanbe, Tajikistan
506 Hyalomma anatolicum ticks were collected and assayed in two Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) endemic regions of Tajikistan. Antigen and RNA of CCHF virus were detected in 3.4% of tick pools from Rudaki district using ELISA and RT-PCR tests. As of Tursunzade district, viral antigen was identified in 9.0% of samples and viral RNA was identified in 8.1% of samples. The multiple alignment of the obtained nucleotide sequences of CCHF virus genome S-segment 287-nt region (996-1282) and multiple alignment of deduced amino acid sequences of the samples, carried out to compare with CCHF virus strains from the GenBank database, as well as phylogenetic analysis, enabled us to conclude that Asia 1 and Asia 2 genotypes of CCHF virus are circulating in Tajikistan. It is important to note that the genotype Asia 1 virus was detected for the first time in Tajikistan.
Key words: CCHF virus, tick infection rate, phylogenetic analysis, genotype
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.828.6]-092:612.017.1]-078.33
Rezvan Bagheri1*, Bahareh Rabbani2, Nejat Mahdieh3, Hossein Khanahmad4, Mansour Abachi5,
Soheila Asgari6
PCR-ELISA: A DIAGNOSTIC ASSAY FOR IDENTIFYING IRANIAN HIV SEROPOSITIVES
Reproductive Biotechnology Research Center, Avicenna Research Institute, Academic Center for Education, Culture and Research
(ACECR), Tehran, Iran. 2Genetic Medical Group, Faculty of Medicine, Ghazvin University of Medical Sciences, Ghazvin, Iran; 3Medical Genetic Group, Faculty of Medicine, Ilam University of Medical Sciences, Ilam, Iran; 4Department of anatomical sciences and molecular biology, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran; 5Biotechnology Research Center, Pasteur Institute of Iran, Tehran, Iran; 6International campus, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran
Quantitative viral load monitoring is an important indicator of prognosis in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). PCR-ELISA as a quantitative method is proven to be sensitive and specific for quantification of HIV-1. Extracted DNA of thirty seropositive and twenty seronegative individuals which were confirmed by ELISA and western blot were amplified with digoxigenin- labeled nucleotides; and then in ELISA procedure biotin-labeled probes were hybridized to the PCR products. Diluted PCR products were analysed by electrophoresis and ELISA methods. The observation revealed that combination of nested-PCR and ELISA leads to a sensitive and specific identification of three copies in HIV-infected; the specificity and sensitivity were 95% and 96.7%, respectively. In conclusion, PCR-ELISA was 10 fold more sensitive than nested-PCR. This study developed a high sensitive PCR-ELISA to assess the quantification of proviral DNA load in the most relevant case of HIV-1 subtype. The reproducibility and reliability of this high-throughput test makes it appropriate for general laboratories to use for quantification of viral load and clinical diagnosis.
Key words: HIV, PCR-ELISA, PCR, High Sensitivity
AIDS was recognized as a new emerging disease in the beginning of the 1980s and identified as a transmissible pathogen leading to death worldwide. Although global effort is used to control the AIDS pandemic, about 34 million people in the world are affected with human immunodeficiency virus (HIV) and approximately 2.7 million people are infected each year [1]. Determining the true prevalence of HIV-1 infection is a critical step in controlling and treatment of the disease; therefore there
is always a need to improve diagnostic methods of viral detection.
Many diagnostic procedures used to identify HIV infected individuals by testing blood products for antibodies against HIV antigen such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) [2] and western blot [3] techniques. The detection of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) which relies on hybridization assays are not sensitive enough for diagnostic purposes. These resource-limited settings highly predict infection and are commonly applicable for diagnosis of HIV infection, however they have some weaknesses like representing false-negative results in acute HIV infection and false-positive in intact vaccine recipients and infants with HIV-seropositive mothers [4, 5]. Viral detection assays like antigen cultures and nucleic acid amplification procedures could also be used. PCR detection is increasingly used for the non-culture based laboratory diagnosis [6]. Neither antigen detection nor hybridization assays have reached a reasonable satisfactory point of sensitivity in term of viral detection [7]. To overcome the poor sensitivity and specificity of assays, an in vitro amplification method -nested PCR- would amplify the conserved sequences of HIV-1 proviral DNA providing high-quality sequences to identify the exact PCR fragments [8].
Quantitative methods have been developed to determine absolute quantification of RNA viral load [9] or pro-
*Correspondence Author:
Rezvan Bagheri (MSc), Avicenna Research Institute, P.O. Box: 19615-1177, Tehran, Iran. Postal code: 1936773493. E-mail: R.Bagheri@avicenna.ac.ir
