CC BY
30
УДК 577.1:546.221:591.1
Ольховський О.С., Мельник А.В., 3ai4KO Н.В.
В1КОВ1 В1ДМ1ННОСТ1 ПРОДУКЦ11 Г1ДРОГЕН СУЛЬФ1ДУ В СЕРЦ1 ТА АОРТ1 ЩУР1В
Вiнницький нацiональний медичний уыверситет iM. М.1.Пирогова
В po6omi вивчено продукцю H2S в серцево-судиннш cucmeMi щурiв та 'i'i змти в процес старт-ня. Доcлiджeння проведет на 30 бших безпородних щурах трьох втових груп: 1-2 Mic. (ют), 6-8 Mic. (дорослЦ, 24-26 Mic. (cmарi). BMicm H2S в сироватщ кровi оцтювали за реакцгею з N,N-димemил-пара-фeнiлeндiамiном. Активн^ть H2S-продукуючuх eнзuмiв (miоcульфаmдиmiолcуль-фiдmранcфeразu, циcmаmiонiн-в-cинmази, ц^тат^нЫ-у^ази, циcmeiнамiноmранcфeрази) в по-cmядeрному гомогенат1 ceрця та аорти визначали за кшькктю утвореного H2S. Вм^т ceрuну та ц^татюнту визначали методом тонкошаровот хроматографа на цeлюлозi, а рiвeнь ц^те-тну - за реакцгею з нiнгiдрuновuм реактивом у ки^ому ceрeдовuщi. Вcmановлeно, що жновними cубcmраmамu для cuнтезу H2S в мiокардi та аорmi щурiв е цистетн та т^ульфат-атон, тодг як гомоциcmeiн та ц^тт не е ефективним джерелом H2S. Утворення H2S в ceрцeво-cудиннiй cиcmeмi вiдбуваеmьcя в реакщях дecульфурування циетеТну за учаcmi ц^тат^нЫ-у^ази, трашамтування циетеТну з а-кетоглутаратом за учаcmi циcmeiнамiноmранcфeрази та в реа-кцгТ вiдновлeння т^ульфат-атону за учаcmi miоcульфаmдиmiолcульфiдmранcфeрази. Найвища H2S-продукуюча активн^ть зарееотрована у miоcульфаmдиmiолcульфiдmранcфeрази i менша у циcmаmiонiн-y-лiази та циcmeiнамiноmранcфeрази. В процеЫ cmарiння в аорmi та мiокардi щу-рiв вiдмiчаеmьея доcmовiрнe зниження продукцп H2S в реакщях, каmалiзованих ц^тат^нЫ-у-лiазою, циcmeiнамiноmранфeразою та miоcульфаmдиmiолcульфiд-mранcфeразою, а також фор-муетюя дефщит H2S в cuроватц кровi. Ключовi слова: старЫня, пдроген сульфщ, ферменти, серце, аорта
Робота виконуеться в рамках планово!' НДР кафедри бюлопчно! та загально! xiMii Вшницького нацюнального медичного унлвер-ситету iм. М.1.Пирогова: «ОбмЫ гомоцистеТну в умовах дм нутрiентних чинниив та при рiзних патолопчних станах» (№ держрее-страцп - 0106U005134).
Вступ
Вщомо, що вк е одним iз чиннимв, який визна-чае поширенють серцево-судинних захворювань, патологи нирок, церебро-васкулярноТ патологи тощо. В процеа старшня оргаызму вщбуваються суттевi змши в системах, як визначають адаптации можливост оргаызму та чутливють до ди патолопчних чинниш, особливо в тих, що забез-печують регуляцш судинного тонусу. Наприклад, з вком формуеться дисбаланс в системi L-аргiнiн/ NO-синтаза, а також посилюеться продук^я ак-тивних форм кисню [2, 6].
Останшм часом з'ясувалось, що поряд з системою оксиду азоту важливу роль в регуляцп судинного тонусу в^грае бiологiчно-активний метабол^ сiрковмiсних амiнокислот гiдроген су-льфщ (H2S) [14]. Не виключено, що змши орган-ноТ продукцiТ Н^ е ще одним iз чинниш вк-асоцiйованоТ патологiТ. На сьогодн вiдомо [3], що утворення Н^ в тканинах вiдбуваеться в ре-акцiях десульфурування цистеТну, гомоцистеТну за участ ензимiв цистатiонiн-Y-лiази (КФ 4.4.1.1), цистатюнш-р-синтази (КФ 4.2.1.22) i цистеТнамн нотрансферази (КФ 2.6.1.3) та вщновлення тю-сульфату за участi тюсульфатдитюлсульфщт-рансферази (КФ 2.8.1.5). Постае питання щодо змш продукцiТ H2S в тканинах та органах в процеа старшня оргашзму i як це вщображаеться на його вмют в сироватцi кровi. Метою роботи було вивчення вмюту H2S в сироватщ кровi та активностi ензимiв, що забезпечують утворення H2S в мiокардi та аортi щурiв рiзних вiкових груп.
Методи дослiдження Для дослщжень використано 30 бiлих безпородних щурiв, якi перебували на стандартному рацюш вiварiю з водним режимом ad libitum та 12-годинним свп"ловим режимом день/нiч. До-слщження проведенi на тваринах трьох рiзних вiкових груп: 1-2 мiс. (юш), 6-8 мiс. (дорослО, 2426 мю. (старi). Тварин виводили з експерименту шляхом декаттаци пiд легким ефiрним наркозом. Всi етапи дослщжень виконан згiдно «6в-ропейсько! конвенцiТ про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та ш-ших наукових цтей» (Страсбург, 1986) та за-тверджен комiтетом з бiоетики ВНМУ iм. М.1. Пирогова.
Мiокард перфузували холодним 1,15% роз-чином калiю хлориду, гомогешзували при 3000 об/хв (тефлон-скло) в середовищi 1,15% калiю хлориду у сшввщношены 1:4. Аорту ретельно промивали холодним 1,15% розчином калш хлориду, видаляли адвентицш, а ендотелiаль-ний та м'язовий шари гомогенiзували в середо-вищi 1,15% калiю хлориду у сшввщношенш 1:4. Гомогенати оргашв центрифугували при 600 g та 4оС упродовж 30 хвилин для отримання по-ст'ядерно! фракцiТ.
Активнють тюсульфатдитюлсульфщтранс-ферази, цистатюнш-р-синтази, цистатюнш-Y-лiази, цистеТнамiнотрансферази оцiнювали з ви-користанням шкубацшних середовищ, склад яких наведено в табл. 1. Концентрацп субстра^в та кофакторiв, значення рН та тривалють шку-
бацп, як забезпечували оптимальнi умови ви-значення активностi ферментiв, були пшбраж завчасно.
Утворення H2S оцшювали за приростом су-льфiд-анiону, вмют якого визначали за реакцieю з N,N-диметил-пара-фенiлендiамiном [8]. Конце-нтрацiю шрувату визначали за реакцieю з 2,4-динiтрофенiлгiдразином [5]. Вмiст серину та цис-татiонiну дослiджували методом тонкошарово''' хроматографп на целюлозi [10]. Вмют цисте'ну оцiнювали з нiнгiдриновим реактивом у кислому середовищi [9].
Статистичну обробку результат проводили за допомогою стандартних статистичних про-грам "MS Exel XP". Вiрогiднiсть вiдмiнностей оцн нювали за t-критерieм Стьюдента.
В робот використанi L-цисте'''н, L-цистин, D,L-гомоцистеш, L-цистатiонiн, L-метiонiн фiрми Sigma (США), а-кетоглутарат, дитiотреiтол, шри-доксальфосфат, L-серин фiрми Fluka (Ымеччи-на). Тюсульфат натрiю, сульфiд натрiю, N,N-диметил-пара-фенiлендiамiн та iншi реактиви були в^чизняного виробництва.
Результати та обговорення Спершу ми визначили спектр та активнють ензимiв, якi забезпечують утворення H2S в мюка-рдi та аорт статевозрiлих щурiв. Вiдомо, що ос-новними прекурсорами H2S е сiрковмiснi амшоки-слоти цисте'ш, цистш та ГЦ, а також тюсульфат [14]. Утворення H2S з цисте'ну каталiзуеться ен-зимами цистешамшотрансферазою, цистатюнш-Y-лiазою, цистатюнш-р-синтазою. Перший ензим забезпечуе десульфурування цисте'шу лише при наявност а-кетоглутарату, останнi два ензими можуть метаболiзувати цисте'н i без косубстрата. Тому, використання шкубацшно''' сумiшi №1, яке мютить лише цисте'ш, дозволило оцшити сумарну цисте'шдесульфуразну активнiсть, яка включае акивностi цистатiонiн-Y-лiази та цистатюнш-р-синтази. Виявилось, що в супернатант постядер-ного гомогенату мiокарду та аорти дорослих щу-рiв сумарн цистешдесульфуразш активностi ста-новили вщповщно 0,23±0,03 та 0,67±0,04 нмоль/хв на 1 мг протешу.
Далi ми оцшили iндивiдуальний внесок цис-татюнш^^ази та цистатюнш-р-синтази у про-дукцш H2S в дослiджуваних органах. З л^ерату-ри вiдомо [14], що цистатюнш^^аза забезпечуе гiдролiтичний розпад цисте'ну до H2S, пiрувату та амiаку, а цистатюнш-р-синтаза викликае де-градацш цисте'ну з утворенням H2S та серину. Тому утворення H2S за участ цистатiонiн-Y-лiази мае бути ешвалентне кiлькостi пiрувату, а за участ цистатюнш-р-синтази - еквiвалентне кть-кост серину. Використовуючи сумiш №7 ми встановили, що в гомогенатах мюкарду та аорти серин утворювався лише в слщових кiлькостях, тодi як синтез шрувату проходив з високою шви-дкiстю. Слiд також зауважити, що швидкють утворення пiрувату в обох дослщжуваних органах практично вдвiчi перевищувала швидкiсть
синтезу H2S (р<0,05), хоча цi продукти мали б з'являтись в ешмолярних ктькостях. Виявлене протирiччя можна пояснити тим, що частина H2S в силу його високо' реакцшно''' здатностi може перетворюватись в продукти, якi не виявляються в реакцп з ^^диметил-пара-феншен^амшом. Так, H2S легко окиснюеться до сульф^у чи тю-сульфату, зв'язуеться з тюлами, оксидом азоту та шшими сполуками [11, 12, 14, 8]. Для пщтвер-дження цього припущення ми дослщили, яка кь лькiсть доданого до гомогенатiв оргашв H2S (у виглядi розчинiв Na2S х 9H2O) вiдкриваеться в заданих умовах (шкуба^я 30 хвилин, середови-ще №1 без цисте'шу). З'ясувалось, що втрати H2S в процес шкубаци гомогенатiв аорти та мюкарду складають приблизно 50%. Отож, якщо врахувати цю поправку, то утворення H2S з цисте'шу практично повнiстю вiдповiдае утворенню шрувату. Ц данi не залишають сумнiвiв, що ос-новний внесок в утворення H2S з цисте'шу нале-жить саме цистатiонiн-Y-лiази, яка каталiзуе десульфурування цисте'шу з утворенням шрувату, тодi як внесок цистатюнш-р-синтази в синтез H2S (при використанш в якостi субстрату одного лише цисте'шу) е незначним.
З л^ератури вiдомо, що синтез H2S може вщбуватись не лише в процеа десульфурування цисте'шу, але i в реакцп конденсацп цисте'шу з ГЦ за участ цистатюнш-р-синтази [14]. З метою оцшки активностi цього шляху продукцп H2S в гомогенатах аорти та мюкарду ми користували-ся шкубацшною сумiшю №2, яка мютила одно-часно ГЦ та цисте'н. За цих умов утворення H2S забезпечуеться одночасно як реакцiею десульфурування цисте'шу за участю цистатюнш-Y-лiази, так i реакцiею конденсацп цисте'шу з го-моцистешом за участю цистатюнш-р-синтази, тому фактично ми отримуемо сумарну швидкють утворення H2S за участю обох фермекпв. Виявилось, що за цих умов сумарна продук^я H2S з цисте'шу та гомоцистешу практично спiвпадала з десульфуразною активнютю цистатюнш-Y-лiази. Очевидно, реак^я конденсацп цисте'шу з ГЦ не мае особливого значення в утворенш H2S у серцi та аорт щурiв.
Далi нами дослщжено, чи можуть ГЦ та цистш бути джерелом H2S в мiокардi та аортi щурiв. Виявилось, що за умов присутност в шкубацш-них середовищах лише ГЦ чи цистшу не вщмн чалося приросту H2S в гомогенатах дослщжуваних оргашв. Отримаш данi свщчать, що ГЦ та цистiн не е ефективним джерелом H2S в серц та аортi щурiв.
Утворення H2S з цисте'шу може також вщбуватись за рахунок реакцп його трансамшування з а-кетоглутаратом пщ дiею цисте'шамшотранс-ферази [14]. При цьому утворюеться 3-меркаптопiруват, який далi спонтанно розклада-еться до H2S та пiрувату. Визначення активностi цього ензиму проводили з використанням шку-бацшно''' сумiшi №3, яка мютила цисте'н та косу-бстрат а-кетоглутарат. Осктьки цисте'н може
метаболiзуватись не лише шляхом трансамшу-вання, але i в реакцп десульфурування за участ цистатiонiн-Y-лiази, то фактично ми рееструемо сумарну активнiсть цистешамшотрансферази та цистатюнш^^ази. Внесок власне цистешамшо-трансферазного шляху в продукцш H2S ми ви-значали як рiзницю мiж сумарною активнiстю цистешамшотрансферази та цистатюнш^^ази (визначену при наявностi в шкубацшному сере-довищi як цистешу, так i а-кетоглутарату), i акти-внютю цистатiонiн-Y-лiази визначеною у вщсут-
Склад iнкубацiйних середовищ для визнач
ност а-кетоглутарату. Виявилось, що швидкють утворення Н^ в реакцп, каталiзованiй цистеша-мiнотрансферазою, становила 0,52±0,07 нмоль/хв. на 1 мг бтка в серц та 0,59±0,05 нмоль/хв. на 1 мг бтка в аорт дорослих щурiв. Слщ вiдмiтити, що при зам^ в середовищi №3 цистешу на еквiмолярнi кiлькостi ГЦ утворення Н^ не спостерiгалось. Тому можна припустити, що арковмюна амiнокислота ГЦ не вступае в реакцш трансамшування з а-кетоглутаратом з утворенням Н^.
Таблиця 1
активност'1 H2S-продукуючих ензим'в в аорт': та серц щур'в
№ сумш Актившсть ензимiв Склад шкубацшних сумiшей (кiнцевi концентрацп)
Сумш №1 Десульфуразна активнiсть цистатiонiн-Y-лiази та цистатюнш-р-синтази (по цистерну) L-цистеТн 6,0 мМ, пiридоксальфосфат 1,34 мМ, трис-буфер 0,08 М (рН 8,5)
Сумiш №1.1 Десульфуразна актившсть цистатюнш-у^ази (по цистину) L-цистин 6,0 мМ, шридоксальфосфат 1,34 мМ, трис-буфер 0,08 М (рН 8,5)
Сумiш №2 Десульфуразна актившсть цистатюнш-у^ази та цистатюнш-р-синтази (по цистерну та ГЦ) L-цистеТн 6,0 мМ, D,L-гомоцистеТн 6,0 мМ, пiридоксальфосфат 1,34 мМ, трис-буфер 0,08 М (рН 8,5)
Сумш №3 Десульфуразна активнiсть цистатюнш-у^ази та цистеТнамiнотрансферази L-цистеТн 6,0 мМ, а-кетоглутарат 1,6 мМ, шридоксальфосфат 1,34 мМ, трис-буфер 0,08 М (рН 8,5)
Сумiш №4 Активнiсть тюсульфатдитюлсульфщ-трансферази Тюсульфат натрто 0,2 мМ, дитютретэл 2,3 мМ, трис-буфер 0,09 М (рН 8,5)
Примiтки: 1. До 0,5 мл iнкубацiйного середовища додавали 0,2 мл постядерного гомогенату органiв; 2.1нкубацю проводили при температурi 37°С; 3. Час iнкубацii' становив 60 хв.; 4. Для попередження втрат Н2Э пiд час нкубацп пробiрки герметизували плiвкою "РагаШт".
Таблиця 2
Актившсть Н^-продукуючих ензим'в в м'юкард! щур'в рiзних вкових груп (М±т, п=10)
Актившсть ензимiв, нмоль/хв. на 1 мг протеину Групи тварин
1-2 мю. 6-8 мю. 24-26 мю.
Тюсульфатдитюл-сульфщтрансфераза 1,70±0,11 1,20±0,06* 1,03±0,07*
Цистатiонiн-Y-лiаза 0,35±0,04 0,23±0,03* 0,15±0,02*#
ЦистеТнамiно-трансфераза 0,80±0,06 0,52±0,07* 0,36±0,03*#
Примтки: 1. * - р<0,05 в'дносно юних щурiв;
2. # - р<0,05 вiдносно дорослих щурiв.
Таблиця 3
Активнють Н^-продукуючих ензимiв в груднiй аортi щурiв рiзних вкових груп (М±т, п=10)
Активнiсть ензимiв, нмоль/хв. на 1 мг протеину Групи тварин
1-2 мю. 6-8 мю. 24-26 мю.
Тюсульфатдитюл-сульфiдтрансфераза 2,90±0,14 1,98±0,08* 1,65±0,04*#
Цистатюнш^^аза 0,88±0,09 0,67±0,04* 0,56±0,03*#
ЦистеТнамiно-трансфераза 0,70±0,08 0,59±0,05 0,48±0,06#
Примiтки: 1. * - р<0,05 в'дносно юних щур'в;
2. # - р<0,05 вiдносно дорослих щурiв.
Також нами дослщжено активнють синтезу Н^ в реакцп вщновлення тюсульфат-анюну за участ тюсульфатдитюлсульфщтрансферази при використанням середовища №4 [3]. Нами встановлено, що активнють тюсульфатдитюлсу-льфщтрансферази в мiокардi та аорт дорослих щурiв е найвищою серед уах шших Н^-продукуючих ензимiв i становить вщповщно 1,20±0,06 нмоль/хв. на 1 мг бтка та 1,98±0,08 нмоль/хв. на 1 мг бтка. Однак, внесок цього ен-зиму в утворення Н^ в серц та аорт щурiв не-вщомий, адже в реакцп був використаний штуч-ний донор гщрогену - дитютретол. Хоча можна думати, що в умовах цтюного оргашзму роль такого вщновника, очевидно, виконуе вщновле-ний глутатюн, вмют якого достатньо високий в серц та аорт.
При розглядi внеску кожного з ензимiв у синтез Н^ в окремих органах виявились певн вщ-
мiнностi. Так, в мiокардi щурiв усiх вiкових груп найбiльша активнють спостер^алась у тюсуль-фатдитiолсульфiдтрансферази, дещо менша у цистешамшотрансферази i найменша у цистат-онiн-Y-лiази. В той же час у аорт найвища активнють виявляеться у тюсульфатдитюлсульфщт-рансферази, найменша у цистешамшотрансфе-рази.
В наступнш частин нашого дослiдження ми оцшили як з вiком змшюеться активнiсть Н^-продукуючих ензимiв в серц та аортi щурiв. Показано (табл. 2; 3), що процес старшня чинить депримуючий вплив на активнють основних ен-зимiв, залучених до синтезу H2S у вказаних органах. Так, у дорослих щурiв рееструеться до-стовiрне зниження активностi тюсульфатдитюл-сульфiдтрансферази, цистатюнш^^ази, цисте-шамшо-трансферази в мiокардi на 29-35%, а в аорт на 15-32% (р<0,05) порiвняно з такими по-
казниками у юних щурiв. У старих щурiв в^^ча-еться ще бтьш виразне зниження продукцп H2S. За цих умов активнiсть вказаних ензимiв в мю-кардi та аорт щурiв була на 30-60% (р<0,05) ме-ншою, нiж у юних щурiв.
Нашi дослiдження (рис. 1) показали, що по мiрi старшня вiдмiчаеться не лише падшня акти-вностi H2S-продукуючих ензимiв в серцево-судиннiй системi щурiв, але i формуеться дефн цит H2S в сироватцi кровi. У дорослих щурiв встановлено зниження вмiсту H2S в сироватцi кровi лише на рiвнi тенденцiТ, тодi як у старих щурiв цi змiни досягали статистично вiрогiдних меж пор1вняно з юними тваринами.
□ Юш Ш Доросл! G3 Стнр!
Рис. 1. Вмст H2S в сироватц кров! щур'в рiзних вкових груп. Примтка. * - р<0,05 вiдносно показниюв у юних шу^в
Таким чином, проведен дослщження показали, що в серц та аорт щурiв утворення H2S вщ-буваеться в реак^ях десульфурування цистеТну за участ цистатiонiн-Y-лiази, трансамiнування цистеТну з а-кетоглутаратом за участi цистеТна-мiнотранферази, а також в реакцп вiдновлення тюсульфат-анюну за участi тюсульфатдитюлсу-льфiдтрансферази. В мiокардi за каталiтичною активнiстю H2S-продукуючi ензими розмщують-ся таким чином: цистатюнш^^аза < цистеТна-мiнотранфераза < тюсульфатдитюлсульфщтра-нсфераза. В аортi розподт цих ферментiв за ак-тивнютю був дещо iншим: цистеТнамшотранс-фераза < цистатюнш^^аза < тюсульфатдитю-лсульфщтрансфераза.
Старiння характеризуеться достовiрним зме-ншенням продукцiТ H2S в серцево-судиннiй систему що супроводжуеться формуванням дефн циту цiеТ бiологiчно-активноТ молекули в сирова-тцi кровi. Причини падшня тканинноТ продукцп H2S з вком остаточно не з'ясованi. На сьогодн вiдомо, що в процесi старшня значно посилю-еться активнiсть втьнорадикального окиснення, що ймовiрно веде до ковалентноТ модифiкацiТ редокс-чутливих ензимiв, як забезпечують утворення H2S [2]. Не виключено також, що з вком знижуеться експресiя вказаних ферментв, адже подiбна закономiрнiсть знайдена для ендотелiа-льноТ NO-синтази [6].
Останшм часом активно дослiджуеться фiзiо-лопчна роль Н2S в органiзмi. Показано, що H2S приймае участь в регуляци судинного тонусу, аг-
регацп тромбоцитiв, функцiТ нирок, скоротливос-т мiокарду, нейротрансмiсiТ, секрецiТ iнсулiну, впливае на процеси запалення та апоптозу [14, 4, 1]. H2S проявляе антиоксидантн та цитопро-текторнi властивостк слугуе перехоплювачем активних форм кисню та стимулюе продукцш глутатiону в гепатоцитах [13]. Ймовiрно, що зме-ншення органно! продукцiТ H2S в процес старш-ня е одним iз можливих метаболiчних чинникiв вк-асоцшовано! патологiТ, в тому числi серцево-судинних захворювань. Тому вивчення ролi по-рушень продукцiТ H2S в розвитку патолопчних станiв, що супроводжують старiння, е досить пе-рспективним напрямком подальших дослiджень.
Висновки
1. Основними субстратами для синтезу H2S в мiокардi та аорт щурiв е цистеТ'н та тюсульфат-анiон. В той же час, гомоцистеТн та цистiн не е ефективним джерелом H2S в цих органах.
2. Утворення H2S в мiокардi та аортi щурiв проходить в реак^ях десульфурування цистеТну за участ цистатiонiн-Y-лiази, трансамiнування цистеТну з а-кетоглутаратом за участ цистеТна-мшотранферази, а також в реакцiТ вщновлення тiосульфату тiосульфатдитiолсульфiдтранс-феразою.
3. За катал^ичною активнiстю H2S-продукуючi ензими розташовуються наступним чином: цистатiонiн-Y-лiаза < цистешамшотран-фераза < тiосульфатдитiолсульфiдтрансфераза (в мiокардi щурiв); цистеТнамiно-трансфераза < цистатiонiн-Y-лiаза < тюсульфатдитюлсульфщт-рансфераза (в аортi щурiв).
4. В процесi старiння достовiрно (на 20-60%) знижуеться активнiсть цистатюнш^^ази, цисте-Тнамiнотранферази, тюсульфатдитюлсульфщ-трансферази в мiокардi та аортi щурiв, а також зменшуеться вмiст H2S в сироватц кровi.
Лiтература
1. За1чко Н.В. Вплив анiонiв гiдросульфiду, дитюшту, сульфiту, тiосульфату та сульфату на агрегацто тромбоцитiв людини / Н.В. Заiчко, О.О. Пентюк // Укр.б^м. журнал. - 2009. - Т. 81, №1. - С.105-113.
2. Кульчицький О.К. Особливост впливу переривчастоТ ппобари-чноТ гiпоксiТ на стан системи оксиду азоту та активнють перок-сидних процесiв у мiокардi щурiв рiзного вiку / О.К. Кульчицький, Р.1. Потапенко, С.М. Новкова // Буковинський медичний вь сник. - 2009. - Т. 13, №4. - С. 177-181.
3. Мельник А. В. Активнють ензимiв синтезу гщроген сульфщу в нирках щурiв / А. В. Мельник, О. О. Пентюк // Укр. б^м. журнал. - 2009. - №4. - С. 12-22
4. Мельник А. В. Дослщження ролi гщроген сульфщу та Ырковмю-них амшокислот в регуляци тонусу ниркових артерш та фтьт-рацп в нирках / А. В. Мельник // Актуальш проблеми сучасноТ медицини: Вiсник УкраТнськоТ медичноТ стоматолопчноТ акаде-м1Т. - 2009. - Т. 9, №4. - С. 98-102.
5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. - М. : Медицина, 1969. - 652 с.
6. Goubareva I. Age decreases nitric oxide synthesis and responsiveness in human platelets and increases formation of monocyte-platelet aggregates / I. Goubareva, E. Gkaliagkousi, A. Shah [et al.] // Cardiovasc Res. - 2007. - V. 75, №4. - P.793-802.
7. Chen X. Production of the Neuromodulator H2S by Cystathionine-p-Synthase via the Condensation of Cysteine and Homocysteine / X. Chen, K.-H. Jhee, W.D. Kruger //The Journal ef Biological Chemistry. - 2004.- V. 279, №50. - Р.52082-52086.
8. Whiteman М. Evidence for the formation of a novel nitrosothiol from the gaseous mediators nitric oxide and hydrogen sulphide / M. Whiteman, L. Li, I. Kostetski [et al.] //Biochem Biophys Res Commun. - 2006. - V. 343, №1. - Р.303-310.
10.
11.
Gaitonde M.K. A spectrophotometric method for direct 12.
determination of cysteine in the presence of other naturally occuring amino acid / M.K. Gaitonde // Biochem. J.- 1967.- V. 104, №2. - P.627-633. 13.
Goldstein J.L. Cystathionine synthase activity in human lymphocytes: induction by phytohemagglutinin / J.L. Goldstein, B.K. Campbell, S.M. Gartler //J Clin Invest.- 1972.- V. 51, №4. - P.1034- 14 1037.
Hildebrandt T.M. Three enzymatic activities catalyze the oxidation of sulfide to thiosulfate in mammalian and invertebrate mitochondria 15.
/ T.M. Hildebrandt, M.K. Grieshaber // FEBS J. - 2008. - V. 275, №13. - P.3352-3361.
Iciek M. Biosynthesis and biological properties of compounds containing highly reactive, reduced sulfane sulfur / M. Iciek, L. Wlodek // Pol J Pharmacol. - 2001. - V. 53, №3. - P.215-225. Kimura Y. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria / Y. Kimura, Y. Goto, H. Kimura // Antioxid Redox Signal. - 2010. - V. 12, №1. - P. 1-13. Lowicka E. Hydrogen sulfide (H2S) - the third gas of interest for pharmacologists / E. Lowicka, J. Beltowski // Pharmacological Reports.- 2007.- V. 59. - P.4-24.
Stipanuk M.H. Characterization of the enzymic capacity for cysteine desulphhydration in liver and kidney of the rat / M.H. Stipanuk, P.W. Beck // Biochem. J. - 1982. - V. 206, №2. - P.267-277.
Реферат
ВОЗРАСТНЫЕ ОТЛИЧИЯ ПРОДУКЦИИ ГИДРОГЕН СУЛЬФИДА В СЕРДЦЕ И АОРТЕ КРЫС Ольховский А.С., Мельник А.В., Заичко Н.В.
Ключевые слова: старение, гидроген сульфид, ферменты, сердце, аорта
В работе изучено продукцию H2S в сердечно-сосудистой системе крыс и его изменения в процессе старения. Исследования проведены на 30 белых беспородных крысах трех возрастных групп: 1-2 мес. (юные), 6-8 мес. (взрослые), 24-26 мес. (старые). Содержание H2S в сыворотке крови оценивали по реакции с N^-диметил-парафенилендиамином. Активность H^-продуцирующих ферментов (тио-сульфатдитиолсульфидтрансферазы, цистатионин-р-синтазы, цистатионин^-лиазы, цистеинами-нотрансферазы) в постядерном гомогенате сердца и аорты определяли по количеству образованного H2S. Содержание серина и цистатионина определяли методом тонкослойной хроматографии на целлюлозе, а уровень цистеина - по реакции с нингидриновым реактивом в кислой среде. Установлено, что основными субстратами для синтеза H2S в миокарде и аорте крыс являются цистеин и тиосульфат-анион, тогда как гомоцистеин и цистин не является эффективным источником H2S. Образование H2S в сердечно-сосудистой системе происходит в реакциях десульфирования цистеина с участием цистатионин^-лиазы, трансаминирования цистеина с а-кетоглутаратом при участии цистеинами-нотрансферазы и в реакции восстановления тиосульфат-аниона с участием тиосульфатдитиолсуль-фидтрансферазы. Наивысшая H^-продуцирующая активность зарегистрирована у тиосульфатдити-олсульфидтрансферазы и меньшая у цистатионин^-лиазы и цистеинаминотрансферазы. В процессе старения в аорте и миокарде крыс отмечается достоверное снижение продукции H2S в реакциях, катализируемых цистатионин^-лиазой, цистеинаминотранферазой и тиосульфатдитиолсульфид-трансферазой, что сопровождается формированием дефицита H2S в сыворотке крови.
Summary
AGE-RELATED DIFFERENCES IN PRODUCTION OF HYDROGEN SULFIDE IN HEART AND AORTA OF RATS
Olhovskiy A.S., Melnik A.V., Zaichko N.V.
Key words: aging, hydrogen sulfide, enzymes, heart, aorta.
This research is devoted to the study of the production of H2S in the cardiovascular system of rats and its changes related with the aging. The study was conducted on 30 white rats of three age groups: 1-2 month rats (adolescents), 6-8 month rats (adults), 24-26 month rats (old). H2S content in the blood serum was determined by reaction with N,N-dimethyl-para-phenylenediamine. Activities of H2S-productive enzymes (thi-osulfate-dithiol sulfurtransferase, cystathionine p-synthase, cystathionine Y-lyase, cysteine transaminase) in the post-nuclear homogenates of heart and aorta were estimated by the levels of generated H2S. The contents of serine and cystathionine were determined by thin-layer chromatography on cellulose, while levels of cysteine - by the reaction with ninhydrin reagent in acidic medium. It has been established that the major substrates for H2S synthesis in the myocardium and aorta of rats are cysteine and thiosulfate anion, whereas homocysteine and cysteine is not an effective source of H2S. Formation of H2S in the cardiovascular system occurs in the reactions of cysteine desulfuration with cystathionine-Y-lyase, cysteine transamination with а-ketoglutarate with the assistance of cysteine transaminase and in the reduction reaction of thiosulfate anion with thiosulfate-dithiol sulfurtransferase. The highest H2S-produced activity is recorded in thi-osulfate-dithiol sulfurtransferase and smaller in cystathionine Y-lyase and cysteine transaminase. We have observed reliably significant decrease in H2S production in the reactions catalyzed by cystathionine Y-lyase, cysteine transaminase and thiosulfate-dithiol sulfurtransferase occurs during the aging in the aorta and myocardium of rats and is accompanied by H2S deficiency in the blood serum.
9
