CC BY
18
УДК 619:602:611.018.3:617.3
Зубов Д.О., к.б.н. ©
ДУ "1нститут генетичногтарегенеративноимедициниНАМН Украши";
Костогриз О.А., к.б.н.
ДУ"1нститут траматологпта opmonedii'HAMH Украши";
Солодуха О.В., астрантка кафедрах1рурги ¿м. проф. I.O. Поваженка; Журба В. I., астрантка кафедра ф1зюлогп, патоф1зюлоги та ¿мунологп тварин
ВИГОТОВЛЕННЯ ТРИВИМ1РНОГО МАТРИКСУ НА OCHOBI АГАРОЗНОГО Г1ДРОГЕЛЮ ДЛЯ КУЛЬТИВОВАНИХ ХОНДРОЦИТ1В
У cmammi розглядаютъся бютехнолог1чш аспекты кулътивування хондроцит1в собаки, вивчаетъся ефективтстъ кулътивування цъого клтинного типу, основш параметри юнетики клтин. Описуетъсяметодика виготовлення тривим1рного клтинного носгя - 2%-го агарозного гелю, зааяного кулътивованими хондроцитами для цыеи клтинног mepanii дефектгв суглобового хрящау dowidi.
Ключое1 слова: собаки, хондроцити, mpueuMipnuu г1дрогелъ
Вступ. У наш час у ветеринарний та гуманнш медицин! ведеться активний пошук оптимальних метод1в лжування травматолопчних и дегенеративних пошкоджень палшового хряща колшного суглоба. Вщомо, що хрящова тканина мае знижену здатшсть до регенераци. В нш вщсутш кровоносн1 та л1мфатичш судини, нерви, а живлення здшснюеться дифузно за рахунок синов1ально! рщини. Тому тшьки при периферичних пошкодженнях в дшянках, прилеглих до синов1ально! оболонки, спостер1гають процес г1стотипового вщновлення палшово! хрящово! тканини. При глибоких пошкодженнях, сполучених i3 юстково-мозковим каналом, забезпечуеться м1гращя в дшянку дефекта ММСК (мультипатентш мезанх1мальш стромальш кл1тини) з к1сткового мозку, яю можуть служити кл1тковим джерелом для регенераци. Але найчастше зруйнований палиновий хрящ якщо i вщновлюеться, то з утворенням ф1брозно! (волокнисто!) хрящово! тканини, яка ¿стотно вщр1зняеться арх1тектошкою, бюх1м1чним складом матрикса та мехашчними властивостями.
Нов1тшми пщходами у лжуванш набутих дефект1в хряща е ¿мплантащя шертних замшниюв, обробка лшарськими препаратами чи компонентами матрикса з метою мюцево! стимуляци тканинно! регенераци, аутолопчна пересадка кл1тин чи тканин, чи in vitro виробництво тканини або тканинних екв1валент1в для ¿мплантацп [5].
Першо! кл1тинною технологш, спрямованою на вщновлення ушкоджень суглобового хряща став метод аутолопчно! трансплантаци хондроцит1в (АТХ), що був розроблений в 1994 p. M. Brittberg [11]. Спочатку ця техшка являла
© Зубов Д.О., Костогриз О.А., Солодуха О.В., Журба В. I., 2012
92
собою ¿мплантацш cycnemii' культивованих аутолопчних хондроциив пщ перюстальну заплатку. На сьогодш ця методика набула подальшого розвитку з генеращею бютехнолопчних продукт1в другого поколшня, що представлен! тривим1рними конструкщями на ochobí khíthh та компонент матриксу.
Тим не менш, основними проблемними питаниями, що виникають при розробщ устшних технологш створення хрящового екв1валенту ex vivo, на нашу думку, е наступш.
1. Джерела клпин: як1 саме кл1тини е найбшьш ефективними в аспект! хондрогенезу in situ i реституци хрящових дефект1в тканиною, близько! до нативного хряща? У якост1 таких кл1тин нараз1 використовують хондроцити (не тшьки одержан! з суглобового палшового, але й з еластичного хряща pÍ3HOi локал1заци), а також мультипотентш мезенх1мальш стромальш кл1тини (ММСК) юсткового мозку та жирово! тканини. При вибор1 вар1анта кл1тин для трансплантаци в хрящовий дефект, безсумшвно, потр1бно керуватися доступшстю кл1тинного матер1алу в кожному клмчному випадку. Наприклад, якщо мова йде про оперативне втручання на колшному cyrao6i, то слщ забрати паралельно Í3 втручанням бюптат хрящово! тканини з оточуючо! до дефекту або ж неушкоджено! ненавантажувано! зони суглобово! поверхш для одержання культури хондроцит1в. Вочевидь, що оптимальними кл1тинами для замщення хрящових дефект1в е культивоваш хондроцити, отримаш з само! хрящово! тканини, котр! певний перюд субкультивування знаходяться в анабол1чному стан! до настання феномену дедиференцшвання хондроцит1в у культур! [6], та котр i в норм! CKopime реал1зують in vivo cboi пстогенетичш потенцп до хондрогенезу.
2. Яш кл1тини доцшьно пересаджувати в хрящовий дефект? Неком1товаш ММСК (з припущенням про те, що тканинне мжрооточення в дщянщ трансплантаци спрямуе пересаджеш кл1тини до хондрогенезу), або комковат кл1тини, що отримали сигнал до диференцшвання в хондроцити в культур! або в процес1 виготовлення ноЫя, що мютить, кр1м кл1тин, вщом1 фактори хондрогенезу.
3. Проблема штеграци трансплантата з поверхнею дефекту хряща, тобто яким чином тривим1рний Hociñ Í3 кл1тинами може бути штегрований до раньового ложа по всш поверхш дефекту. Також необхщно визначитися з тим, що доцшьшше пересаджувати: Hociñ Í3 кл1тинами Í3 заздалегщь змодельованою формою дефекту (виготовлення ноЫя за шаблоном або формою дефекту безпосередньо в ход1 операци), або ж найбшьш ефективною виявиться самооргашзащя трансплантата безпосередньо в дефект! при з'еднанш компонент нос1я i кл1тин - це так зваш хондрошдуктивш «smart scaffolds».
У зв'язку 3Í згаданими аспектами, нами вщпрацьована технолопя експанси хондроцит1в та створення хрящового екв1валенту на ochobí агарозного гщрогелю для подальшого закриття поверхневих та повношарових дефект1в суглобового хряща в експеримент1 в собаки. На даному eTani в якост1 джерела кл1тин для культивування та подальшо! Tepanii' нами обран1 хондроцити вушно! раковини. В запропонованш стагп висв1тлено деяш бютехнолопчш аспекти
93
культивування даного типу кл1тин та виготовлення тривим1рного ноЫя для них на ochobî бюсумкного, термореверсивного та хондрокондуктивного агарозного гщрогеля, котрий нараз1 широко використовуеться в сучаснх дослщженнях з вивчення бюлоги хрящово! тканини [4].
Матер1али та методи.
Культуры хондроцит1в
1золювання хондроципв (ХЦ) з хряща вушно! раковини собаки (n = 4, Mm = 3,0 г) проводили за загально прийнятими методиками [2, 7, 9, 10]. Тобто, для ферментативного дезагрегування тканинного бюптату використовували 0,2% розчин колагенази IA (Sigma, США). Отримаш кл1тинш cycnemiï вишвали в культуральш флакони (Corning, США) площею 25 см2 з щшьшстю nociBy 4 х 104/см2.
Культивування ХЦ проводили в cyMimi поживного середовища DMEM/F12, 1:1, (Sigma, США) з додаванням 10% ембрюнально! телячо! сироватки (Sigma, США), 2 мМ L-глютамшу (Sigma, США) та по 100 МО/мл пенщил1ну та 100 мкг/мл стрептомщину (Sigma, США), в С02-шкубатор1 (Jouan, Франщя) при 370С i 5% атмосфер! С02 та насичуюч1й вологостг Зм1на середовища проводилася кожну 3-4 добу культивування.
Пасирування, або субкультивування, проводилося з використанням cyMimi розчишв 0,05% трипсину/0,02% ЕДТА (EioTecTMefl, Украша) у PBS, рН 7,4 (Sigma, США). Максимальний кoeфiцieнт пасирування становив 1:6.
КУО-аналгз (колошеутворююч1 одинищ)
Процес кoлoнieyтвopeння дocлiджyвaнoгo типу клiтин вивчали шляхом nociBy 100 клiтин на чашку neTpi (0100 мм, Costar, США) в ростовому cepeдoвищi, що Mi стило DMEM/F12, 1:1, (Sigma, США) з додаванням 10% eмбpioнaльнoï телячо! сироватки (Sigma, США), 2 мМ L-глютaмiнy (Sigma, США) та по 100 МО/мл пенщил^ та 100 мкг/мл стрептомщину (Sigma, США). Культивували в C02-iHKy6aTopi (Jouan, Фpaнцiя) при 37оС i 5% aтмocфepi С02 та насичуючий вoлoгocтi протягом 14 д1б [3, 10]. Haдaлi колони фарбували кpиcтaлiчним фioлeтoвим та пщраховували. Eфeктивнicть nociBy (PE, plate efficiency, %) визначали за формулою:
PE, % = Пколонш / пкл;тин х 100 (1),
де пколошй - кщькють сформованих koлoнiй; п^тин - кiлькictь пociяhиx
клiтин.
Юнетикаросту клтинних популяцт кулътивованих хондроцитгв
Число клтинних подвоень в пoпyляцiï (n) та час подвоення клiтиннoï популяци (t) за умов, що остання знаходиться у фaзi лoгapифмiчнoгo росту в межах стандартно! криво! росту кл^инно! популяци, визначали за загально-прийнятими формулами [3]:
n = С lg (Xk / X0) (2),
t = T / С lg (Xk / X0) (3),
де С - константа переведения логарифму в десятинний логарифм для кл^ин, що культивуються; X0 - число поаяних клiтин; Xk - число нарощених клiтин; Т - тривалкть лoгapифмiчнoï фази росту культури клiтин.
94
Виготовлення агарозного ггдрогелю з кулътивованими клтинами
Для приготування 2% агарозного гщрогелю з культивованими хондроцитами використовували агарозу з показниками míu;hoctí для 1% гелю >1200 г/см2 та точкою гелеутворення 36±1,5°С (Sigma, США) та поживне середовище DMEM-HG (з 4,5 г/л глюкози, РАА, Шмеччина). Пол1меризований агарозний гщрогель виготовляли в ямках 24-ямково! плашки (Corning, США) з концентращею 107 кл1тин/мл/лунку [1]. 1золяцш хондроцит1в з гелю проводили 0,02% розчином ЕДТА (хелатуюча речовина) та перев1ряли на життездатшсть методом фарбування 0,4% розчином трипанового синього.
В1зуал1зац1я клтин та культур з використанням Memodie iнвертованог
MÍKpOCKOnil
В1зуал1зацш (методами швертовано! мжроскопп в cbítoí, що проходить, i фазово-контрастно! MÍKpOCKOnil) i фотодокументування культур кл1тин проводили за допомогою швертованого мжроскопа Axiovert 40C (Zeiss, Шмеччина), програми з обробки зображення AxioVision Rel. 4.8 (Zeiss, Шмеччина) i камери PowerShot G10 (Canon, США). Кл1тинш препарати i куль тури попередньо фарбували кристал1чним фюлетовим та мжроскопувалися при 100-разовому збшьшенш.
Методы статистичног обробки резулътат1в Кшьккш характеристики випадкових величин представлен! у вигляд1 середшх значень (M) та стандартних помилок середшх значень (±m). Значимють розб1жностей показник1в оцшювалася за t-KpnTepieM Стьюдента. Апробовано та оптим1зовано методику ¿золяцп кл1тин - хондроципв з хряща вушно! раковини собаки за допомогою ферментативного методу. 1золящя колагеназою IA виявилося ефективною при концентрацп 0,2% та часу ферментацп 60 хв. Одержан! культури ХЦ субкультивували до п'ятого пасажу, що було достатньо для одержання терапевтично значимо! кшькост1 кл1тин (0,5-1 х 108 протягом 3-4-х пасаж1в), та були збережеш в рщкому азот1. Культивування проводилося за стандартних умов Í3 застосуванням ростового середовища, що мютило DMEM/F12 та 10% ембрюнально! телячо! сироватки. Максимальний коефщент пасирування, за умови одержання активно прол1феруючих культур, становив 1:6.
У середньому, з 3,0 г хряща видшялося 4,6 х 106 хондроцит1в. Первинно видшеш кл1тини теля адгезп до культур ал ьного флакону починали прол1ферувати з 2-1 доби. Морфолопчно хондроцити в первиннш культур! мали вигляд розшарованих округлих еттелощних кл1тин з повшьною прол1феращею, котр! формували кл1тинш кластери (рис. 1 а). Неконфлуентш культури цього кл1тинного типу складалися з невелико! кшькосп кл1тинних кластер1в-колонш, витягнутих в довжину, або трьох-багатогранних, що мютили р1зну кшьюсть кл1тин (до 30), деяю кластери зливалися. Таку притаманну культивованим хондроцитам морфологш кл1тини збер1гали протягом п'ятьох пасаж1в (рис. 1 б, в) та не змшювали на ф1бробласто!дну - ознака, характерна для хондроцит1в в дедиференцшованому сташ.
95
Рисунок 1 - Культура хондроцит1в з хряща вушноУ раковини собаки: а -
первинна неконфлуентна; б - конфлуентна, перший пасаж; в - конфлуентна, п'ятий пасаж; зб. х100; фарб. кристал1чним фюлетовим.
КУО-анал\з. Формування колонш на чашках Петр1 при низьких поЫвних концентрациях кл1тин (напр., 100 кл1 тин/чашку Петр1), або, шшими словами, визначення ефективност1 пос1ву (РЕ, %), е переважним методом анал1зу прол1фераци кл1тин у культур! та !хнього виживання. Такий пщхщ демонструе р1зницю в швидкост1 росту в межах популяци та виявляе р1зницю в змш1 швидкост1 росту (розм1р колони) та виживання кл1тин (число колонш). При пос1в1 кл1тинно! суспензи по чашках Петр1 в низькш концентраци кл1тини зростають як дискретш колони. Число цих колонш може бути використано для вщображення ефективност1 культивування обраного типу кл1тин [3].
Результати дослщження. Нами було дослщжено колошеутворюючий потенщал ХЦ на 2-му пасаж1 методом КУО-анал1зу згщно з протоколом О. Ргоскор для стромальних кл1тин [10]: так, на 100 кл1тин у середньому за 14 д1б утворювалося 49,4±3,5 колонш, п=5, а ефектившсть поЫву хондроцит1в складала близько 49% (табл. 1).
96
Таблиця 1
Кшьккть утворених колонш та ефектившсть nocißy хондроцит1в на 100 _ кл1тин на 14-ту добу культивування, 2-й пасаж_
ХЦ, число колонш
1 59,0
2 40,0
3 49,0
4 44,0
5 55,0
M 49,4
±m 3,5
РЕ, % 49
n 5
Юнетика росту культивованих хондроцит\в. Найважлившими параметрами оцшки ефективност! нарощування кл1тин in vitro е таю параметри кшетики росту, як число кл1тинних подвоень в популяцп та час подвоення кл1тинно1 популяцп за умов, що остання знаходиться в фаз! логарифм1чного росту в межах стандартно! криво! росту кл1тинно! популяцп. Пщ термшом «picT кл!тин» маеться на уваз1 зб1льшення числа кл1тин [3].
Як можна бачити з розрахованих даних у табл. 2, число кл1тинних подвоень, або кшькють випадк1в репл1кац1! (n), в популящях ХЦ протягом чотирьох пасаж1в складало в середньому 3,2. Час подвоення кл1тинно! популяц1! ХЦ - це час, протягом котрого в1дбуваеться подвоення чисельност1 або маси популяц1! (t), складав в середньому 54 год.
Таблиця 2
Параметри кшетики росту кштинних популяц1й хондроцит1в (фаза
логарифм1чного росту | протягом 4-х пасаж1в
X0, х105 Xk, х105 T, год. n t, год.
ХЦ, 25 см2 n=4 0,92 8,6 *174 ± 15,1 3,2 54,0
Виготовлення агарозного ггдрогелю як тривимгрного носгя для культивованих хондроцит\в. Приготований в асептичних умовах 4% р1дкий розчин агарози з температурою 37°С у поживному середовищ1 DMEM-HG швидко та ретельно зм1шували 1:1 з cycnerniero культивованих хондроцит1в 2-го пасажу та розливали по лунках 24-лунково! плашки до пол1меризацп. В результат! одержували пол!меризований за к!мнатно! температури 2% агарозний г!дрогель з концентрац!ею 107 кл!тин/мл/лунку (рис. 2). Пол!меризований гель з кл!тинами в лунках заливали по 1 мл поживного середовища DMEM-HG та культивували в C02-iHKy6aTopi за 37°С протягом 14-ти д1б з повною зм!ною ростового середовища 2 рази на тиждень. Надал! кл!тини ¿золювали з агарозного гелю за допомогою 0,02% розчину ЕДТА (розчину Версену) та оц!нювали !хню життездатн!сть методом фарбування трипановим сишм, котра складала 93,7%.
97
Рисунок 2 - Агарозний гвдрогель з культивованими хондроцитами (107
кштин/мл/лунку).
Висновки.
1. Вщпрацьовано методику ферментативно! ¿золяци хондроцит1в хряща вушио! раковиии собаки за доиомогою 0,2% розчииу колагеиази I типу, що дало змогу, з 1 г тканини одержати в середньому 1,5 х 106 кл1тин.
2. Показано можливють культивування хондроцит1в протягом п'ятьох пасаж1в, що було достатньо для одержання терапевтично значимо! кшькост1 кл1тин (0,5-1 х 108 протягом 3-4-хпасаж1в).
3. Притаманну культивованим хондроцитам морфологш кл1тини збер1гали протягом п'ятьох пасаж1в та не змшювали на ф1бробласто!дну, котра е ознакою культивованих хондроцит1в у недиференцшованому сташ.
4. Ефектившсть поЫву хондроцит1в на другому пасаж1, виявлена в ход1 КУО-анал1зу, склала 49%.
5. При вивченш показниюв юнетики росту кл1тинних популяцш хондроцит1в було виявлено, що число кл1тинних подвоень протягом чотирьох пасаж1в складало в середньому 3,2, а час подвоення кл1тинно! популяци хондроцит1в складав в середньому 54 години.
6. Вщпрацьовано методику виготовлення тривим1рного ноЫя для культивованих хондроцит1в на основ1 2% агарозного гщрогелю, що мютить 107 кл1тин/мл. Життездатшсть кл1тин теля культивування в гел1 протягом 14-ти д1б склала 93,7%.
Л1тература
1. Наш перший досвщ х1рурпчного л1кування посттравматичного дефекту суглобового хряща колшного суглоба аутолопчними хондроцитами / М. Л. Анкш, О. А. Костогриз, В. К. Гринь [та ш.] // Л1топис травматологи та ортопеда. - 2008. - № 1-2. - С. 136-138.
98
