CC BY
33
УДК 577.1:619:615.3
Шемедюк Н.П., астрант, Буцяк В.1., проф. д. с.-г. н ©
Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологт ím. С.З.Гжицького
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ЕКСПРЕС-АНАЛ1ЗУ ХАРАКТЕРУ БЮЛОГ1ЧНО1 ДП РОСЛИННОГО ПРЕПАРАТУ З SOPHORA JAPONICA
Мехатзми, що забезпечують ¡нг1буеання прол1ферацИ клтин, мало доступш для еиечення in vivo. Тому, за зеичай, у таких дослгдженнях еикористоеують культиеуеання клтин за дп дослгджуеаног речоеини. Створено тест-систему для експрес-анал1зу характеру бюлоггчног дИ рослинного препарату з Sophora japonica. Отримано пор1еняльш результати еплиеу б\олог\чно активного комплексу рослинного походження щодо лтш клтин з р1зним р1енем експресИ трансформоеаного фенотипу.
Ключовi слова: клтинт культури, Sophora japonica, бюлоггчно актиет речоеини, прол1ферац1я.
Дослщження шпбування пролiферацi! пухлинних кл^ин - одне з важливих завдань нашо! роботи. Актуальшсть проблеми зростае з розповсюдженням захворювань, спричинених неконтрольованим подшом кл^ин (пухлини). Оцшка пролiферативно! активност необхщна не тшьки для бюлопчно! характеристики пухлин, але i для прогнозування переб^у хвороби. Часто прогностичш фактори е вирiшальними для юнцевого результату захворювання i важливiшими за терапевтичний ефект [1].
Метою роботи е розробка ефективно! та доступно! у застосуванш бютехнолопчно! моделi для з'ясування порiвняльно! оцiнки впливу екстракту Sophora japonica щодо лiнiй кл^ин з рiзним рiвнем експреси трансформованого фенотипу.
Кл^инна лiнiя BALB 3Т3 отримана при тривалш експлантацп клiтин ембрюшв мишей, рiст фiбробластоподiбного типу, псевдонормальна. У дослiдженнях використовуеться як аналог нормально! кл^ини [2]. Грiнбергом в 1978 рощ була доведена можливють екстраполяци даних, отриманих in vitro на культивованих фiбробластах, на умови in vivo. Яскравою вiдмiннiстю неопластичних клiтин е «асощальний» тип поведшки, зв'язаний у першу чергу з порушенням нормальних морфогенетичних реакцiй - втрата контактного гальмування, поява здатност до пролiферацi! незалежно вiд прикршлення до субстрату, змiна адгезiйних взаемодш, форми, рухливостi клiтин [3]. MDA-MB-231 - кл^ини аденокарциноми молочно! залози людини, отриманi у 1973 р. лжарем Р. Calleau вщ 51 рiчно! жiнки. Клiтини веретеноподiбноl форми, епiтелiоцити. 4Т1 - кл^ини пухлини молочно! залози мишi. Кл^инна лiнiя
© Шемедюк Н.П., Буцяк В.1., 2010
184
отримана Б. Пуласю Í3 пухлини молочно1 залози (аденокарциноми) мишi, епiтелiального походження [4].
Лжарсью властивостi софори японсько1 (Sophora japónica): бактерициднi - зумовленi наявшстю фiтонцидiв, сесквiтерпенiв, тощо [5] ; протипухлинш -алкалощом софокаргин, лектинами насiння [6]. У квiтках софори виявлено 17,5% рутину. За А.А. Гроссгеймом у плодах софори у перюд ïx дозрiвання мiститься 8 флавоновдв: рутин, кемпферол-3-софорозид, кверцетин-3-рутинозид, гешстеш-2-софоробюзид, тощо [7].
Матер1али i методи
Для досягнення поставлено1 мети виршували завдання: оцiнити цитотоксичну/цитостатичну дш етанольного екстракту. Для приготування екстракту софори японсько1 (Sophora japónica), використано етиловий спирт. Використовували екстракт у дозах 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл середовища через 24 год. тсля висiву кл^ин. Контролем слугувала iнтактна культура кл^ин. Також до уваги брались контролi з внесенням спирту (70%) 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл середовища, контроль з внесенням фiзiологiчного розчину - 10 мкл/мл середовища.
Кл^ини лшш MDA-MB-231 та 4Т1 були отримаш з Кл^инного банку лiнiй клiтин Вроцлавського природничого унiверситету (Польща). Клiтини лши BALB 3T3 отриманi з Клтинного банку nímü тканин людини i тварин 1нституту експериментально1 патологи, онкологи та радюбюлоги iм. P.G. Кавецького НАН Украши (Кшв).
Клiтини культивували у флаконах (20 см2) у середовищi Дульбекко в модифiкацiï 1гла (DMEM, Sigma Chem. Co., США) з додаванням 10% сироватки кровi плодiв великоï рогатоï худоби (ВРХ, Sigma Chem. Co., США) та 500 одиниць/мл гентамщину (Sigma, США) при 37оС в атмосферi 5% СО2 при 100% вологостi. Переав клiтин здiйснювали у спiввiдношеннi 1 : 3 - 1 : 5 через кожш
2 - 3 дш. Для до^ду кл^ини висiвали у (96- лунковi) планшети (Sarstedt, США) в кiлькостi 5х105 клiтин на лунку. Результати впливу екстракив на культуру клiтин ощнювали на 24, 48, 72 годину та на 14 день культивування. Для ощнки життeздатностi клiтин проводили забарвлення трипановим сишм (ТС). За цих умов живi клiтини вiдрiзнялися вiд мертвих (некротичних) тим, що непоглинали барвник.
Одне з завдань - дослщити вплив екстрактiв з Sophora japonica на прояв апоптозу. Апоптичнi кл^ини виявляли за характерною фрагментацieю ДНК, яку видшяли i роздiляли методом електрофорезу в 1% агарозному гелi (Кудрявец и др., 1996).
Проводилось дослщження вмiсту бiологiчно активних речовин у екстракт
3 Sophora japonica методом мас-спектрометри.
Дослiд проводився у трьох паралелях. Результати опрацьовано за критерieм t-Ст'юдента.
Результати та обговорення
За умов мацераци етиловим спиртом у отриманий екстракт переходять глжозиди, флавонощи, сапонiни, частково алкалоïди.
185
3a дaними лiтеpaтypи [5, 6, 7] лiкapськa poслинa, яку викopистaнo для oдеpжaння екстpaктy м1СТИТЬ знaчнy К1ЛЬК1СТЬ бioлoгiчнo aктивних pечoвин, яким влaстивa aнтиoксидaнтнa д1я. 3гiднo з сyчaсними yявленнями, вiльнopaдикaльнi пpoцеси i pегyляцiя ïx piвня вiдiгpaють суттеву poль зa yмoв кaнцеpoгенезy i злoякiснoгo poстy.
3a дaними мaс-спектpoметpiï в екстpaктi сoфopи япoнськoï iдентифiкoвaнo
п1ки нaйближчиx зa стpyктypoю дo пеpелiчениx у тaбл.1 pечoвин.
Тaблиця 1.
Бiологiчно активм речовини щентифжоваш у екстракт з Sophora japónica
Iдентифlкoвaнa pечoвинa 4ac lдентифlкaцlï (хв) Плoщa тку (%) Имoвipнiсть ^m^ka^i (%)
2-фypaнметaнoл 2,735 0,803 74
сopбiтoл 11,719 1,33 64
глlцеpoл 4,019 2,439 78
мaнlтoл 11,719 1,33 86
ксилlтoл 11,672 0,81 59
гептaнoвa кислoтa 9,596 0,485 50
2-гlдpoкси-2-циклoпентен-1-oн 3,579 0,957 80
пpoпlлвaлеpaт 8,128 0,78 32
етилфopмlaт 8,336 0,3 38
2,3-дигiдpoксипpoпaнaль 7,296 1,02 32
дигiдpoксиaцетoн 3,199 12,981 78
ß-метил-Э-pибoпlpaнoзид 10,548 4,84 43
а-метил-D-глюкoпlpaнoзид 10,150 1,4 45
а-метил-L-гaлaктoпlpaнoзид 10,150 1,4 72
D-мaннoгептyлoзa 9,596 0,485 43
а- D-глюкoпlpaнoзa 10,822 1,07 80
D-ra^epo-D-гaлaктoгептoзa 10,822 1,07 80
D-ксилyлoзa 10,738 2,00 27
веpнiн 9,091 0,60 64
тloфен 11,041 22,25 50
цитoзин 9,091 0,60 53
кapвaнlл 6,565 0,267 42
тlaзoл 6,873 0,89 74
гaмa-aмlнoбyтиpoлaктaм 6,873 0,89 64
лaктoн G 8,841 1,005 64
D-pибoнoлaктoн 6,873 0,89 56
2,3^rnwpo-3,5- дигiдpoкси-6-метил-4Н- пlpaн-4-oн 6,135 13,364 70
np^yraicra сесквiтеpпенoвиx лaктoнiв, гохщних пippoлiдинy, pечoвин,
щo вxoдять дo склгду ефipниx oлiй мoже пiдтвеpджyвaти пpoтипyxлиннy здaтнiсть екстpaктy сoфopи япoнськoï. У екстpaктi сoфopи япoнськoï iдентифiкoвнo pечoвини aнтиoксидaнти, aнтисептики, вaзoдилятopи, oсмoтичнi дiypетики, кapвaнiл poзслaблюe глaдкi м'язи œpu^. Кpiм тoгo, aльдегiди вoлoдiють пpoтизaпaльними, зaспoкiйливими, седaтивними i aнтивipyсними
186
влaстивостями, спирти - aнтисептичними i противфусними влaстивостями, феноли, терпени - бaктерицидними. Кетони - це клaс х1м1чних сполук, як1 волод1ють рaнозaгоювaльними влaстивостями 1 полегшyють вид1лення слизу. Сескв1терпени волод1ють протизaпaльними, седaтивними 1 против1русними влaстивостями, a тaкож проявляють бaктерlостaтичний 1 1муностимулюючий ефект. Ефlрaм влaстивa протигрибковa д1ю. Лaктони - це грyпa склaдних еф1р1в, що мaють додaткове вуглецеве к1льце. Вони нaлежaть до таймогутн1ших протизaпaльних сполук.
Створюеться певний комплекс сполук, у якому 1снують aнтaгонlстичнl тa синерг1стичн1 взaeмодlï. Внaслlдок втрaти одного з компонент1в, д1юч1 речовини можуть нaбyти в1дм1нних, можливо, небaжaних влaстивостей.
Проведен1 досл1дження in vitro свiдчaть про цитостaтичнy д1ю екстрaктy софори японсько1' щодо пухлинних кл1тин. Негaтивнa д1я екстрaктy софори японськох' хaрaктеризyeться знaчним зменшенням к1лькост1 кл1тин MDA-MB-231, 4Т1 в1дносно контрольних зрaзкiв зa дlï дози l0 мкл/мл середовищa. Тaк, нa 24 год. кшьюсть кл1тин MDA-MB-231 зa дlï препaрaтy софори японськоï ЗЗЗЗ±8ЗЗ (вс1 трипaннегaтивнl) нa l мл середовищa. Прир1ст к1лькост1 кл1тин MDA-MB-231, 4Т1 зa дlï препaрaтy софори япон^^ е невисоким i зaлишaeться мaйже незм1нним упродовж 72 год. (рис. l, 2, З). Некротичш процеси не спостерlгaються. 1стотне lнгlбyвaння пролlферaтивноï aктивностl BALB 3T3 зa дlï препaрaтy софори японсько1, та 24 год. к1льк1сть трипaннегaтивних кл1тин BALB 3T3 - 2500±l040 та l мл середовищa в1дпов1дно, та 72 добу - 5000±144З та 1 мл середовищa, що у З,З рaзи менше к1лькост1 кл1тин у контрол1 (рис. 1, 2, З).
16000 14000 ' 12000 ' 10000 8000 м/л6000 4000 2000 0
0,1 м!^ 1м1/Ш1 10М!/Ш1 0,^1^1] 1М1/Ш1 10М1/Ш1 0,11^1^11 1М1/Ш1 MDA-MB-231 BALB 3T Sophora japonica С мкл/мл
□ - тpипаннeгативнi клiтини
■ 18000 16000 : 14000 • 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
-
-
_ _
0,lNl/mI 1м1/ш! 10м1/га1 4Т1 0,lNl/mI ^l/ml 10^/ml MDA-MB-231 0,lNl/mI 1^/ml BALB 3T
□ - трипаннегативж
Рис. 1. Кшьккть сepeдовищi на культивування
за
кштин у 7l год. дйТ на
Рис. 1. Кшьккть кл1тин у сepeдовищi на 71 год. культивування за дн на дослiджУвaнi популяц11 eкстpaкту дослвджуваш популяцн eтилового SoPhora japonica спиpту (70%)
187
■ 18000 16000 : 14000 ■ 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0
control control Н2О
control Н2О
□ -трипаннегативн кптини
Рис. 3. Кллькчсть клггин штактних культур на 72 год. культивування
Екстракт софори японсько!,
1 2 3 4 Phc. 4. Роздiлення фрагмент1в ядерноУ ДНК кштин лшп 4Т1. 1 - Sophora japónica 2 - proapoptotik control
3 - pronecrotik control 4 - alive control
Роздшення проводили у 1%- му агарозному гелi з додаванням бромiду етндго.
за дози 1 мкл/мл середовища
характеризуеться антипролiферативним впливом (кiлькiсть кл^ин 3333±833 на 1 мл середовища на 72 год.) щодо MDA-MB-231, деструктивш змiни клiтин вiдсутнi, до 14 доби небагаточисельна популящя за ди софори японсько! гине. 1стотно зменшуе пролiферативну здатнiсть клiтин 4Т1 препарат софори японсько!: на 48 год. кшькють кл^ин 5833±833 на 1 мл середовища, що вщповщае такому у контрольних зразках, та з 72 год. кл^инна лмя 4Т1 за дi! дано! дози екстракту софори японсько! поступово вщмирае, на 168 год. культивування кшьюсть клiтин у 12,0 разiв менша порiвняно з такою у контролi (рис. 1, 2, 3), трипанпозитивних клiтин не виявлено. Пролiферативна актившсть та життездатнiсть клiтин BALB 3T3 за ди дози препарату софори японсько! 1 мкл/мл середовища подiбна до тако! у контролях.
За ди дози 0,1 мкл/мл середовища екстракту софори японсько! спостер^аемо низький прирют кiлькостi клiтин у культурi MDA-MB-231 порiвняно з контролем. На 72 год. культивування у цих зразках н^чуемо на 67% кл^ин менше порiвняно з кiлькiстю кл^ин у контролi. Деструктивних змiн кл^ин не спостерiгаемо. За дi! екстракту у дозi 0,1 мкл/мл середовища негативного впливу щодо кл^ин 4Т1, BALB 3T3 не дослщжено.
Таким чином, в умовах in vitro показано здатшсть екстракту софори японсько! гальмувати пролiферативну активнiсть пухлинних кл^ин. Вплив препарату з софори японсько! е цитостатичного характеру за даних умов. Найбшьш чутливою до ди дослiджуваного препарату е лiнiя кл^ин MDA-MB-231, менш чутливою - BALB 3T3. Це розкривае новi можливост щодо застосування софори японсько! як антиоксидантного, протипухлинного засобу з вибiрковiстю дi!.
188
Апоптичш кл^ини за ди дослщжуваних бюлопчно АКТИВНИХ речовин виявляли за характерною фрагментацieю ДНК, яку видшяли i роздiляли методом електрофорезу в 1% агарозному гелi (рис. 4).
Результати електрофореграми свщчать про виявлення фрагментаци ДНК, а отже, загибель за мехашзмом апоптозу кл^ин лши 4Т1, що культивувались у присутностi Sophora japónica. При цьому значна частина ДНК знаходиться у низькомолекулярнш формi. У контролi (культивування без екстрактiв) ДНК нефрагментована.
Мехашзми протипухлинно! ди флавоновдв включають модуляцiю сигнальних шляхiв, залучених до регуляци пролiферацil пухлинних клiтин, ír^^to апоптозу або диференцiювання клiтин, а також шпбування ангiогенезу та подолання лшарсько! резистентностi. За рахунок юнування семiхiнонних, хiнонних форм, полiфенольнi сполуки (флавонощи) здатнi нейтралiзувати вiльнi радикали, переривати ланцюг реакцiй 1'х утворення у пухлиннш клiтинi, тим самим пригшчуючи процеси росту i розмноження. Також вони блокують тканиннi дихальш ферменти (особливо тих, якi мютять тiоловi групи), вступаючи у вщносно мiцний зв'язок з центрами ферменив. Алкалощи дiють як нуклеофiльний та електрофшьний агент одночасно, здатнi порушувати синтез АТФ у мiтохондрiях завдяки нейтралiзуванню негативних зарядiв зовшшньо! сторони мембран м^охондрш, що виникають при 1'х енерпзаци, модифiкувати тiоловi групи оргашчних сполук завдяки реакци нуклеофшьного замiщення при взаемоди тiолових груп оргашчних речовин з iмiнною групою. Алкалощи - особлива група комплексоутворюючих сполук -мiтознi отрути. Вони призупиняють подiл клiтин шляхом руйнування мiтотичного веретена. За механiзмом електрофшьних взаeмодiй дiють сесквiтерпеновi лактони, сапонши [8, 9, 10, 11].
Висновок
1.Екстракт з Sophora japónica спричиняе iнгiбування росту пухлинних клiтин, але не виявляе пошкоджуючо! ди на рют i життездатнiсть даморталiзованих фiбробластiв BALB 3T3 за дози 0,1-1 мкл/мл середовища, якi вiдiбрано для дослщження як прототип нормальних кл^ин. Таким чином, створений тандем (пухлиш клiтини - клiтини з низьким рiвнем експреси трансформованого фенотипу) дае можливють дослiдити, виявити вибiрковiсть ди бiологiчно активних речовин щодо кл^ин з рiзним рiвнем експреси трансформованого фенотипу.
2.Дослщжуваний екстракт володiе цитостатичною, проапоптичною актившстю in vitro щодо лiнiй кл^ин MDA-MB-231, 4Т1. Результат обумовлений властивостями екстракту софори японсько!, роллю бюлопчно активних речовин, що входять до складу препарату, яку вони здшснюють у метаболiзмi кл^ин.
Л1тература
1.Пожарисский К.М., Леенман Е.Е. // Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний // Арх. пат. - 2000, - № 5, - С. 3-11.
189
2.Earle W.R. Cell L 929 // J. Nat. Cancer Inst. - 1943. - Vol.4. - P.165
3.Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. 1. Сигнальные молекулы, вызывающие размножение и гибель клеток. // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - №4. - С. 17 - 22.
4.Pulaski BA, et al. Cooperativity of Staphylococcal aureus enterotoxin B superantigen, major histocompatibility complex class II, and CD80 for immunotherapy of advanced spontaneous metastases in a clinically relevant postoperative mouse breast cancer model // Cancer Res. - 2000. - Vol.60. - P.2710-2715.
5.Сашова Д. Д. Дослщження i комплексне використання софори японсько!: Автореф. Дис.. ..канд. техшчних н. 15.00.01- технолопя лтв. Харюв
- 1996.
6.Антонюк В.О. Лектини та !х сировинш джерела. - Львiв: ПП. «Кварт»,
- 2005. - 554с.
7.Лжарсью рослини / тд. ред. Гродзинського А.М. [Енциклопедичний довщник] - Ки!в: в-тво «Укра!нська енциклопедiя» iм. М.П. Бажана, Укра!нський виробничо-комерцiйний центр «Олiмп» - 1992. - 543 с.
8.Рибалко К.С. Природные сесквитерпеновые лактоны. - М.: «Медицина», 1978. - 320с.
9.Горяев М.И. Растения, обладающие противоопухлевой активностью/ Горяев М.И., Шарикова Ф.С. - Алма-Ата: Наука, 1983. - 174с.
10. Балицкий К.П. Растительные растения и рак. / Балицкий К.П., Воронцова А.Л. - Киев: Наукова думка, 1982. - 376с.
11. Барабой В. А. Растительные фенолы и здоровье человека / Вилен Абрамович Барабой. - М.: Наука, 1984. - 160с.
Summary
p.-g. st. N.Shemediuk, prof. V.I. Butsyak TEST SYSTEM FOR EXPRESS-ANALYSIS OF THE BIOLOGICAL EFFECT HERBAL MEDICINES WITH SOPHORA JAPONICA
Mechanisms to ensure inhibition of cell proliferation, was available for study in vivo. So, usually, in these studies using cell cultivation for the actions of the studied compounds. A test system for express-analysis of biological nature of plant medicine from Sophora ^ japonica. Try the comparative results of the influence of biologically active herbal complex on the cell lines with different levels of expression of a transformed phenotype.
Key words: cell cultures, Sophora japonica, biologically active substances, proliferation.
Стаття надшшла доредакцИ 3.09.2010
190
