CC BY
34
УДК 616-006:611.69:576.385.2:615.2:615.9
Шемедюк Н.П*., астрант, Ключ1вська О.Ю.** шж. вiддiлу, Буцяк В.1*., проф. д. с.-г. н., докторант J. Polanska*** ®
*Лье1еський нацюнальний утеерситет еетеринарног медицины та бютехнологт ím. С.З.Гжицького **1нститут бюлогп клтин НАН Украгни ***Вроцлаеський природничий утеерситет
ОЦ1НКА РЕЗУЛЬТАТУ ДП Б1ОЛОГ1ЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН ЕКСТРАКТ1В РОСЛИН ЗА ВМ1СТОМ Б1ЛКА У ДОСЛ1ДЖЕННЯХ IN
VITRO
В експериментальтй робот1 е галуз1 бютехнологп еикористоеують «модельт тандеми». Досл1дження на модельних тандемах проеодяться з метою пор1еняльног оцтки еплиеу предмету дослгджень на лшп клтин з р1зним р1енем експресп трансформоеаного фенотипу. Досл1дження модельного тандему: MDA-MB-231, 4Т1 - патолог1чно змтений об'ект, BALB 3T3 - модель максимально наближена до бюлоггчног норми - засегдчили результат ¡стотног е\дм\нност1 еплиеу екстракт1е на пухлиню та псеедонормальш клтинш лшп, що, можлиео, е результатом еибгркоеостг дп бюлоггчно актиених речоеин. Результати оцтюеали за емктом быка у дослгднт проб1.
Ключовi слова: культура клтин, бюлоггчно актиен речоеини, еизначення ем1сту быка.
Мехашзми, що забезпечують пролiферацiю та диференщацш кл^ин при проходженш кл^инного циклу, мало доступш для вивчення на кл^инному рiвнi за умов in vivo. Тому, за звичай, у таких роботах використовують методи проведення дослщжень на культурах лшш клггин [1]. В експериментальнш робой в галузi бютехнологп використовують «моделью тандеми», яю включають два типи кл^инних лшш з максимально низьким та високим рiвнями трансформаций Клтинш лши з максимально низьким рiвнем трансформаци слугують моделлю максимально наближеною до бюлопчно! норми, i 1'хня вiдмiннiсть полягае у вщсутност ефекту старiння культури. Клiтиннi лши з високим рiвнем трансформаци або, залежно вiд умов дослiду, лши пухлинних клiтин використовуються як патолопчно змiнений пiддослiдний об'ект. Дослiдження на модельних тандемах проводяться з метою порiвняльноl оцшки впливу предмету дослщжень на лши кл^ин з рiзним рiвнем експресп' трансформованого фенотипу [2, 3].
Дослщи in vitro з використанням лшш пухлинних кл^ин, лжарських рослин актуальнi, оскiльки дозволяють отримати новi данi в галузi бютехнологп, цитологи, онкофармакологи.
Для вивчення цитотоксично! активностi тестованих речовин за умов in vitro розроблено спрощену схему на культурi клiтин: культивування
® Шемедюк Н.П., Ключ1вська О.Ю., Буцяк В.1., J. Polanska, 2010
372
проводилось три доби без змши поживного середовища. Результати оцшювали за вмктом бшка у дослщнш проб1 При цьому, шпбуюча дiя активних речовин, тестована in vitro, корелювала з результатами дослвдв in vivo [4].
Метою роботи було дослщження динамiки змiн вмкту бiлка та кiлькостi клiтин рiзних типiв у культурах лiнiй MDA-MB-231, 4Т1, BALB 3T3, за умов впливу екстракив рослин.
Матер1али i методи
Дослiдження проводилися на лмях пухлинних клiтин MDA-MB-231 (аденокарцинома молочно! залози людини), 4Т1 (аденокарцинома молочно! залози мишей), BALB 3T3 (деморталiзованi фiбробласти мишей).
Клiтини лши BALB 3T3 отримаш з Клiтинного банку лшш тканин людини i тварин 1нституту експериментально! патологи, онкологи та радюбюлоги iм. P.G. Кавецького НАН Укра!ни (Ки!в). Клiтини лiнiй MDA-MB-231 та 4Т1 любязно надаш завiдувачем кафедри бiохiмп, проф. M. Ugorskim (Природничий унiверситет у Вроцлавi (Польща)).
Клiтини культивували у флаконах (20 см2) у середовищi Дульбекко в модифкаци 1гла (DMEM, Sigma Chem. Co., США) з додаванням 10% сироватки кровi плодiв велико! рогато! худоби (ВРХ, Sigma Chem. Co., США) та 500 одиниць/мл гентамщину (Sigma, США) при 37оС в атмосферi 5% СО2 при 100% вологоси. Пересiв клiтин здшснювали у спiввiдношеннi 1 : 3 - 1 : 5 через кожш 2 - 3 дш.
Для дослщу клiтини висiвали у 96-лунковi планшети (Sarstedt, США) в кшькосп 5х105 клiтин на лунку. Результати впливу екстракив на культуру кл^ин оцiнювали на 72 годину культивування.
Для приготування екстрактiв лжарських рослин: перстачу прямостоячого (Potentilla erecta), софори японсько! (Sophora japónica), аршки гiрсько! (Arnica montana ), використано етиловий спирт. Для порiвняння результат дослiдження ми використали настоянку Echinacea purpurea -аптечний препарат. Використовували нерозведеш екстракти 10 мкл/мл у середовищ^ екстракти у розведеннi 1:10 у кшцевш концентраци 1 мкл/мл у середовищ^ екстракти у розведенш 1:100 у кiнцевiй концентраци 0,1 мкл/мл у середовища Екстракти вносились через 24 год. тсля виаву клiтин.
Контролем слугувала iнтактна культура кл^ин. Також до уваги брались контролi з внесенням спирту (70%) 10 мкл/мл, 1 мкл/мл та 0,1 мкл/мл у середовищ^ контроль з внесенням фiзiологiчного розчину (0,95% NaCl) - 10 мкл/мл у середовища
Вмют бiлка визначали методом гальмування пролiферацi! клiтин з використанням методу SRB [5]. Результати читали за А=540 нм на фотометрi Multiscan RC (Nicon, Японiя).
Дослiд проводився у трьох паралелях. Результати опрацьовано за критерieм t-Ст'юдента (р<0,05 - змши вiрогiдно вiдрiзняються вiд контролю). Результати i обговорення
Фармакологiчна дiя i, вiдповiдно, профiлактичний, терапевтичний ефекти лкарсько! рослинно! сировини зумовленi присутшстю бiологiчно активних речовин (БАР). БАР подшяють на БАР первинного i вторинного
373
обмшу. На даний час особлива увага придшяеться дослщженню широкого спектру ди БАР вторинного обмшу (вторинних метаболтв): фенольних сполук (фенолокислоти, гщроксикоричш кислоти, кумарини, флавонощи, дубильш речовини, тощо), терпенодав (сесквггерпени, ди-, три-, тетратерпени, тощо) i в^аммв ( аскорбiнова кислота, ретинол, тощо) [6]. За умов мацераци етиловим спиртом у отримаш екстракти переходять глкозиди, флавонощи, сапонiни, частково алкалощи. Створюеться певний комплекс сполук, у якому кнують антагонiстичнi та синерпстичш взаемоди. Внаслiдок втрати одного з компонент, дiючi речовини можуть набути небажаних властивостей.
При внесенш до поживного середовища екстрактiв Arnica montana, Potentilla erecta по 10 мкл/мл, значно нижчi значення оптично! густини за А=540 нм порiвняно з контролем спостерiгаемо (рис. 1,2) при визначенш вмiсту бiлка у культурi BALB 3T3, але за концентраци екстрактiв 1 мкл/мл у середовищi (4,197 за ди Potentilla erecta) та 0,1 мкл/мл у середовищi (4,298 за ди Arnica montana, 4,278 за ди Potentilla erecta), щ значення у дано! культури е найвищими порiвняно з популящями MDA-MB-231 (0,177 (р<0,05)- за 1 мкл/мл, 0,458 (р<0,05) - за 0,1 мкл/мл за ди Arnica montana; 0,462 (р<0,05) - за 1 мкл/мл, 1,893 (р<0,05) - 0,1 мкл/мл за ди Potentilla erecta) та 4Т1 (0,269 (р<0,05) - за 1 мкл/мл, 1,804 (р<0,05) - за 0,1 мкл/мл за ди Arnica montana; 2,058 (р<0,05) - за 1 мкл/мл, 3,01- за 0,1 мкл/мл за ди Potentilla erecta), вщповщають таким у контрольних зразках. Даш свщчать про антипролiферативну дш екстрактiв за найвищо! концентраций На вщмшу вiд лiнiй MDA-MB-231, 4Т1, екстракти не мають негативного впливу на кл^ини BALB 3T3 за нижчих концентрацш. За ди екстракив на популяци MDA-MB-231, 4Т1 спостеркаемо зменшення приросту клiтин пропорцiйно тдвищенню дiючих доз. Клiтинна лiнiя MDA-MB-231 найбшьш чутлива до ди екстракив.
—*--4T1 —■--MDA-MB-231 ---а- - - - BALB 3T3
рис. 1. Bmíct б1лка у культурах клггин за екстракту дй' Arnica montana
374
-♦--4T1 —■--MDA-MB-231 ---а----BALB 3T3
рис. 2. Bmíct бшка у культурах клггин за дй' екстракту Potentilla erecta
При дослщженш впливу екстракту Sophora japónica результати незначно вiдрiзняються вщ вiдповiдних у контрольних зразках (рис. 3). Так, антипролiферативний вплив екстракту Sophora japónica значно нижчий, навт за найвищо! дшчо! дози, на вс клiтиннi лши. Досить високий результат вмкту бiлка у пробi з BALB 3T3 (показник оптично! густини за А=540 нм - 3,204) за найвищо! дшчо! дози вщносно iнших клiтинних лiнiй, при зменшенш концентраци дшчо! речовини показник зростае i вiдповiдаe у мммальнш концентраци контролю. Значення оптично! густини за А=540 нм у популящях MDA-MB-231 порiвняно з контролем та BALB 3T3 значно нижчк 1,18; 0,73; 0,896 (р<0,05) за ди найвищо!, середньо!, найнижчо! доз вщповщно. Ця клiтинна лiнiя найбiльш чутлива до ди екстракту Sophora japónica. Дозозалежний характер ди екстракту щодо популяци 4Т1, за максимально! дшчо! концентраци результат досить високий - 1,069 (р<0,05).
-*--4T1 -■--MDA-MB-231 —а----BALB 3T3
рис. 3. Bmíct бшка у культурах клгтин за дй' екстракту Sophora japónica
375
4,5
3,5 3 2,5
1,5 1
0,5
control
NaCl
0,1Ml/ml I 1 Ml/ml I 10Ml/ml control EtOH
-- 4T1
- MDA-MB-231
0,lMl/ml I 1 Ml/ml I 10Ml/ml Echinacea purpurea
к----BALB 3T3
рис. 4. Вмкт бшка у культурах кл1тин за дй екстракту Echinacea purpurea
Для nopiBMHra у дослiдженнях ми використали настоянку Echinacea purpurea - аптечний препарат, який, за даними л^ератури [6] мютить значну кiлькiсть БАР з антиоксидантними властивостями (флавонощи, фенoлкаpбoнoвi кислоти, дубильш речовини, вiтамiни, тощо). Спостеркаемо пoдiбнiсть pезультатiв визначеня вмiсту бшка за ди настоянки Echinacea purpurea (рис. 4) з контрольними зразками та зразками з Sophora japonica (рис. 3).
За даними лггератури [7,8,9,10] ус лшарсью рослини, яю використано для одержання наших екстракив мютять значну кiлькiсть БАР, яким властива антиоксидантна дiя. За нашими деякими фiзикo-хiмiчними дoслiдженнями в одержаних екстрактах найвищий вмiст флавоно1дов у екстракт Sophora japonica (1,611±0,0003% - у перерахунку на рутин, 0,191% - у перерахунку на кверцетин), дубильних речовин (8,92±0,0003% - у перерахунку на танш), ß-каротину (291 мкмоль/л), аскорбшово! кислоти (0,711±0,0003%) - у Potentilla erecta. Вивчення спектpiв поглинання уЫх екстpактiв свщчить, що найбiльший i найчiткiший максимум поглинання знаходиться за А=235 нм у короткохвильовш (до 300 нм) дшянщ ультpафioлетoвoгo спектру та повторюеться у дoвгoхвильoвiй дiлянцi за 328 нм, що свщчить про наявшсть фенольних сполук: гщроксикоричних кислот, кумаришв.
Згiднo з сучасними уявленнями, вшьнорадикальш процеси i pегуляцiя 1'х piвня вiдiгpають суттеву роль за умов канцерогенезу i злoякiснoгo росту [11]. Мехашзми протипухлинно! ди флавоно1дов включають мoдуляцiю сигнальних шляхiв, залучених до регуляци пpoлiфеpацil пухлинних клiтин, шдукцш апоптозу або дифеpенцiювання клiтин, а також шпбування ангioгенезу та подолання лжарсько! pезистентнoстi. Висновки:
1. При культивуванш клiтин у сеpедoвищi з екстрактами рослин, вмкт бiлка у пpoбi залежить вiд дшчо! дози екстракту, виду рослини, кл^инно! лши.
5
4
2
0
376
2. На вщмшу вщ лшш MDA-MB-231, 4Т1, екстракти Sophora japonica, Echinacea purpurea не мають значного антипролiферативного впливу на кл^ини BALB 3T3 за Bcix дшчих доз (показники поглинання оптично! густини при визначенш вмюту бшка у межах 3-4,5, що вщповщае результату контрольних зразкiв). Екстракти Arnica montana, Potentilla erecta за ди нижчих концентрацш щодо лши BALB 3T3 не мають значного антипролiферативного впливу. Можливо, отриманi данi е свiдченням вибiрковоl ди бiологiчно активних речовин дослщжуваних бiологiчних комплексiв.
3. Кл^инна лiнiя MDA-MB-231 найбiльш чутлива до ди екстрактiв.
Л1тература
1. Докшшчш дослiдження ветеринарних лiкарських засобiв. [пiд. ред. 1.Я. Коцюмбаса]. - Львiв: «Трiада». - 2006. - 359с.
2. Weiss A.. Role of T3 surface molecules in human T-cell activation: T3-dependent activation results in an increase in cytoplasmic free calcium. / Weiss A, Imboden J, Shoback D, Stobo J. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Jul;81(13):4169-73
3. Ostrovskaya A.. Proliferative changes in human fibroblast cultures under the influence of a series of drugs. / A. Ostrovskaya, E. T. Lil''in, K.N. Grinberg and S. B. Stefanov. // Pharmaceutical Chemistry Journal - 1978, Vol. 12, No. 11, November, pp. 19-21.
4. Балицкий К.П. Растительные растения и рак. / Балицкий К.П., Воронцова А.Л. - Киев: Наукова думка, 1982. - 376с.
5. Voigt W. Sulforhodamine B assay and chemosensitivity. / Voigt W. // Methods Mol Med. 2005;110:39-48.
6. Солодовшченко Н.М.. Лжарська рослинна сировина та фггопрепарати / Солодовшченко Н.М., Журавльов М.С., Ковальов В.М. // 2-е видання -Харюв: вид-во НФаУ; «МТК-книга». - 2003. - 408с.
7. Briskin D.P. Medicinal plants and phytomedicines. Linking plant biochemistry and physiology to human health. / Briskin D.P. // Plant Physiol, 2000; 124: 507-514.
8. Burda S.. Antioxidant and Antiradical Activities of Flavonoids / Burda S., Oleszek W. // J. Agric. Food Chem. 2001. V. 49. №6. P. 2774-2779.
9. Кобзар А.Я.. Фармакогнозiя в медициш / Кобзар А.Я. - Кшв, - 2004. -280с.
10. Лжарсью рослини: Енцикл. дов. [вщп. ред.. А.М. Гродзинський]. - К.: Голов. ред. УРЕ, 1989. - 544с.
11. Т.Г. Разина, Е.П.. Роль биологически активных веществ лекарственных растений в повышении еффективности цитостатической терапии перевиваемых опухолей / Т.Г. Разина, Е.П. Зуева, Е.Н. Амосова, С.Г. Крилова, К.А. Лопатина. // Бюл. эксп. биол. и мед. - 2005. - Прил. №1. -С. 335-41.
377
Summary
p.-g. st. N.Shemediuk, O.Y. Klyuchivska, prof. V.I. Butsyak, p.-g. st. J. Polanska ESTIMATION OF RESULT OF ACTION BIOLOGICALLY OF ACTIVE SUBSTANCES EXTRACTSOF MEDICINAL PLANTS AFTER CONTENT OF PROTEIN IN RESEARCHES IN VITRO
In the experimental work in the field of biotechnology using "tandem model". Research model tandem: MDA-MB-231, 4T1 - pathologically altered objects, BALB 3T3 - model as close to the biological norm - witnessed the result of substantial difference of influence of extracts on a tumour and pseudonormal cellular lines, that, possibly, is the result of selectivity of action biologically active matters. Results evaluated by protein content in the research sample.
Key words: cell culture, medicinal plants, bioactive substances, determination ofprotein.
Cmammx nadiumna do pedaKuii 14.04.2010
378
