CC BY
32
I
Орипнальы дозддження
Original Researches
Травма
УДК 616.71+616.71-018.3)-001-085.382:612.111.7:57.084 DOI: 10.22141/1608-1706.1.20.2019.158663
Бур'янов О.А.1, ЛябахА.П.3, ДедухН.В.2, Омельченко Т.М.1, Черновол П.А.1, Турчин О.А.3 1Нацональний медичний унiверситет îmbhî О.О. Богомольця, м. Ки'в, Укра1на
2ДУ «Нститут патологи хребта та cy^öiB iменi проф. М.1. Ситенка НАМН Укра1ни», м. Харюв, Укра1на 3ДУ «Нститут травматологи та ортопеди НАМН Укра1ни», м. Ки'в, Укра1на
Застосування автолоично!' плазми, збагачено!' тромбоцитами, при лкуванш остеохондральних дефекпв в експеримент на тваринах
Резюме. Актуальнсть. Застосування автолопчно!' плазми, збагачено! тромбоцитами (PRP — platelet rich plasma) е перспективною та вельми популярною методикою, що використовуеться з метою покращання регенерацИ' уражених тканин опорно-рухового апарату. Однак недостатня доказова база обумовлюе необхднсть проведення досл^ень щодо ефективност даного методу л1кування. Мета дослдження: в експеримент на 24 тваринах (кролО шляхом морфолопчних до^джень та морфометричного аналiзу о^нити ефективнсть застосування PRP при лiкуваннi внутршньосуглобових остеохондральних пошкоджень та дефект. Матерали та методи. Морфометричний аналiз препаратв, отриманих вд 24 експеримен-тальних тварин, як були розподiленi на три групи (2 контрольн та 1 дослдна), проводили для визначен-ня характеру та структури регенерату, його iнтеграцiï до оточуючих тканин, о^нки вмсту клтинних структур та неклтинних елемент, що сформувалися в дефект в р'зних сер'ях експерименту, з використанням модифiкованоï шкали S.W. O'Driscoll et al. та S.R. Frenkel et al. Результати. Аналiз результат досыдження з використанням модифiкованоï шкали пстолопчно'!' о^нки показав, що па^новий хрящ був наявний тльки в регенерат дослдних тварин серн 3, у яких застосовували PRP. стотного розшарування поверхн в цих тварин не виявлено, структурна нтегровансть була високою, щльнсть суглобового хряща навколо кра/'в дефекту значно перевищувала показники контролю. Дегенеративн змни хондроцитв переважали в кон-трольних тварин. Перебудова субхондральноï юстки пд зоною дефекту статистично в'др'знялася в дослднй та контрольнихгрупах тварин. При статистичному аналiзiвиявлено вiрогiдну р'зницю мiждослдною та кон-трольними групами (P < 0,001, t = 4,8), що свдчить про ефективн'ють застосування PRP. Висновки. Результати роботи пдтвердили ефективнсть застосування PRP для лiкування па^ентв iз внутр/'шньосуглобовими остео-хондральними пошкодженнями та дефектами.
Ключовi слова: остеоходральн пошкодження; регенера^яхряща; регенеративн технологи'; PRP (platelet rich plasma); BMDCT (bone marrow-derived cell transplantation)
Вступ
Захворювання, що характеризуются обмеженим субхондральним некрозом суглобово!' поверхш истки (розшкаючий остеохондрит), були описаш F. Konig (1888), M. Kappis (1922) та J. Dias (1928) i мають пост-травматичний або перевантажувальний генез. Лише в 10—30 % хворих з остеохондральним пошкодженням (ОХП), що проявляеться обмеженим остеонекрозом, не вдаеться довести його травматичне походження [1]. Незалежно вщ тривалост консервативного лшування вони мають тенденцш до прогресування дегенератив-
ного процесу з инцевим наслщком у термшальну ста-дш остеоартрозу [2]. У дорослих пащентав спонтанне загоення ОХП спостертаеться вкрай рщко [3]. В оглядi 14 дослщжень То1 та ш. [4] виявили, що консерватив-не л^вання було ефективним у зменшенш клшчних симптомiв, передушм больового синдрому, лише в 59 % пащентав, яи страждають вщ ОХП у I стадй'.
Сучасний комплекс регенеративних технологш у лшуванш дано1 категорй' пащентав включае мрурпчш методи л^вання в поеднанш iз застосуванням клггин-них i тканинних технологш, що полягають у приско-
© «Травма» / «Травма» / «Trauma» («Travma»), 2019
© Видавець Заславський О.Ю. / Издатель Заславский А.Ю. / Publisher Zaslavsky O.Yu., 2019
Для кореспонденци: Бур'янов Олександр Анатолмович, доктор медичних наук, професор, Нацюнальний медичний ушверситет iMeHi О.О. Богомольця, бульв. Т. Шевченка, 13, м. КиТв, 01601, УкраТна; e-mail: [email protected]
For correspondence: O. Buryanov, MD, PhD, Professor, Bogomolets National Medical University, T. Shevchenko boulevard, 13, Kyiv, 02000, Ukraine; e-mail: [email protected]
ренш диференцiацii та росту клiтин уражено! тканини, активаци !х метаболiзму, створенш умов для вщнов-лення кровопостачання й опти]шзацй' функцiональних умов новоутвореного регенерату. Серед реконструк-тивно-вiдновних хiрургiчних методiв найбiльш ефек-тивними е артроскопiчний або вiдкритий дебридмент, видалення вiльних хондральних або остеохондраль-них тт, лаваж, елементи абразивно! хондропластики (шейверування, вапоризацiя), мiкрофрактуринг або тунелiзацiя ыстковоТ тканини в зонi дефекту, остео-хондральна автотрансплантацiя (мозаТчна остеохон-дропластика) [5—9]. Однiею з перспективних методик, що дозволяе стимулювати метаболiзм та регенерацiю ыстково-хрящово! тканини, прискорити диференщ-ацiю та рiст клггин ушкоджених тканин, прискорити загоення дефекту, е застосування автолопчно! плазми, збагачено! тромбоцитами (PRP) або тромбоцитарними факторами росту (PRGF) [10, 11]. Сьогодш вказанi ме-тоди широко застосовуються як елементи регенератор-но! терапи при пошкодженнях юстково-хрящово! тканини, сухожильно-м'язового та капсульно-зв'язкового апарату.
У сучаснiй лiтературi зустрiчаються результати до-слiджень щодо ефективностi PRP для формування п-алшово! хрящово! тканини в зош Г! пошкодження та полiпшення бюлопчного синовiального середовища, в якому хрящ може вщновлюватися як при консервативному, так i пiсля хiрургiчного лiкування [10—12]. Було показано кращi результати лiкування пацiентiв iз за-стосуванням цих методiв, однак кшьысть дослiджень, а також !х застосування в комбшащях з iншими методиками л^вання не дозволяють вiрогiдно оцiнити !х вплив, що потребуе проведення додаткових експери-ментальних та кшшчних дослiджень.
Мета роботи: за даними морфолопчного дослщжен-ня в експеримент на лабораторних тваринах оцiнити ефективнють застосування PRP при лiкуваннi вну-трiшньосуглобових остеохондральних пошкоджень.
Матерiали та методи
Проведено 3 сери експерименпв, що виконаш на 24 кроликах (жива маса — 3800—4200 г). Вк: тварин до початку експерименту був 11—12 мюящв [13].
1-ша серiя — контрольнi тварини, вщтворювали стандартний дiрчастий (3 мм) остеохондральний дефект на медiальному виростку стегново! кiстки глиби-ною 5 мм (8 об'ектiв дослщження).
2-га серiя — пiддослiднi тварини. Остеохондральний дефект заповнювали колагеново-фiбриновою матрицею (рис. 1) (8 об'екпв дослщження).
3-тя серiя — шддослщш тварини. Остеохондраль-ний дефект заповнювали плазмою, збагаченою тромбоцитами в колагеново^бриновш матрицi (8 об'ектiв дослiдження).
При контакта колагеново^бриново! матрицi (плас-тини) з поверхнею дефекту активуеться перетворення фiбриногену у фiбрин, що супроводжуеться значною адгезiею матрицi до ложа дефекту. В подальшому вщ-буваеться полiмеризацiя фiбринового покриття з
Рисунок 1. Колагеново-ф'бринова матриця (пластина) (Тахокомб виробництва Takeda). З одного боку (А) пластина виконана з колагену (колагенова матриця, що мстить колаген I типу i3 сухожилка коня). З ¡ншого боку (Б) на колагенову матрицю нанесено люфЫзований людський ф1бриноген, тромбн, апротин!н та рибофлавн
утворенням еластичного герметичного тканинного каркасу, що закривае дефект. Упродовж 4—6 тижшв вщбуваються повна бюдеградащя колагеново^бри-ново! матриц та il замщення регенератом. Асептичш властивост пластини закладеш в технолопчних про-цесах il виробництва.
Хiрургiчне втручання проводили пiд кетамшовим наркозом (100—150 мг) i3 мюцевою анестезiею 0,5% розчином новока!'ну. Тварин фшсували на операцш-ному столь Оперативш втручання виконували на двох нижшх кiнцiвках. Пiсля пiдготовки операцшного поля скальпелем проводили розрiз шыри передньомедiаль-но1 поверхнi колiнного суглоба. Розсiкали м'якi тканини, бором вщтворювали остеохондральний дефект у медiальному виростку стегново! истки критичного розмiру дiаметром 3 мм, глибиною 5 мм (рис. 2). Спицею виконували тунелiзацiю виростка з дефекту. Дь лянку оперативного втручання заповнювали люфш-зованою колагеново-фiбриновою матрицею, до складу яко1 входили тромбiн, фiбриноген та колаген iз сухо-жилив коня з переважним вмiстом колагенових волокон I типу.
Плазму, збагачену тромбоцитами, отримували так. В шприц об'емом 5 мл набирали цитрат (CPDA-1 — Citrate Phosphate Dextrose Adenine Solution) об'емом 0,5 мл. На наступному етат виконували забiр кровi ш-тракардiально (до 5 мл) (рис. 3).
Шсля цього 0,5 мл отримано! сумМ забирали для проведення загального аналiзу кровi, а iншу частину (4,5 мл) ставили в центрифугу (ELMI Centrifuge CM-6 MT, Sky line, рис. 4).
Рисунок 2. Створення дефекту юстково! тканини (3 мм) у мед!альному виростку стегновоI к!стки
Рисунок 4. Вигляд центрифуги ELMI Centrifuge CM-6 MT, Sky line
Рисунок 3. 3a6ip кров! в експериментально/ тварини Онтракард'/ально)
Рисунок 5. Заб/р плазми, збагаченоI тромбоцитами, з центрифугованого препарату
Рисунок 6. Фотовдбитки з препарат1в 1, 3. Длянки кстково-хрящового дефекту у двох крол!в 1-1 серИ. А. Крайов! в!дд!ли суглобового хряща спаянi сполучною тканиною. Б. Тонкий прошарок волокнистого хряща мiж краями суглобового хряща. Контрольна серiя. Гематоксил!н та еозин.
А. Зб. х 40. Б. Зб. х 100
Рисунок 7. Фотов'щбиток 1з препарату 5. А. Длянка к'!стково-хрящового дефекту, заповнена сполучною тканиною. Б. Фрагмент рис. 7А. Розширен кровоносн! судини. Контрольна серiя.
Гематоксил!н та еозин. А. Зб. х 40. Б. Зб. х 100
Рисунок8. Фотов'щбиток ¡з препарату 7. Суглобовий хрящ iз низькою щ!льн!стю та нерiвномiрним роз-ташуванням хондроципв у длянках, що прилягать до дефекту. Хондроцити з Ыкнотичними ядрами.
Контрольна серiя. Гематоксилн та еозин. Зб. х 100
Рисунок9. Фотов'щбиток 1з препарату 10. Длянка деструкцп суглобового хряща на вщсташ вщ дефекту. Л'зис хондроципв. Поодинок! ¡зогенн! групи клтин. Контрольна серiя. Гематоксил!н та еозин. Зб. х 400
Рисунок 10. Фотов'щбиток ¡'з препарату 9. Длянка травматичного ушкодження суглобового хряща. А. Поля сполучноI тканини, розширен! кровоноснi судини, кистоподiбнi порожнини. К1стков1 секве-стри. Б. Щльна сполучна тканина в крайовому в!дд!л1дефектуз рщко розташованими ф!бробластами.
Дослщна серя 2. А. Зб. х 100. Б. Зб. х 200
Рисунок 11. Фотов'щбиток 1з препарату 12. А. Суглобовий хрящ над длянкою травматичного ушко-дження. Велик длянки без клтин. П1кноз хондроцит!в. Б. Грануляцйна тканина в длянц дефекту. Розширенi кровоносш судини. Дослдна серя 2. Гематоксил'/н та еозин. Зб. х 100
Рисунок 12. Фотов 'щбиток ¡'з препарату 17. Длянка дефекту в суглобовому хрящ! та губчастй к!стков1й тканин! заповнена хондро/дом 1з високою щльнстю ф!брохондроцит1в I хондробласт'в. Др'бнопетляста мережа з юсткових трабекул, прилеглих до длянки травматичного ушкодження. Дослдна сер!я 3. Гематоксил!н та еозин. Зб. х 40
Рисунок 13. Фотовдбиток 1з препарату 19. Регенерат у дефект'1 суглобового хряща. А. Поверхнева зона над дефектом. Фiброхондроцити та хондробласти. Б. Хондробласти та поодинок хондроцити в глибокй д 'лянщ дефекту. Досл '/дна серя 3. Гематоксил!н та еозин. А. Зб. х 400. Б. Зб. х 1000
Рисунок 14. Фотов'щбиток 1з препарату. Длянка зрощення новоутвореноIхрящовоI тканини 1з сугло-бовим хрящем. 1зогенн1 групи клтин. А. Суглобовий хрящ, що прилягае до дефекту з латерального боку. Б. Суглобовий хрящ, що прилягае до дефекту з мед!ального боку. Досл'щна сер'/я 3. Гематок-
сил!н та еозин. А. Зб. х 100. Б. Зб. х 200
Центрифугування проводили за такими параметрами: в одну комiрку вставляли шприц iз цитратом та кров'ю, у протилежну — шприц iз 4,5 мл фiзюлоriчно-го розчину (для балансу). Кльысть оберпв за хвили-ну — 1000. Тривалють — 5 хвилин.
Шсля завершення центрифугування виконувався забiр плазми (рис. 5).
Тварини вшх серш були виведеш з експерименту на 40-ву добу шляхом введення в одну з вушних вен 0,5—1,0 мл 10% розчину тюпенталу натрш. Вибiр цього термшу дослщження для дефектiв критичного розмiру пов'язаний iз тим, що тльки в умовах стимуляци ре-
Рисунок 15. Фотов'щбиток ¡'з препарату 21. Суглобовий хрящ на вщсташ вщ дефекту. У по-верхневй зон! хондроцити видовженоI форми. У пром!жн!й зон! суглобового хряща хондроцити округлоI форми з ядрами, виконаними пухким хроматином. Хондроцити оточен капсулою. До-сл'щна сер!я. Зб. х 400
параци можлива повна регенеращя ыстково-хрящових структур.
Робота з тваринами виконувалася вщповщно до правил бвропейсько! конвенци про гуманне ставлення до лабораторних тварин, яы використовують для експе-риментальних та iнших наукових цiлей [14, 15], а також вщповщно до Законодавства Украши [16]. План екс-периментальних дослiджень був затверджений Комитетом i3 бiоетики при Нацюнальному медичному ушвер-ситетi iменi О.О. Богомольця вщ 01.09.2016 р.
На вшх етапах експерименту оцшювали рухову ак-тивнiсть кроликiв, особливостi харчування й опоро-спроможнiсть кiнцiвки з дефектом. На 1-шу — 5-ту добу тварини берегли кiнцiвку, а повне навантаження зафшсоване пiсля 5 дiб. На етапах експерименту харчу-вання тварин не було порушене.
Макроскошчний аналiз проводили пiсля виведен-ня тварин з експерименту шд час пiдготовки стегново! кустки до фшсаци.
У всiх кроликiв видтяли стегнову кiстку з дiлянкою дефекту. Юстки фiксували в 10% розчиш нейтрального формалiну, декальцинували в 5% розчиш азотно! кислоти, зневоднювали в спиртах зростаючо! мщнос-та (вiд 60 до 96°), а також у сумiшi етилового спирту з дiетиловим ефiром (у сшввщношенш 1 : 1). Зразки укладали в цело!дин, блоки ущiльнювали в густому цело!диш пiд парами хлороформу. Виготовляли зрiзи товщиною 7—10 мкм, яи забарвлювали гематоксиль ном й еозином, а також ткрофуксином за ван Пзоном (Коржевський Д.Е., 2010) [17]. Аналiз i фотографуван-ня матерiалу проводили пiд мiкроскопами AxioStar Plus i MICROS. При мшроскошчному аналiзi дослiджували дiлянку дефекту i прилеглi материнсьи кiстку та хрящ.
Морфометричний аналiз здiйснювали для визна-чення характеру та структури регенерату, його ште-грацп до оточуючих тканин, оцiнки вмiсту клiтинних
структур та некштинних елементiв, що сформували-ся в дефектi в рiзних серiях експерименту з викорис-танням модифтэвано! шкали S.W. O'DriscoП е! а1. и S.R. Frenkel е! а1. (табл. 1) [13]. Дослтжували вiдносну площу новостворено! тканини в остеохондральному дефектi за допомогою квадратно-штчасто! окулярно! вставки (на площi 19 600 мкм2) за методикою Г.Г. Ав-тандiлова, пiдраховуючи кiлькiсть точок (перетишв квадратiв), якi потрапляли на кюткову тканину (Ав-тандилов Г.Г., 1990). Показники вттворювали у вт-сотках.
Результати
Результати до^дження в першш сери експери-ментальних тварин. 1-ша сергя — контрольн тварини, вiдтворювали стандартний дiрчастий (3 мм) остео-хондральний дефект на медiальному виростку стегновог тстки глибиною 5мм (8об'eктiв до^дження). Виведен-ня з експерименту на 40-ву добу тсля хiрургiчного втру-чання. Морфологiчна оцтка результатiв.
За макроскотчним до^дженням дтянка дефекту чпко визначалася у виглядi поглиблення на поверхш суглобового хряща i вщсутносп блиску в прилеглих до дефекту дтянках. На шших втдалених дтянках сугло-бовий хрящ мав характерний блиск, порушень будови у виглядi ерозiй не було виявлено.
Мжроскотчно крайовi втдти суглобового хряща були спаяш вузькою смужкою регенерату, представле-ного сполучною тканиною або волокнистим хрящем (рис. 6А, Б). Конгруентнють суглобового хряща порушена за рахунок формування поглиблень над дтянкою дефекту.
Дiлянка травматичного ушкодження в суглобово-му хрящi, що проникае в кюткову тканину, заповнена трьома видами тканин — грануляцшною, що включае розширенi кровоноснi судини i незрш сполучнотка-ниннi клiтини, а також фiброзною тканиною з високою щтьнютю фiбробластiв, що межувала з вогнищами волокнисто! хрящово! тканини (рис. 7А, Б). Остання роз-ташовувалася в субхондральних дiлянках, прилеглих до материнського суглобового хряща.
Сполучна тканина в дтянщ дефекту характеризу-валася високою щiльнiстю клiтин фiбробластичного диферону, розташованих серед рiзноспрямованих пучив колагенових волокон. Клiтини мали рiзну форму ядер — вiд подовжено! до овально!, вони розрiзнялися об'емом цитоплазми. У поверхневому втдш перева-жали клiтини з невеликими округлими базофтьними ядрами. Щiльнiсть клiтин у поверхневш зонi була зна-чно вищою, шж у розташованих нижче дтянках дефекту.
У глибоких втдтах дефекту виявлено грануляцшну тканину з округлими незртими сполучнотканинними клiтинами та високою щтьшстю судин iз розширени-ми просвiтами.
На дiлянках безпосередньо шд суглобовим хря-щем, прилеглим до дефекту, розташовувалися роз-ширенi кровоносш судини (рис. 8). У таких дтянках суглобовий хрящ характеризувався низькою
щтьшстю хондроципв та !х нерiвномiрним розта-шуванням. Бiльшiсть кштин мали ядра з ознаками шкнозу (рис. 8).
У одше! тварини в зош дефекту виявленi вузьы поля грануляцино! тканини з розширеними кровоносними судинами в глибоких втдтах i великi вогнища клгган-ного i тканинного детриту. На великих поверхнях суглобового хряща, що прилягають до дiлянки дефекту, були втсутш хондроцити.
На прилеглих дтянках суглобового хряща, розташованих вище або нижче вт зони травматичного ушкодження, конгруентнють була порушена, велиы поля були без хондроципв або з високою щтьшстю хондро-цитав iз пiкнотичними ядрами (рис. 9).
Кюткова тканина, що прилягала до дiлянки травматичного ушкодження, формувала великопетлясту мережу, що складалася з кiсткових трабекул, яы розрiз-нялися товщиною. Щiльнiсть остеоцитав на поверхнi трабекул та остеобластав по !х крайовiй поверхнi була низькою. Кiстковi трабекули, прилеглi безпосередньо до дтянки дефекту, на дтянках були без остеоцитав.
Результати до^дження в другш сери експеримен-тальних тварин. 2-га сергя — тддо^дт тварини. Ос-теохондральний дефект заповнювали колагеново^бри-новою матрицею (8 об'eктiв до^дження). Виведення з експерименту на 40-ву добу тсля хiрургiчного втручання. Морфологiчна оцтка результатiв.
Макроскотчт доЫдження. Дтянка дефекту в сугло-бовому хрящi чгтко визначаеться, за рахунок не! порушена конгруентнють в цш дтянщ та спостериаеться втрата характерного блиску в хрящ^ що И оточуе.
Мiкроскопiчш до^дження. Крайовi вщдти суглобового хряща, що прилягають до вттвореного дефекту, спаяш вузькою смужкою сполучно! тканини, що складаеться з щтьних пучив колагенових волокон iз рщко розташованими мiж ними фiбробласта-ми (рис. 10А, Б).
У дтянках дефекту, що проникае через губчасту кюткову тканину, виявлено поля пухко! сполучно! тканини з тонкими пучками колагенових волокон, по-одинокими фiбробластами помiж них та розширеними кровоносними судинами (рис. 10, 11). Мiж сполучною тканиною розташовувалися кiстковi секвестри i исто-подiбнi порожнини з гомогенним вмютом. Суглобовий хрящ, що прилягае до дтянки дефекту, на значнш те-риторii без хондроципв (рис. 10А). Порушення будови суглобового хряща у виглядi значних дтянок без кль тин виявлено й у втдтах, що розташованi вище або нижче дтянки дефекту (рис. 11А). На втсташ вт дефекту щтьнють хондроцитiв була низькою, бтьшють клiтин мали пiкнотичнi ядра. В таких дтянках пози-цiйно-специфiчна органiзацiя, що характерна для суглобового хряща, а саме розподт на поверхневу, про-мiжну та глибоку зони, була порушена.
Губчаста кюткова тканина, прилегла до дтянки травматичного ушкодження, з деструктивними змша-ми кюткових трабекул. Репаративний остеогенез вира-жений слабо. Виявленi лише вогнища остео!ду та ист-ковi нашарування на поверхнi трабекул.
Результати долдження в третш сери експери-ментальних тварин. 3-тя сергя — тддоШдт тварини. Остеохондральний дефект заповнювали плазмою, збага-ченою тромбоцитами, в колагеново^бриновш матриц (8 об'eктiв дослдження). Виведення з експерименту на 40-ву добу тсля хiрургiчного втручання. Морфологiчна оцтка результатiв.
Макроскотчш до^дження. Поверхня суглобового хряща була конгруентна i мала характерний блиск, за винятком дтянки дефекту. Над зоною дефекту характерний блиск був втсутнш, на реши територи суглобового хряща поверхня була з глянцевим блиском.
За мжроскотчним анал1зом у полi зору мкроскопа визначали дтянку травматичного ушкодження, що проходила через суглобовий хрящ та просякала в суб-хондральну истку (рис. 12). Вона була заповнена хон-дро'том, що щтьно контактував iз крайовими вщщ-лами суглобового хряща, прилеглою субхондральною кiсткою та глибше розташованою губчастою истковою тканиною.
Поверхня, що сформувалася над хондро!дом, мала рiвнi контури, складалась з тонких колагено-вих волокон, мiж якими були рщко розташованi витягнуто! форми фiброхондроцити (рис. 13А). Кль
тини мали витягнуту форму з вузькими базофть-но забарвленими ядрами. Шдльшсть клiтин у хон-дрощ була високою. Виявлено хондробласти, яп вiдрiзнялися вiд фiброхондроцитiв округлими або овальними ядрами, що мали чггко окресленi невелик ядерця (рис. 13Б). Поодинокi хондроцити були оточеш капсулою.
Новоутворена хрящова тканина у виглядi хондро!-ду щтьно зрощена з фрагментами суглобового хряща, прилеглими до дiлянки травматичного ушкодження. У щй дiлянцi виявленi невеликi територи без клiтин або хондроцити, яи формували iзогеннi групи (рис. 14А, Б). Як поблизу дтянки травматичного ушкодження, так й на втсташ вт не! суглобовий хрящ збериав ха-рактерну оргашзацш (рис. 14А, Б). У ньому чгтко ви-значалася поверхнева зона, що складалась iз дектькох шарiв хондроцитiв, розташованих свое! довгою вюсю паралельно поверхнi. Колагеновi волокна щтьно при-лягали один до одного. Ознак !х розшарування не виявлено.
У промiжнiй i глибоко! зонах суглобового хряща хондроцити збериали характерне розташування, пере-бували в капсулах, мали базофтьш ядра, оточеш вузь-кою цитоплазмою.
Таблиця 1. Шкала пстолопчно! оц!нки регенерацп суглобового хряща в юстково-хрящовому дефе^, стану суглобового хряща та губчастоI к!стково/ тканини навколо дефекту (модифкащя шкал O'Driscoll S.W. et а1. та Frenkel S.R. et а1.)
Кaтегорiя Показники Бали
I. Частка новоутвореного в дефект палшового 1.75-100 % 10
хряща 2.50-74 % 6
3.25-49 % 3
4.0-24 % 0
II. Характеристика регенерату: поверхня 1. PiBHa, неперервна 2
2. HepiBHa, щтини 1
3. Розволокнена 0
Структурна штегрованють 1. Нормальна 2
2. Розриви, кюти 1
3. Виражена дезЫтегращя 0
Щтьнють вщносно суглобового хряща кра!в 1.100 % 2
дефекту 2. 51-99 % 1
3. До 50 % 0
Зв'язок регенерату з краями дефекту сугло- 1. Повний 2
бового хряща 2. Частковий 1
3. Вщсутнм 0
Дегенеративн змши кттинних елеменпв 1. Вщсуты 2
2. Наявнють дегенеративних змЫ та вогнищ 1
пpолiфepaцii хондроцитв
3. Виpaжeнi ппоцелюлярнють та кiлькiсть во- 0
гнищ пpолiфepaцii хондpоцитiв
III. Суглобовий хрящ кра!в дефекту 1. Нормальний, вогнища пpолiфepaцii вiдсутнi 2
2. Haявнiсть дегенеративних змЫ та вогнищ 1
пpолiфepaцii хондpоцитiв
3. Виражен гiпоцeлюляpнiсть та кiлькiсть во- 0
гнищ пpолiфepaцii хрящових клiтин
IV. Перебудова субхондрально! кютки 1. Повна 2
2. > 50 % 1
3. < 50 % 0
На вгдсташ вiд зони травматичного ушкодження по-верхня суглобового хряща зберггала конгруентнiсть.
Структурна органiзацiя суглобового хряща на вгд-станi вiд зони дефекту була не порушена. У поверх-невий зош хондроцити мали витягнуту форму, були з характерними видовженими ядрами та довгою цитоплазмою (рис. 15).
У промiжнiй та глибоко! зонах суглобового хряща хондроцити мали округлу форму з ядрами, виконани-ми пухким хроматином. В ядрах клгган були наявш 1—2 ядерця. Клiтини розташовувалися в капсулах.
Кгсткова тканина, що оточувала дiлянку дефекту, була губчасто! будови, складалася з кiсткових трабекул, що формували дрiбнопетлясту мережу. Шiльнiсть ос-теоцитiв на поверхнi кгсткових трабекул була високою.
Для об'ективiзацií даних якгсного гiстологiчного до-слiдження проведено оцгнку стану регенерату, суглобового хряща, що оточував кiстково-хрящовой дефект, та губчасто! истково! тканини навколо нього (табл. 2).
Обговорення
Аналiз результатiв дослiдження з використанням модифгковано! шкали пстолопчно! оцiнки показав, що палшовий хрящ був наявний тльки в регенератi дослiдних тварин сери 3, у яких застосовували PRP. 1стотного розшарування поверхнi в цих тварин не ви-явлено, структурна штегрованють була високою, щгль-нють суглобового хряща навколо кра!в дефекту значно перевищувала показники контролю. Дегенеративш змiни хондроцитiв переважали в котрольних тварин. Перебудова субхондрально! кустки шд зоною дефекту статистично вiдрiзнялася в дослщшй та контрольних групах тварин. При статистичному аналiзi виявлено вг-рогiдну рiзницю мiж дослiдною та контрольними гру-пами (Р < 0,001, г = 4,8).
Отже, на 24 експериментальних тваринах (кролях) було вгдтворено травматичне остеохондральне ушкодження хряща у виглядi змодельованого повношаро-
вого кютково-хрящового дефекту. В контрольнш групi тварин (серiя 1) змодельоваш дефекти пiсля закгнчен-ня термшв дослiдження чiтко виявлялися на поверхш суглобового хряща. У тварин ще! сери (серiя 1) крайовi вiддiли суглобового хряща були з'еднаш вузьким про-шарком щгльно! сполучно! тканини, а в дiлянцi губча-то! кютково! тканини дефект був заповнений грануля-цiйною та сполучною тканиною. В суглобовому хрящi навколо дефекту, а також у вище- та нижчерозташова-них над дефектом дтянках виявлено велик! територи без клгган або поодинокi рiдко розташоваш хондроцити з пiкнозом ядер. У зош дефекту, що проходить через кюткову тканину, кiстковi трабекули, що його оточу-вали, формували великопетлясту мережу з низькою щтьнютю остеоцитгв.
В сери 2, де застосовували суто колагеново-фгбри-нову матрицю для заповнення дефекту, на 40-ву добу в зош травматичного ушкодження суглобового хряща, що проникав у кюткову тканину, визначали грануля-цгйну та фгброзну тканину з високою щтьшстю фгбро-бластгв, що межувала з вогнищами волокнисто! хря-щово! тканини. В субхондральному вгддш регенерат представлено кютковими трабекулами, що формували великопетлясту мережу.
У дослтнш групг тварин сери 3, якг отримували PRP, у термгн спостереження в дтянщ кютково-хрящово-го дефекту зафгксовано формування палшоподгбно! хрящово! тканини з ознаками дегенераци хондроцитгв, хондрофгбробластгв та хондрофгброцитгв, що щгльно заповнювала кютково-хрящовий дефект.
У лггератург немае даних щодо повного вгдновлен-ня суглобового хряща (тобто формування структу-ри — поверхнево!, промгжно! та глибоко! зон у хрящу, що некальцифгкуеться, та кальцифгкованого хряща з характерним розташуванням хондроцитгв). В основному в лгтератург е данг, якг вказують на те, що без втручання в процес регенераци суглобового хряща в дтянках дефекту формуеться волокнистш хрящ [18].
Таблиця 2. Пстолопчна оц'шка (в балах) регенераци суглобового хряща та губчастоi кютково! тканини в зон! кстково-хрящового дефекта (модифкащя шкал O'Driscoll S.W. et al. та Frenkel S.R. et al.)
Категорiя Серiя 1, контроль, бали Серiя 2, дослiдна, бали Серiя 3, дослiдна, бали
I. Частка новоутвореного в дефект палшового хряща 0 0,3 ± 0,5 7,5 ± 1,8
II. Характеристика регенерату:
Поверхня 0,4 ± 0,4 0,75 ± 0,50 1,6 ± 0,4
Структурна штегрованють 0,5 ± 0,5 0,75 ± 0,50 1,75 ± 0,40
Щтьнють суглобового хряща вщносно кра!в дефекту 0,5 ± 0,5 0,75 ± 0,50 1,6 ± 0,4
Зв'язок регенерату з краями дефекту суглобового хряща 0,4 ± 0,4 0,75 ± 0,50 1,6 ± 0,4
Дегенеративн змши кл^инних елементв 0,4 ± 0,4 0,6 ± 0,4 1,13 ± 0,30
III. Суглобовий хрящ навколо дефекту 0,4 ± 0,4 0,5 ± 0,5 0,75 ± 0,50
IV. Перебудова субхондрально! кютки 0,4 ± 0,4 0,6 ± 0,4 1,4 ± 0,4
Усього 0,375 ± 0,010 0,6 ± 0,1 2,2 ± 0,9
Порiвняно з контролем P > 0,05 P < 0,001
У зв'язку з цим отриманi даш про те, що пiд впливом PRP у дiлянцi остеохондрального дефекту формуеться гiалiновий або значно наближений до нього хрящовий регенерат iз високим ступенем вiдновлення структури субхондрально! ыстково! тканини, ми розглядаемо як позитивний результат. З даних лгтератури вщомо, що PRP стимулюе бюсинтез протеоглiканiв, колагену 2-го типу, сприяе хондрогенезу клгтин, пролГфераци, ди-ференцшванню й адгези хондроцитiв. Усе вищевказа-не пiдвищуе репаративнi потенци суглобового хряща [19—21], а результати, що отримаш нами п!д час екс-перименту, пiдтверджують ефективнiсть застосування PRP для стимуляци загоення внутршньосуглобових остеохондральних пошкоджень.
Висновки
Таким чином, можна зробити висновок, що PRP забезпечуе ефективну стимуляцш регенераци з фор-муванням гiалiноподiбного хрящового регенерату, що за сво!ми морфометричними характеристиками набли-жаеться до суглобового палшового хряща.
Етичний аспект. Робота з тваринами виконувала-ся вщповщно до правил бвропейсько! конвенци про гуманне ставлення до лабораторних тварин, яких ви-користовують для експериментальних та шших науко-вих цшей [14, 15], а також вщповщно до Законодавства Укра!ни [16]. План експериментальних дослщжень був затверджений Комiтетом Гз бiоетики при Нацюнально-му медичному ушверситет Гмеш О.О. Богомольця вщ 01.09.2016 р.
Конфлжт штереав. Автори заявляють про вщсут-нють конфлГкту штерешв при тдготовщ дано! статп.
Список лiтератури
1. Van Dijk C.N., Reilingh M.L., Zengerink M. et al. Osteochondral defects in the ankle: why painful?// Knee Surg. Sports Traumatol Arthrosc. - 2010. - 18. - P. 570-580. [PMC free article][PubMed]
2. Choi W.J., Park K.K., Kim B.S. et al. Osteochondral lesion of the talus: is there a critical defect size for poor outcome?// Am. J. Sports Med. - 2009. - 37. - P. 1974-1980. [PubMed
3. Easley M.E., Scranton P.E. Jr. Osteochondral autologous transfer system // Foot Ankle Clin. — 2003. — 8. — Р. 275-290. [PubMed]
4. Tol J.L., Struijs PA, Bossuyt P.M. et al. Treatment strategies in osteochondral defects of the talar dome: a systematic review // Foot Ankle Int. - 2000. - 21. - 119-126. [PubMed]
5. Chodos M, Schon L. Osteochondral lesions of the talus: Current treatment modalities and future possibilities // Current Opinion in Orthopaedics. — April 2006. — Vol. 17, Is. 2. — P. 111-116.
6. ZengerinkM., Struijs P.A., Tol J.L., van Dijk C.N. Treatment of osteochondral lesions of the talus: a systematic review // Knee Surg. Sports Traumatol Arthrosc. — 2010. — 18. — P. 238-246. doi: 10.1007/s00167-009-0942-6.[PMC free article] [PubMed] [Cross Ref]
7. Scranton P.E. Jr, Frey C.C., Feder K. Outcome of osteochondral autograft transplantationfor type-V cystic osteochon-
dral lesions of the talus // J. Bone Joint Surg. Br. — 2006. — 88. - Р. 614-619. [PubMed]
8. Anders S., Goetz J., Schubert T., Grifka J., Schaumburger J. Treatment of deep articular talus lesions by matrix associated autologous chondrocyte implantation — results at five years // Int. Orthop. - 2012. - 36(11). - Р. 2279-2285. doi: 10.1007/ s00264-012-1635-1. [PMC free article][PubMed][Cross Ref]
9. Badekas T., Evangelou E. Treatment of talar osteochondral lesions using local osteochondral talar autograft mid term results// Br. J. Sports Med. — 2011. — 45. — e1.
10. Mei-Dan O, Carmont M.R., Laver L. et al. Platelet-rich plasma or hyaluronate in the management of osteochondral lesions of the talus // Am. J. Sports Med. — 2012. — 40. — P. 534-541. [PubMed]
11. Guney A, Akar M., Karaman I. et al. Clinical outcomes of platelet rich plasma (PRP) as an adjunct to microfracture surgery in osteochondral lesions of the talus //Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. - 2015. - 23. - Р. 2384-2389. [PubMed]
12. Use of a biological reactor and platelet-rich plasma for the construction of tissue-engineered bone to repair articular cartilage defects /Li H., Sun S., Liu Н. et al. //Exp. Ther. Med. - 2016. - Vol. 12, № 2. - P. 711-719.
13. Yoshioka M., Coutts R.D., Amiel D., Hacrer S.F. Characterisation of a model of osteoarthritis in the rabbit knee // Osteoarthr. Cartilage. - 1996. - № 4. - P. 87-98.
14. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Council of Europe. - Strasbourg. 18. III. - 1986. - № 123. - 52p.
15. бвропейська конвенщя про захист хребетних тварин, що використовуються для до^дних та шших на-укових цыей. Страсбург, 18 березня 1986 року: офщшний переклад [Електронний ресурс] / Верховна Рада УкраИ-ни. — Офщ. веб-сайт. — (Мiжнародний документ Ради бвропи). — Режим доступу до документа: http:zakon.rada. gov.ua/cgi-bin/laws/main.cgi?nreg=994_137.
16. Закон Украти № 3447-IV вiд 21.02.2006 «Про захист тварин вiд жорстокого поводження» (стаття 26).
17. Коржевский Д.Э. Основы гистологической техники/ Д.Э. Коржевский, А.В. Гиляров. — СПб.: СпецЛит, 2010. - 95 с.
18. Остеоартроз: консервативная терапия: монография / Н.А. Корж, А.Н. Хвисюк, Н.В. Дедух и др.; Под ред. Н.А. Коржа, Н.В. Дедух, И.А. Зупанца. — Харьков: Золотые страницы, 2007. — 424 с.
19. Articular cartilage defects reconstruction by plasma rich growth factors/ Cugat R.., Carrillo J.M., Serra I. et al. // Za-nasi S., Brittberg M., Maracci M. eds. Basic Science, Clinical Repair and Reconstruction of Articular Cartilage Defects: Current Status and Prospects. — Bologna, Italy: Timeo Editore, 2006. - P. 801-807.
20. Gobbi A. Biological Approaches for Cartilage Repair / A. Gobbi, L. Bathan//J. Knee Surg. - 2009. - Vol. 22. -№ 1. - P. 36-44.
21. Use of a biological reactor and platelet-rich plasma for the construction of tissue-engineered bone to repair articular cartilage defects /Li H., Sun S., Liu Н. et al. //Exp. Ther. Med. - 2016. - Vol. 12, № 2. - P. 711-719.
Отримано 15.01.2019 ■
Бурьянов О.А.1, ЛябахА.П.3, ДедухН.В.2, Омельченко Т.М.1, Черновол П.А.1, Турчин О.А.3 Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца МЗ Украины, г. Киев, Украина 2ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов имени проф. Н.И. Ситенко НАМН Украины», г. Харьков, Украина
3ГУ «Институт травматологии и ортопедии НАМН Украины», г. Киев, Украина
Применение аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, при лечении остеохондральных дефектов в эксперименте на животных
Резюме. Актуальность. Применение аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP —platelet rich plasma), является перспективной и весьма популярной методикой, используемой с целью улучшения регенерации пораженных тканей опорно-двигательного аппарата. Однако недостаточная доказательная база обусловливает необходимость проведения исследований по изучению эффективности данного метода лечения. Цель исследования: в эксперименте на 24 животных (кролики) путем морфологических исследований и морфоме-трического анализа оценить эффективность применения PRP при лечении внутрисуставных остеохондральных повреждений и дефектов. Материалы и методы. Морфометрический анализ препаратов, полученных от 24 экспериментальных животных, которые были разделены на три группы (2 контрольные и 1 опытная), проводили для определения характера и структуры регенерата, его интеграции в окружающих тканях, оценки содержания клеточных структур и неклеточных элементов, сформировавшихся в дефекте в различных сериях эксперимента, с использованием модифицированной шкалы S.W. O'Driscoll et al. и S.R. Frenkel et al. Результаты. Анализ результатов иссле-
дования с использованием модифицированной шкалы гистологической оценки показал, что гиалиновый хрящ присутствовал только в регенерате опытных животных серии 3, у которых применяли PRP. Существенного расслоения поверхности хряща у этих животных не выявлено, структурная интегрирован-ность была высокой, плотность суставного хряща вокруг краев дефекта значительно превышала показатели контроля. Дегенеративные изменения хондроцитов преобладали у контрольных животных. Перестройка субхондральной кости под зоной дефекта статистически отличалась в исследуемой и контрольных группах животных. При статистическом анализе выявлена достоверная разница между исследуемой и контрольными группами (P < 0,001, t = 4,8), что свидетельствует об эффективности применения PRP. Выводы. Результаты работы подтвердили эффективность применения PRP для лечения пациентов с внутрисуставными остеохондральными повреждениями и дефектами.
Ключевые слова: остеоходральные повреждения; регенерация хряща; регенеративные технологии; PRP (platelet rich plasma); BMDCT (bone marrow-derived cell transplantation)
O.A. Burianov1, A.P. Lyabakh3, N.V. Dedukh2, T.M. Omelchenko1, P.A. Chernovol1, O.A. Turchin3 1Bogomolets National Medical University, Kyiv, Ukraine
2SI "Sytenko Institute of Spine and Joint Pathology of the NAMS of Ukraine", Kharkiv, Ukraine 3SI "Institute of Traumatology and Orthopedics of the NAMS of Ukraine", Kyiv, Ukraine
Application of platelet-rich plasma in the treatment of osteochondral defects in animal testing
Abstract. Background. The use of platelet-rich plasma (PRP) is a promising and very popular technique to improve the regeneration of the affected tissues of the musculoskeletal system. However, insufficient evidence base necessitates conducting researches to study the effectiveness of this treatment method. Purpose to assess the effectiveness of PRP in the treatment of intra-articular osteochondral injuries and defects in an experiment on 24 animals (rabbits) by morphological studies and morphometric analysis. Materials and methods. Morphometric analysis of preparations obtained from 24 experimental animals, which were divided into three groups (2 control and 1 experimental), was carried out to determine the nature and structure of the regenerate, its integration into the surrounding tissues, to assess the content of cellular structures and non-cellular elements formed in the defect in various series of experiment. A modified scale of S.W. O'Driscoll et al. and S.R. Frenkel et al. was used. Results. Analysis of study results using a modified scale of histological evalu-
ation showed that hyaline cartilage was present only in the regenerate of experimental animals of series No. 3, in which PRP was used. Significant delamination of the cartilage surface was not detected in these animals, structural integration was high, the density of articular cartilage around the edges of the defect significantly exceeded the control values. Degenerative changes in chondrocytes prevailed in control animals. The rearrangement of the subchondral bone under the defect area was statistically different in the studied and control animals. The statistical analysis revealed a significant difference between the studied and control groups (P < 0.001, t = 4.8), which indicates the effectiveness of PRP. Conclusions. The results of the study confirmed the effectiveness of PRP for the treatment of patients with intra-articular osteochondral lesions and defects. Keywords: osteochondral defects; cartilage regeneration; regenerative technologies; platelet-rich plasma; bone marrow-derived cell transplantation
