CC BY
67
10. Gabibov A.G., Belogurov A.A., Lomakin Y.A., et al. Combinatorial antibody library from multiple sclerosis patients reveals antibodies that cross-react with myelin basic protein and EBV antigen // FASEB J. - 2011. - Vol. 25 - P.4211-4221.
11. Heller J., Holzer G., Schimrigk K. Immunological differentiation between neuroborreliosis and multiple sclerosis // J. Neurol. - 1990. - Vol. 237 - P.465-470.
12. Logigian E.L., Kaplan R.F., Steere A.C. Chronic neurologic manifestations of Lyme disease // N. Engl. J. Med. - 1990. - Vol. 323 - P. 1438-1444.
13. Owens G.P., Winges K.M., Ritchie A.M. VH4 gene segments
dominate the intrathecal humoral immune response in multiple sclerosis // J. Immunol. - 2007 - Vol. 179 - P.6343-6351.
14. Postic D., Korenberg E., Gorelova N., et al. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incidence of mixed isolates // Res. Microbiol. - 1997. - Vol. 148.
- P.691-702.
15. Tiller T., Tsuiji M., Yurasov S. Autoreactivity in human IgG+ memory B cells // Immunity. - 2007 - Vol. 26 - P.205-213.
16. Tonnelle C., Cuisinier A.M., Gauthier L. Fetal versus adult PreB or B cells: the human VH repertoire // Ann. N Y Acad. Sci.
- 1995 - Vol. 764 - P.231-241.
Информация об авторах: Морозова Вера Витальевна — к.б.н., старший научный сотрудник, 630090, г. Новосибирск, Академика Лаврентьева проспект, 8, тел. (383)-363-51-57, e-mail: morozova@niboch.nsc.ru; Фоменко Наталья Владимировна
- к.б.н., научный сотрудник; Стронин Олег Владимирович, к.м.н., начальник отделения; Матвеев Андрей Леонидович -аспирант; Тикунова Нина Викторовна - д.б.н., заведующая лабораторией.
© ТЮЛЬКО Ж.С., ЯКИМЕНКО В.В. - 2012 УДК 578.2'21
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, СВЯЗАННАЯ С ИХ СТРУКТУРОЙ
Жанна Сергеевна Тюлько1, Валерий Викторович Якименко2 (‘Омская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. А.И. Новиков; кафедра физики, математики, медицинской информатики, зав. - к.ф-м.н. Ю.Б. Никитин; 2Омский НИИ природно-очаговых инфекций, директор - д.м.н., проф. Н.В. Рудаков, лаборатория арбовирусных инфекций,
зав. - д.б.н. В.В. Якименко)
Резюме. Для обнаружения корреляций при возникновении нуклеотидных замен в первичных последовательностях генома вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) был использован метод выявления связанных изменений в символьных последовательностях, основанный на подсчете взаимной информации. По результатам анализа обнаружены статистически значимые корреляции при возникновении нуклеотидных замен (как синонимичных, так и несинонимичных) на удаленных друг от друга участках генома. Сравнение известных описаний структурных элементов нуклеотидной последовательности ВКЭ с полученной схемой корреляций нуклеотидных замен показало, что наблюдаемые корреляции выявлены для однонитевых участков стеблей шпилечных структур вирусной РНК, взаимодействующих друг с другом при образовании третичной структуры. Предложенный метод позволяет определять участки вирусной РНК, имеющие значение при формировании третичной структуры молекулы.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, связанные нуклеотидные замены, третичная структура РНК.
THE NUCLEOTIDE SEQUENCES VARIABILITY OF GENOMES OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS ASSOCIATED WITH THEIR STRUCTURE
J.S. Tjulko1, V.V. Yakimenko2 (‘Omsk State Medical Academy; 2Omsk Institute of Natural Foci Infections of Russian Federal Service for Consumer Rights and Welfare Controls)
Summary. For detection of correlations in nucleotide substitution occurrence in TBE-virus genome nucleotide sequences, the method of revealing of the connected changes in the symbolical sequences, based on calculation of the relative information was used. By the results of the analysis, statistically significant correlations have been found out in nucleotide substitution occurrence (both synonymous, and not synonymous) on the sites of genome, removed from each other. Comparison of known descriptions of nucleotide sequence of structural elements with the received circuit of correlations has shown, that the found out correlations are revealed for unpaired nucleotides in stalks of RNA hairpins. Such hairpins cooperate with each other in formation of tertiary RNA-structure. The presented method allows to define RNA sites, which are important in formation of tertiary structure of a molecule.
Key words: tick-borne encephalitis virus, connected nucleotide substitution, tertiary RNA-structure.
В рамках современных представлений о генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) выделяют не менее трех основных генотипов (геновидов) вируса, два из которых имеют крайне широкое географическое распространение в северной Евразии [2]. Высокий уровень экологической пластичности широко распространенных геновидов ВКЭ предполагает существование достаточно вариабельных биологических свойств штаммов ВКЭ, что регистрируется при изучении структуры природных очагов клещевого энцефалита (КЭ). Данное сообщение ориентировано на выявление подходов к определению детерминированности биологических свойств вирусов, а именно - поиску механизмов изменений биологических свойств, связанных непосредственно с изменениями первичной структуры генома вируса, и (или) - опосредованно - с
изменениями пространственной структуры молекулы.
Применение подобных подходов становится возможным в связи с увеличением количества нуклеотидных последовательностей ВКЭ, размещаемых в банках данных и накоплением информации о мутациях в вирусном геноме и структурных особенностях организации вирусных РНК.
Нуклеокапсид вирусной частицы флавивирусов, включает в себя капсидный белок С и геномную +РНК. Он окружен липидной мембраной, содержащей М (мембранный) и Е (оболочечный) белки. Геномная РНК фла-вивирусов кодирует три структурных (С, М и Е) и семь неструктурных белков (N¿1, №2А, N826, N83, №4А, N846, N85), которые последовательно считываются в единой рамке считывания и нужны для успешного размножения вируса в клетках хозяина, хотя на сегод-
ня не все функции этих белков известны [8,11]. В 5’- и З’-некодирующих концевых последовательностях, расположенных по бокам рамки считывания, содержатся регуляторные элементы РНК, которые, необходимы для осуществления репликации и могут участвовать в формировании вторичной структуры РНК. Существует общая схема расположения регулирующих элементов РНК флавивирусов, сохраняющихся вторичных структур РНК, консервативных и вариабельных участков генома [12]. Вторичная структура РНК вирусов чувствительна к возникновению мутаций. Эффекты, вызываемые появлением синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен, определяются местом их возникновения [10,11], которое может соответствовать расположению регуляторных элементов РНК, а также особенностями вторичной структуры РНК, измененной их появлением. Важность изучения не только количества различий (замен) между нуклеотидными последовательностями, но и наличия возможных связей между отдельными точечными мутациями в разных частях генома, уже была показана ранее [6]. Дальнейшее изучение таких связей, сопоставление их местоположения в вирусных РНК с положением известных консервативных структур РНК, поможет составить представление о взаимодействиях этих структур друг с другом и их роли в вирусном геноме. Выявление подобных закономерностей процесса возникновения мутаций невозможно без использования различных статистических методов [6,7].
Цель работы: обнаружение корреляций при возникновении нуклеотидных замен в кодирующих последовательностях РНК ВКЭ с последующим анализом расположения сайтов, в которых наблюдаются связанные нуклеотидные замены. А также сопоставление, полученной схемы корреляций с расположением структурных особенностей вирусных РНК и некоторых группоспецифичных мутантных сайтов.
Материалы и методы
В работе анализировались полноразмерные нуклеотидные последовательности ВКЭ, полученные из банка данных EMBL в режиме свободного доступа (коды доступа в банке: AB062063, AB062064, AB507800, AF069066, AF253419, AF253420, AF527415, AM600965, AY169390, AY182009, AY193805, AY217093, AY323490, AY438626, DQ153877, DQ401140, DQ486861, DQ862460, DQ989336, EF469661, EF469662, EU480689, EU543649, EU670438, EU770575, EU790644, EU816450, EU816451, EU816452, EU816453, EU816454, EU816455, FJ402885, FJ402886, FJ572210, FJ906622, FJ968751, FJ997899, GQ228395, GQ266392, GU121642, GU183379, GU183380, GU183381, GU183382, GU183383, GU183384, HM055369, HM120875, HM440558, HM440559, HM440560, HM440561,
HM440562, HM440563, HM535610, HM535611,
HM859894, HM859895, HQ201303, HQ901366, HQ901367, JF316707, JF316708, JF819648, JN003205, JN003206, JN003207, JN003208, JN003209, JN229223, L06436, L40361, U27491, U27495, U39292).
Для выравнивания последовательностей и расчета филогенетических деревьев применялась программа Clustal X (1.8), в которой использовались методы: множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей (Multiple Alignments) со следующими значениями параметров GAP 0PENING=20, DELAY DIVERGENT SEQUENCES=30%, TRANSITION WEIGHT=0.6; для расчета филогенетических деревьев (BOOTSTRAP N-J TREE), при значении параметра bootstrap replicates > 1000.
Компьютерных программы, для поиска корреляций, написаны на языке «Фортран».
Для обнаружения корреляций при возникновении нуклеотидных замен в первичных последовательностях генома ВКЭ был использован метод выявления связанных изменений в символьных последовательностях, основанный на подсчете взаимной информации [4,5].
Для этого в массивах выровненных последовательностей сравнивались столбцы с разными координатами, отсчитываемыми от первого нуклеотида в кодирующей части последовательности (рис. 1). Каждый столбец
Рис. 1. Схема подсчета значений МД1Д в массиве выровненных нуклеотидных последовательностей.
представляет собой символьную последовательность, которую можно сравнить с другими. В качестве меры подобия символьных последовательностей использовалось значение взаимной информации - МД. Удвоенное значение МД распределено как случайная величина х2, поэтому можно оценить вероятность случайной взаимосвязи двух последовательностей в одном испытании и выбрать значение минимального уровня взаимной информации МДш. =70, обеспечивающее для имеющейся выборки обнаружение статистически значимой взаимосвязи символьных последовательностей, с вероятностью ошибки р<0,05 [3]. Анализировалась только кодирующая часть вирусной РНК, т.к. некодирующие 5’ и 3’- концевые последовательности плохо представлены в банках данных.
Таким образом, для анализируемого массива выровненных последовательностей рассчитывается набор значений МД.. (у - координаты первого и второго из пары сравниваемых столбцов), характеризующий возможную связь между заменами нуклеотидов в каждой позиции, с заменами во всех других позициях последовательности.
Результаты и обсуждение
Анализ расширенной подборки полноразмерных кодирующих первичных последовательностей генома ВКЭ позволил выявить многочисленные значимые корреляции при возникновении синонимичных и несинонимичных замен нуклеотидов (более случаев 800), подтверждая данные о существовании сложных взаимодействий между различными участками вирусной РНК, полученные ранее по меньшей выборке [6]. Обнаруженные случаи корреляции распределяются неравномерно вдоль последовательности по той же самой схеме и затрагивают удаленные друг от друга части генома, кодирующие разные белки (рис. 2). Причем корреляции с наибольшими значениями МД (МД>80) связывают мутантные сайты, расположенные на участках, кодирующих разные гены (21 случай). Только 4 таких случая, связывают сайты, расположенные в пределах одного гена.
Имеющихся описаний вторичной структуры РНК вирусов ВКЭ недостаточно для однозначного объяснения полученной схемы корреляций. Но данные по вторичной структуре участка с координатами 1-330 нуклеотидов (далее н.) [11] (рис. 3), сопоставленные с координатами нуклеотидных замен, для которых выявлены корреляции, показали, что положение сайтов, где наблюдаются связанные замены, соответствует трем однонитевым (неспаренным) участкам стеблей шпилек РНК, обозначаемых: 8Ъ4 (140 н.), 8Ъ6 (217 н., 219 н.), и шпильке, не имеющей обозначения (299 н.). Показано наличие значимых корреляций между заменами, возникающими в позициях 140 н. и 299 н. (рис. 3).
О 2000 4000 6000 8000 10000
Рис. 2. Схема размещения выявленных корреляций в кодирующей части генома ВКЭ. Точками на диаграмме отмечены выявленные случаи значимых корреляций, координаты точек на рисунке соответствуют координатам, отсчитываемым от первого нуклеотида кодирующей последовательности.
Есть сведения, о том, что шпилька 8Ъ6 участвует в регуляции кинетики размножения вирусов [І1], являясь энхансерным элементом, регулирующим репликацию, т.е. взаимодействует со структурами, расположенными
изико-химических . Исключением яв-
Рис. 3. Первые 333 нуклеотида генома ВКЭ. Рисунок приводится по Тирііп А., 2011 [11]. Выносками с номерами отмечены нуклеотиды, для которых обнаружены связанные замены.
в других частях РНК. Наши данные подтверждают это: выявлены корреляции замен для нуклеотидов с координатами 217 н. и 219 н. и связанных с ними заменами, возникающими в последовательностях, кодирующих структурный белок Е и неструктурные белки N83, №4Б, N85.
Эти данные, а также данные о местоположении связанных нуклеотидных замен в РНК хантавиру-сов [4,5] позволяют предположить, что выявляемые корреляции отражают картину взаимодействий, возникающих между отдельными частями вирусной РНК при формировании ее третичной структуры.
Используя такое представление о природе выявленных корреляций и полученную схему локализации связанных замен в последовательности РНК, можно объяснить возникновение некоторых группоспецифичных мутаций. В работе [1], исследующей роль мутаций в изменении патогенных свойств вируса, было обнаружено 19 сайтов, мутации которых являются специфичными для групп инаппарантных и высоковирулентных штаммов и могут быть связаны с изменением патогенности вируса. При этом большая часть таких мутаций, характерных для изучаемых штаммов, не приводит к существенному изменению свойств аминокислот. Мы сравнили координаты этих аминокислот, со схемой выявленных корреляций. Сравнение показало, что шесть из них включены в схему связанных замен.
Эти аминокислоты (далее а.к.) приходятся на различные гены: М- 246 а.к., N81-917 а.к., N83-1505 а.к., Ш4Б-2354 а.к. и 2438 а.к. (координаты даны по положению в полипротеине штамма 8о^цп-НО). Замены, выявленные в вышеперечисленных сайтах, не вызывают существенного изменения свойств аминокислоты [1 ляется только замена в N81-917 а.к., которая, однако не затрагивает функционально значимые участки белка. Механизм действия таких мутаций на патогенность не выяснен.
Однако можно предположить, что возникновение мутаций в этих сайтах или в сайтах, связанных с ними корреляционной схемой, может деформировать стебель шпилечной структуры вирусной РНК и изменить картину третичных взаимодействий. Это, в свою очередь, может влиять на процессы приспособления вируса и результаты отбора в процессе адаптации и, как следствие - на патогенность. Так в опытах с адаптацией вируса клещевого энцефалита к клеткам БНК-21 отмечалось возникновение, как несинонимичных, так и синонимичных замен, которые меняют только вторичную структуру РНК [9].
Увеличение числа анализируемых нуклеотидных последовательностей вируса ВКЭ, позволит в перспективе уточнить схему корреляций нуклеотидных замен, выявить участки последовательности, вовлекаемые в третичные взаимодействия и дифференцировать типы таких взаимодействий. Этот подход может помочь при отборе возможных вариантов третичной структуры вирусной РНК, моделирование которой является сложной задачей динамического программирования и требует одновременного учета многих факторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Беликов С.И., Леонова Г.Н., Кондратов И.Г. и др. Анализ геномов штаммов вируса клещевого энцефалита, обладающих различной вирулентностью для человека // Тихоокеанский медицинский журнал. - Владивосток, 2010. - №3. - С.23-26.
2. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии // Вопросы эко-
логии, молекулярной эпидемиологии, нозологии, эволюции.
- Новосибирск: Наука, 2002. - 438 с.
3. Кульбак С. Теория информации и статистика. - М.: Наука, 1967. - 220 с.
4. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Изучение филогенетических отношений хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации (на примере Хантаан-подобных вирусов) // Хантавирусы и хантавирусные инфекции. - Владивосток, 2003. - С.173-181.
5. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Связанные замены в малом сегменте генома хантавирусов Старого света // Вопросы вирусологии. - 2008. - №3. - С.28-34.
6. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. К проблеме изменчивости генома вирусов клещевого энгцефалита // Национальные приоритеты России. Специальный выпуск. - 2011. - №2. -С.168-170.
7. Firth A.E., Atkins J.F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1’ may derive from ribosomal frameshifting // Virology Journal. - 2009. - Vol. 6. - P.1-6.
8. Grard G. Moureau G., Charrel R.N., et al. Genetic characterization of tick-borne flaviviruses: New insights into evolution, pathogenetic determinants and taxonomy // Virology.
- 2007. - Vol. 361. - P80-92.
9. Mandl C.W., Kroschewski H., Allison S.L., et al. Adaptation of Tick-Borne Encephalitis Virus to BHK-21 Cells Results in the Formation of Multiple Heparan Sulfate Binding Sites in the Envelope Protein and Attenuation In Vivo // Journal of Virology.
- 2001. - Vol. 75. №12. - P.5627-5637.
10. Marin M.S., Zanotto P.M., Gritsun T.S., Gould E.A. Phylogeny of TYU, SRE, and CFA virus: different evolutionary rates in the genus Flavivirus // Virology. - 1995. - Vol. 206. №2.
- P1133-1139.
11. Tuplin A., Evans D.J., Buckley A., et al. Replication enhancer elements within the open reading frame of tick-borne encephalitis virus and their evolution within the Flavivirus genus // Nucleic Acids Research. - 2011. - Vol. 39. №16. - P7034-7048.
12. Thurner C., Witwer C., HofackerI.L., StadlerP.F. Conserved RNA secondary structures in Flaviviridae genomes // Journal of General Virology. - 2004. - Vol. 85. - P1113-1124.
Информация об авторах: Тюлько Жанна Сергеевна - доцент кафедры, к.б.н., 644043, ул. Ленина, 12, тел. (3812) 23-02-11,факс (3812) 23-46-32, е-шаП tjs@omsk-osma.ru; Якименко Валерий Викторович - заведующий лабораторией, руководитель, д.б.н., ст.н.с., 644080, Омск, пр. Мира 7, тел. (3812) 650304, е-шаП vyakimenko78@yandex.ru
© БАЙКОВ И.К., МАТВЕЕВ Л.Э., МАТВЕЕВ А.Л., ТИКУНОВА Н.В - 2012 УДК 578.833.2:612.017.1:575.2
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
Иван Константинович Байков, Леонид Эдуардович Матвеев,
Андрей Леонидович Матвеев, Нина Викторовна Тикунова (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, директор - академик РАН В.В. Власов)
Резюме. Определены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих вариабельные домены мышиных моноклональных антител против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита - потенциальных прототипов для конструирования терапевтических антител. Установлено, что вируснейтрализующие моноклональные антитела обладают значительным сходством вариабельных доменов легких и тяжелых цепей.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, гликопротеин Е, моноклональное антитело, вариабельные домены иммуноглобулинов.
COMPARATIVE ANALYSIS OF VARIABLE DOMAINS OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS
I.K. Baykov, L.E. Matveev, A.L. Matveev, N.V. Tikunova (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SD RAS, Novosibirsk)
Summary. Nucleotide sequences of the genes encoding variable domains of mouse monoclonal antibodies against tick-borne encephalitis virus glycoprotein E have been determined. These antibodies may potentially become prototypes for therapeutic antibodies construction. It was shown that virus neutralizing monoclonal antibodies have significant similarities in their variable domains.
Key words: tick-borne encephalitis virus, glycoprotein E, monoclonal antibody, immunoglobulin variable domains.
На территории Российской Федерации одним из наиболее патогенных для человека вирусных агентов является вирус клещевого энцефалита (КЭ), который способен вызывать заболевание, приводящее к серьезным поражениям нервной системы. В настоящее время для этиотропной терапии КЭ применяют в основном сывороточный иммуноглобулин, получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания. Этот препарат обладает выраженным терапевтическим эффектом особенно при среднетяжелом и тяжелом течении заболевания, причем введение препарата в 1-2 день после укуса обеспечивает значительно больший лечебный эффект, чем введение в последующие дни. Вместе с тем, препарат обладает определенными недостатками, в частности, он дефицитен и содержит относительно низкий уровень специфических вируснейтрализующих антител, что связанно с ограниченным источником исходного материала.
В последние годы внимание исследователей и фармацевтических компаний привлекают рекомбинантные антитела, способные заместить сывороточные иммуноглобулины. Среди рекомбинантных антител на фармацевтическом рынке преобладают химерные антитела - полноразмерные иммуноглобулины, в которых к константным доменам иммуноглобулинов человека присоединены вариабельные домены мышиных моноклональных антител (МКА). При конструировании химерных антител против вируса КЭ ключевым этапом является выбор МКА, чьи вариабельные домены обладают высокой аффинностью и противовирусными свойствами.
Ранее были получены и охарактеризованы МКА против гликопротеина Е - основного иммуногенного белка вируса КЭ [5]. Установлено, что некоторые из них способны ингибировать инфекционность вируса на культуре эукариотических клеток [4,5]. Эти антитела пред-
