CC BY
60
вирусами ВКЭ или даже всего рода Flavivirus для понимания процессов эволюционной изменчивости.
Таким образом в результате сравнения трех методов генотипирования ВКЭ, определена 100% специфичность всех использованных методик и наиболее высокая аналитическая чувствительность метода ПЦР в режиме реального времени с генотипспецифическими зондами. Определение политиповых штаммов с отличающейся концентрацией генотипов также возможно лишь с использованием последнего метода. Обнаружение изолятов, имеющих уровень замен выше среднего внутригруппового, характеризующихся большим числом мутаций, особенно в области гибридизации зондов и сайтах рестрикции, делает необходимым использование метода секвенирования для типирования образцов.
THE USE OF MOLECULAR-GENETICS METHODS FOR THE STUDY OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRUCTURE
L.S. Caran, G.V. Malenko, N.G. Bochkova, L.S. Levina, G.P. Pivanova, N.M. Colyasnikova, E.G. Gamova, A.G. Trukhina, V.I. Zlobin, M.M. Verkhozina, I.V. Kozlova, U.P. Gioev, T.V. Demina, V.V. Pogodina
The study has covered 11 strains and 8 RNA iso: lates of tick-borne encephalitis, corresponding to the Siberian and the Far Eastern genotypes within the E-gene complete sequence. The isolation period for strains refers to 40 years for the Siberian genotype and 70 years for the Far Eastern genotype. The study confirmed the earlier findings that strains and isolates of Siberian genotype could be subdivided into distinct branchs (Asian and European branchs), where the Asian splits into two smaller branches, one of which corresponds to the prototypic strain Zau-
saev, and the other one to the strain Vasilchenko. The European and Asian subtypes carry stable amino acid markers on E gene (positions 175 and 234). The Far Eastern isolates involve a distinct group of isolates from Hokkaido, namely the Oshima. Strains from Ural, Western Siberia and Far East, don't have stable amino acid markers on E gene. The entire genome nucleotide sequence was obtained for two strains, one of which (178-79) was isolated in 1979 in the Irkutsk region from I.persulcatus ticks, and the other (886-84) was also isolated in the Irkutsk region from CI. rufocanus in 1984. The nucleotide and amino acid sequences analysis have referred both strains to the Far Eastern genotypes.
Литература
1. Генотипирование вируса клещевого энцефалита молекулярно-биологическими методами / Л.С. Карань, Т.А. Булгакова, Г.В. Маленко и др. // Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков: Материалы Международной научно-практической конференции. — Алматы, 2006 — С. 70-72.
2. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита / В.И. Злобин, С.И. Беликов, Ю.П. Джиоев и др. - Иркутск, 2003 - 271 с.
3. Генетические различия восточноевропейской и азиатской популяций вируса клещевого энцефалита сибирского подтипа / Л.С. Карань, В.В. Погодина, Т.В. Фролова и др. // Бюл. Сибирской медицины, 2006.
— Приложение 1. — С. 24-27.
4. Сибирский и дальневосточный подтипы вируса клещевого энцефалита в европейских и азиатских регионах России: генетическая и антигенная характеристика штаммов / В.В. Погодина, Н.Г. Бочкова, Л.С. Карань и др. // Вопросы вирусологии. — 2004. — №4.
- С. 20-25.
5. Phylogeny of Omsk hemorrhagic fever virus / L.S. Karan, V.V. Yakimenko, A.E. Platonov, et al. // Abstracts of 4th International Conferences on Emerging Zoonoses. Ames, USA, September 18-21, 2003. - P. 94.
УДК 576.856.25 (571.14)
В.Н. Бахвалова, О.В. Морозова, И.В. Морозов
СВОЙСТВА ПОПУЛЯЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА, ЦИРКУЛИРОВАВШЕЙ В 1980-2006 гг. НА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ
Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
Анализ штаммов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), выделенных от таежных клещей в Новосибирской области в 1980-2006 гг., показал периодические изменения гемагглютиниру-ющих свойств и нейровирулентности. Скрининг полноразмерных геномов 79 штаммов ВКЭ посредством молекулярной гибридизации вирусных РНК с радиоактивномечеными олиго-дезоксирибонуклеотидными зондами выявил высокую консервативность гена Е, внутренних кодирующих областей структурных генов С и ргМ, а также первых 14 н.о. 5'-нетраслируемой области (иТИ.) и фрагментов 3'иТ11. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5'-концевого фрагмента гена Е и выведенных аминокислотных последовательностей Ы-конца белка Е подтвердил их стабильность во времени. Одним из наиболее вариабельных районов вирусного генома оказалась З'иТЯ. Отличия нуклеотидных последовательностей обнаружены не только для разных штаммов, но и для одного штамма ВКЭ. Таким образом, периодические изменения нейровирулентности и гемагглютинирующих свойств штаммов ВКЭ во времени не могли быть обусловлены изменениями очень консервативного белка Е и «пептида слияния», в частности. Возможна вариабельность репродуктивных свойств вируса, обусловленная не высококонсервативной структурой репликативного комплекса ВКЭ, включающего вирусные белки и N53, а обнаруженной гетерогенностью 3'иТ11.
Ключевые слова: клещевой энцефалит, популяция вируса клещевого энцефалита
Для геномов РНК-содержащих «квазивидов» вирусов характерна насыщенность мутациями, обусловленная отсутствием систем репарации РНК, и РНК-азами [1, 2]. Для большинства известных вирусов геномы состоят из относительно консервативных модулей генов, ответственных за хранение и реализацию генетической информации, и более изменчивых генов белков вирио-нов и белков, обеспечивающих взаимодействие с хозяйскими клетками [3]. РНК-содержащие флавивирусы, к которым относится вирус клещевого энцефалита (ВКЭ), являются исключением. Поверхностный гликопротеин оболочки вирио-нов Е, обеспечивающий проникновение вирио-нов в клетки и опосредующий взаимодействие с иммунной системой организма хозяина, чрезвычайно стабилен в природных популяциях флави-вирусов и не подвержен антигенным изменениям в течение нескольких десятков лет в условиях прерывистого ареала обитания определенного вида [4].
Вместе с тем, природные популяции ВКЭ существуют в неразрывной связи с другими компонентами паразитарной системы клещевого энцефалита (переносчики и теплокровные животные),
для которых характерны периодические изменения по ходу популяционных циклов [5]. При взаимодействии вирусных популяций с популяциями хозяев у многих арбовирусов наблюдается динамический полиморфизм, сущность которого заключается в циклических изменениях состава, численности и свойств популяции, отражающихся в циклической изменчивости эпизоотических и эпидемических ситуаций [1]. Заболеваемость людей КЭ также изменяется циклически [6]. Межгодовые колебания показателей заболеваемости традиционно связывают, прежде всего, с динамикой обилия и зараженности ВКЭ иксодо-вых клещей. Однако, по данным многолетнего мониторинга природного очага КЭ в Новосибирской области, осуществляемого с 1980 года [7], а также по данным других авторов [8], эти показатели мало влияют на уровень заболеваемости людей. Объяснить отсутствие такой связи можно, скорее всего, тем, что показатели вирусофорности не отражают ни концентрации возбудителя в инфицированных особях, ни его свойств.
В настоящей работе исследованы гемагглюти-нирующая активность, нейровирулентность и генетическая структура штаммов ВКЭ, выделенных
от клещей на территории Новосибирской области с 1980 по 2006 гг., для оценки временной изменчивости природной популяции вируса и возможной ее связи с заболеваемостью людей.
Материалы и методы
Штаммы ВКЭ выделяли от имаго таежного клеща Ixodes persulcatus Schulze, собранных с растительности в антропургическом природном очаге на территории северной лесостепи Приобья, в основном в лесопарковой зоне Новосибирского научного центра (ННЦ). Выделение ВКЭ проводили методом биопробы на мышах с идентификацией в реакциях торможения гемагглютинации и биологической нейтрализации [7], хранили при (-20 °С) или (-40 °С), поддерживали ежегодным пассированием через мозг белых беспородных мышей.
Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. №755).»
Гемагглютинирующую активность штаммов ВКЭ определяли в реакции гемагглютинации (РГА) с гусиными эритроцитами для 10% антигенов, приготовленных на боратном буфере pH 9,0 из свежего головного мозга биопробных мышей на высоте клинического проявления КЭ. Очистку антигенов для РГА проводили протаминсульфа-том. Постановку РГА осуществляли, как описано ранее [7]. Проанализированы гемагглютинирую-щие свойства 241 свеже-выделенного штамма на уровне первого пассажа.
Нейровирулентность исследовали на белых беспородных мышах весом 6-8 г. Животных заражали в мозг и подкожно (0,03 и 0,25 мл соответственно) серией десятикратных разведений 10% суспензии мозга больных белых мышей. Титр вируса определяли по методу Кербера в модификации Ашмарина и выражали в lgLD5Q. Индекс инва-зивности вычисляли как отношение средних инфекционных титров при подкожном и внут-римозговом заражении. Нейровирулентность изучена для 40 штаммов
на уровне 9 пассажа.
Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (МГНК), РНК выделяли из 10% мозговых суспензий мышей, зараженных штаммами ВКЭ, методом БОБ-фенольной депротеиниза-ции с последующим осаждением изопропанолом [9]. Суммарную РНК, выделенную из мозговой суспензии больных мышей, растворяли в 20 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0 с 7% формальдегидом, прогревали 15 мин при 56 °С и наносили по 2 мкг в одну точку на нитроцеллюлозные фильтры. Для иммобилизации РНК фильтры облучали ультрафиолетовым светом на расстоянии 4 см от бактерицидной ультрафиолетовой лампы в течение 10 мин. Количества вирусных РНК, нанесенных на фильтры, оценивали при помощи гибридизации с полинуклеотидным зондом, соответствующим фрагменту гена Е.
МГНК проводили, как описано ранее [9]. В качестве зондов использовали радиоактивноме-ченые олигонуклеотиды, соответствующие вариабельным участкам генома дальневосточного высоковирулентного штамма Софьин из 5'- и 3'-некодирующих областей (ЦЩ) и генов генов С, ргМ,М, £,N81, ^2ЬиК54Ь, или продукт ОТ-ПЦР гена Е длиной 1055 н.п. Олигонуклеотидные зонды (Таблица 1) были синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и радиоактивно мечены по 5'-кон-цу с использванием полинуклеотидкиназы фага Т4 и [у- 32Р]-АТР (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
Таблица 1
Структура и локализация в геноме ВКЭ олигонуклеотидных зондов
для МГНК
Название зонда Структура (5'-3') Область генома Локализация в геноме ВКЭ
5'UTR-14 AGAUUUUCUUGCACGUGCAUG 5'-UTR 1 - 14
С1 GCCGGGAAGGCCATTCTG С 134- 151
С100 ATGCCAAATGGACTCGTGTTT С 227 - 247
П10 CAGACCTACCATCAGGGT С 379 - 396 [9]
С2 TCCCAACAGGACAACAACC С 448 - 466
Ш1 CGTCAACCGGTTCCTCCCCC ргМ 642 - 661 [9]
Ш2 CATTCCTGCAAGAGCAATCC ргМ 663 - 682 [9]
ШЗ TCCAGACCCATCCCTCAACT M 837 - 856 [9]
Ш4 TTGCCCCAGCCTCGATCACT Е 1258- 1277 [9]
Ш5 CACAATGCTGCCTTTTCCAAATAATCC Е 1285- 1311 [9]
П2 GTCCACAGCACAGCCAAC NS1 2461 - 2478 [9]
Х2 CCATCCGTTCAGTGTCCA NS1 2474 - 2491 [9]
П31 GCACGTTCGGCAGCACCA NS1 3391 -3408 [9]
П131 CCTTGTCCCTAGCACCAGCA NS2b 4322-4341 [9]
П5 TCCCCAAGAACGTGCAGG NS4b 7015 - 7032 [9]
3'UTRd GAGTCCAAACTGGAGAGCTC З'-UTR 10346 - 10365
Олиго(<1Т) TTITTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT З'-UTR неизвестна
3'UTRr ATGTTCCCGTCGCCACTCTC З'-UTR 10466- 10485 [10]
Предгибрндизацию проводили в растворе 6xSSC, 20 шМ NaH.PO,, 0,4% SDS, 5х растворе Дэнхардта, 100 мкг/мл ДНК тимуса теленка при 37 °С в течение 2 часов. Гибридизацию проводили в растворе, содержащем 6xSSC, 20 шМ NaH2P04, 0,8% SDS, 100 мкг/мл ДНК тимуса теленка и радиоактивномеченый олнгонуклео-тидный зонд при 37 "С в течение ночи. После 4-кратного промывания по 15 мин. раствором GxSSC, 0,1% SDS при комнатной температуре с покачиванием, фильтры высушивали и проводили авторадиографию. Результаты МГНК учитывали визуально по радиоавтографу, посредством сканирования при помощи Molecular Imager FX-PRO Plus (Bio-Rad, США) с последующей количественной оценкой радиоактивности с использованием программы Quantity One версии 4.2.3 или просчетом радиоактивности в жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack Beta (LKB, Швеция). Консервативность локуса вирусного генома оценивали по относительному содержанию положительных результатов гибридизации вирусных РНК с соответствующим зондом среди общего числа исследованных штаммов, выраженному в процентах. Методом МГНК были исследованы РНК 79 штаммов ВКЭ на уровне 2—14 пассажей.
Обратную транскрипцию — полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) проводили с прай-мерами, соответствующими гену Е [11| и 3'-нетранслируемой области (3'UTR) 3'UTRd и 3'UTRr (Таблица 1). Продукты ПЦР очищали гель-фильтрацией с использованием Sephadex G-75 (Pharmacia, Швеция) в микроколонке длиной 60 мм и диаметром 2 мм. Анализ продуктов реакции Сэигера проводили с использованием автоматического анализатора ДНК модели ABI
310 (Applied Biosystems, США). Нуклеотндные последовательности продуктов ПЦР были определены для 15 штаммов ВКЭ и зарегистрированы в базе данных GenBank (номера доступа в базе данных GenBank DQ473396-DQ473404).
Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с [ 12J.
Результаты и обсуждение
Показатели заболеваемости людей КЭ в Западной Сибири одни из самых высоких по России [6]. В районе наших исследований показатели заболеваемости КЭ варьировали в 1980-2006 гг. от 0,8 до 60,7 чел. на 100 тыс. населения. В течение периода наблюдений в динамике заболеваемости было отмечено два пика (1981 г. и 1992 г.) с показателями 47,7 и 60,7 случаев на 100 тыс. населения соответственно. В 2006 году по сравнению с предыдущими годами роста заболеваемости не зарегистрировано, однако мониторинг паразитарной системы КЭ выявил резкое усиление интенсивности эпизоотического процесса в очаге, обычно наблюдаемое за год до максимума заболеваемости.
В результате проведения мониторинга природного очага в период с 1980 по 2006 гг. создана коллекция, насчитывающая в настоящее время более 300 штаммов ВКЭ, выделенных от имаго таежного клеща Ixodes persulcatus Schulze. Данные по гемагглютинирующей активности штаммов были частично проанализированы и опубликованы ранее |7]. Итоговый анализ гемагглютинирующей активности свежевыделенных штаммов показал, что на уровне первого пассажа штаммы характеризовались выраженной гетерогенностью: титры гемагглютининов варьировали от 1:20 до 1:1280. При этом среднем ноголетиее распределение штаммов по признаку гемагглютинирующей активности (Рис. 1) соответствовало нормальному
Обратные величины титрсв гемагглютининов
Рис
1. Распределение изолятов вируса клещевого энцефалита по величине титров гемагглютининов в годы разной заболеваемости людей клещевым энцефалитом (* -Р<0,05)
симметричному распределению биологических признаков [12] — около 70% изолятов равномерно распределялось по группам с титрами 1:80, 1:160, 1:320, а штаммы с титрами 1:40 и 1:640 составляли две примерно одинаковые группы, вдвое меньше (р<0,01) каждой из предыдущих (12,2±2,1 и 9,7±1,9%). Крайние группы, включающие штаммы с титрами 1:20 и 1:1280, наиболее малочисленны (3,8+1,2 и 2,5+1,0% соответственно). Анализ межгодовой динамики структуры вирусной популяции по гемагглютинирующим свойствам с помощью критерия х2 выявил достоверные (Р<0,05) отличия распределения изолятов в отдельные годы от суммарного среднемноголетнего.
Характер распределения штаммов по величине титров гемагглютининов отражается в средней геометрической их титра (СГТ). Обратные значения СГТ в обследуемой популяции варьировали по годам от 93 до 631, составив в среднем 139,0±16,7. В большинство эпидсезонов колебания СГТ были небольшими по амплитуде относительно среднемноголетнего значения, варьировали от 93 до199, суммарно за эти годы СГТ штаммов составляла 127,4+13,6. В отдельные годы, когда отмечались максимумы эпидемического проявления (1981,1992 гг.) или резкого усиления эпизоотической активности очага (2006 г.) годовые значения СГТ заметно превышали сред-немноголетний уровень, достигая 631,0 в 1992 г. СГТ гемагглютининов штаммов, выделенных в эти три года, составила 325,5±99,2, а распределение штаммов по величине титров было асси-метричным с достоверным (р<0,05) сдвигом в область титров 1:320 — 1:1280 (Рис. 1); для более половины всех изолятов (66,6±9,8%) регистрировали высокие титры гемагглютининов > 1:320, в то время как в остальные годы доля таких изолятов была значимо (р<0,001) меньше — 33,6±3,2%. Таким образом, гемагглютинирующая активность природной популяции ВКЭ претерпевала периодические изменения. Кросс-корреляцион-ный анализ показал, что гемагглютинирующая активность штаммов ВКЭ, изолированных от половозрелых особей таежного клеща, изменялась синхронно и однонаправлено с заболеваемостью людей в районе наших исследований, коэффициент корреляции составил 0,63 (Р<0,01).
Нейровирулентность изучена для 40 штаммов из лабораторной коллекции, выделенных от клещей в 1981-1985 гг. Согласно данным литературы [13], стабилизация нейровирулентных свойств ВКЭ происходит на уровне 5-7 пассажей, поэтому для исследования были выбраны штаммы не ниже этого уровня. Перед титрованием штаммы освежали посредством пассажей через мозг мышей и исследовали на уровне 9 пассажа.
Титрование выявило, что при внутримозго-вом заражении показатели вирулентности штаммов варьировали в пределах 5,8-8,5 ^ЬО50, при подкожном — 2,7-7,0 ^ЕОдо, индекс инвазивнос-ти (ИИ) изменялся в пределах 0,3-4,3. Средние величины титров составили при церебральной инокуляции 7,1 ±0,1 при периферичес-
кой — 5,2+0,16 средний показатель ИИ
— 1,9+4,3. Сравнение внутримозговых и периферических титров по величине коэффициента вариации (СУ) [12] показало, что периферические титры более изменчивы, чем внутримозговые
— СУ первых (19,8%) в 2,2 раза выше СУ вторых (9,2%). Наименьшей однородностью характеризовался ИИ, СУ которого достиг 46,2%.
Достоверных межгодовых различий нейро-вирулентности штаммов не обнаружено. Однако выявлено, что в год максимальной заболеваемости (1981 г.) по сравнению со всеми остальными годами усредненные величины внутримозговых титров (7,6+0,26 и 7,0±0,11 соот-
ветственно) и периферических (6,0±0,23 1йПХ0 и 5,0±0,16 1§ГБ50 соответственно) были заметно выше. Примечательно, что усредненные величины ИИ достоверно не различались по годам, но штаммы, выделенные в год максимума заболеваемости, судя по коэффициентам вариации ИИ, были существенно более однородны по нейроин-вазивности в сравнении с остальным периодом
— СУ ИИ составлял 18,7 и 61,4% соответственно.
Таким образом, из приведенных данных следует, что гемагглютинирующая активность и нейровирулентность штаммов ВКЭ периодически изменялись, что соответствовало изменениям заболеваемости людей. Для выяснения генетической изменчивости, детерминирующей наблюдаемые изменения биологических свойств, был проведен скрининг полноразмерных геномов штаммов ВКЭ посредством МГНК с олигонуклеотидными зондами, соответствующими вариабельным участкам генома ВКЭ -нетранслируемым областям, а также различным структурным и неструктурным генам (Таблица 1). Из 18 исследованных локусов наиболее консервативными для всех исследованных штаммов ВКЭ оказались фрагменты генов Е (зонды Ш4 и Ш5); С (зонд С100); ргМ (зонд Ш1); М (зонд ШЗ) и нетранслируемых областей: первые 14 н.о. геномных РНК (зонд 5'иТ11-14), зонды олиго(с1Т) и 3'иТ11г (Рис. 2). Зонды П2, П5, П31 и П131, соответствующие неструктурным генам ВКЭ, гибридизовались с РНК 81-90% штаммов, для зонда Ш2 (ген ргМ) доля положительных ответов составила 73,3±8,2%. Зонды С1 и С2, соответствующие началу и концу гена С, реагировали с 44,9± 7,2% и с 61,2+7,0% штаммов соответственно, а зонд З'иТИс! — с 58,3+7,2%
Рис. 2. Результаты гибридизации олигонуклеотидов с западносибирскими штаммами вируса клещевого энцефалита
штаммов. Необходимо отметить отличие всех исследованных сибирских штаммов от дальневосточного штамма Софьин в районах зондов 1110 (379-396 и.о. гена С) и Х2 (2474 - 2491 и.о. гена NS1).
Относительное количество положительных результатов M ГНК для штаммов, выделенных в год с максимальной заболеваемостью (60,7 чел. на 100 тыс. населения), составило 90,0±4,3%, что достоверно (р<0,05) превышало аналогичный показатель (78,4±3,0%) для штаммов, изолированных в годы с заболеваемостью в 3-5 раз меньше. При этом в годы максимальной заболеваемости людей достоверно преобладали штаммы, которые гибридизовались со всеми зондами (Рис. 3). Следовательно, в период максимальной заболеваемости людей по сравнению с остальными годами для геномов штаммов ВКЭ выявлена более высокая гомология с РНК высоковирулентного штамма Софьин. В этой связи следует отметить данные В.А. Шаманина |9|, обнаружившего посредством M ГНК, что штаммы, выделенные от больных, несмотря на принадлежность к различным генотипам, отличались наиболее близким генетическим родством со штаммом Софьин.
Поверхностный гликопротеин оболочки вири-оиов Е обеспечивает прикрепление и проникновение вирионов в клетки и является антигеном и нммуногеном флавивпрусов. Слияние вирусной и клеточной мембран, а также агглютинация эритроцитов опосредуются «пептидом слияния», рас-
положенном между 98 и 110 аминокислотными остатками домена 2 белка Е ВКЭ [14|. Участки, ответственные за вирулентность, расположены не только в различных районах белка Е, но и в других транслируемых и нетранслируемых областях генома [15]. Поскольку результаты МГНК показали консервативность 5'-концевой области гена Е (зонды ШЗ и Ш4) для штаммов ВКЭ, отличающихся по гемагглютиннрующей активности и нейровпрулентности, то для детального анализа были определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена Е, кодирующего домены I и II [15] соответствующего белка с участками.
90 g 80 |s70 ||б0 |S50 m ¡40
О ад
¡230
|320
3? 10
¿m
: -й
m
^00■^Ь^C• дОО ^
Заболеваемость людей Рис. 3. Различия степени гомологии геномов штаммов ВКЭ в годы максимальной и минимальной заболеваемости населения КЭ (по результатам молекулярной гибридизации геномных РНК, * -р<0,01)
штамм 1252 штамм 1508 штамм 1937 штамм 311 штамм 766 штамм 1587 штамм 1618 штамм 2232 штамм 2237 штамм 2271 Aina/1448 Neudoerf1 Glybinnoe/2004 205 Sofj in
(1983 год) GATCGñGGCTGGGGCAACCñTTGCGGACTGTTTGGAAAG
(1984 год) GACCGAGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTGTTTGGAAAG
(1985 год) GACCGAGGCTGGGGCAATCACTGCGGACTGTTTGGAAAA
(1988 год) GACCGGGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTGTTTGGAAAG
(1992 год) GACCGAGGCTGGGGCAACCACTGCGGACTGTTTGGAAAG
(2000 год) GACCGAGGCTGGGGCAACCñCTGCGGACTGTTTGGAAAG
(2000 год) GATCGAGGCTGGGGCAACCACTGCGGACTGTTTGGAAAG
(2006 год) GACCGGGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTGTTTGGAAAG
(2006 год) GACCGAGGCTGGGGCAACCACTGCGGACTGTTTGGAAAG
(2 00 6 год) GACCGAGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTGTTTGGAAAG
(1963 год) GACCGAGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTGTTTGGAAAG GATCGAGGCTGGGGCAACCACTGTGGACTGTTTGGAAAG
(2004 год) GATCGAGGTTGGGGTAATCATTGTGGATTATTTGGAAAA (1973 год) GATCGAGGCTGGGGTAATCATTGTGGATTATTTGGAAAA (1937 год) GATCGAGGCTGGGGCAACCATTGTGGATTATTTGGAAAA
Рис. 4. Выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е, кодирующего «пептид слияния»-, для штаммов ВКЭ Новосибирской обл. (штаммы 1252, 1508, 1937,311, 766,1587, 1618, 2232,2237,2271), штамма Ата/1448 сибирского генетического типа, штамма №ийоегА западноевропейского генетического типа, штаммов 205 и Бо^т дальневосточного генетического типа и штамма ауЫппое/2004.
Примечание. В скобках указан год выделения штамма
ответственными за гемагглютинацию, нейрови-рулентность и нейроинвазивность.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей продуктов ОТ-ПЦР показал отличия фрагмента гена Е, кодирующего «пептид слияния», сибирских штаммов от штаммов дальневосточного и западноевропейского генетических типов по 10 из 39 нуклеотидных остатков (Рис. 4). Однако, несмотря на отличия нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е, все 13 аминокислотных остатков белка Е (позиции 98-110), кодирующие «пептид слияния» В11С'\\ГСМНССЕРСК, оказались абсолютно консервативными из-за вырождености генетического кода. Известно, что уровень гомологии белка Е составляет 93-96% среди различных штаммов одного вида — ВКЭ и 36-42% для различных видов флавивирусов [16]. Высокая консервативность белка Е для штаммов сибирского генетического типа была нами показана ранее как посредством сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Е и выведенных первичных структур этого белка, так и на основании иммуноферментного анализа с панелью моноклональных антител против гликопротеина Е [17]. Анализ антигенной структуры белка Е западноевропейских штаммов ВКЭ с МКА также не выявил никаких изменений в течение 14-лет-него периода в пределах одной изолированной популяции и в различных природных очагах [4]. Следовательно, наблюдаемые периодические изменения гемагглютинирующих свойств штаммов ВКЭ обусловлены, вероятно, количеством вири-
онов, а не качественным изменением «пептид слияния».
Одной из наиболее вариабельных облаете; вирусного генома, по данным МГНК, оказалас З'-UTR. Результаты ОТ-ПЦР с праймерами, со ответствующими относительно консервативны! участкам вблизи З'-конца геномной РНК, по казали гетерогенность анализируемого участк по длине от 100 до 400 н.о. для разных штаммо ВКЭ. Короткие олиго(А)-фрагменты длино] 2-6 н.о. диффузно распределены по всей длин весьма вариабельной по первичной структур 3'UTR и гибридизуются с олиго(с1Т) зондамг Необходимо отметить наличие гетерогенност] 3'UTR для одного штамма ВКЭ, что подтверж дается наличием продуктов ОТ-ПЦР с разным] длинами (данные не представлены) [10]. Анали нуклеотидных последовательностей продукта ОТ-ПЦР как гена Е, так и 3'UTR позволил от нести все исследованные штаммы к сибирском; генетическому типу [2, 17]. Кроме того, на осно вании гомологии 3'UTR выявлены, по крайне] мере, 2 группы штаммов, относящихся к сибир скому генетическому типу, одна из которых го мологична ранее известным штаммам, относя щимся ко всем 3 известным генетическим типаг ВКЭ (Рис. 5А), а вторая группа включает штам мы с отличающейся 3'UTR (Рис. 5В). Штам! 1252 нельзя отнести ни к одной из указанны: групп. Наблюдалась тенденция для штаммо ВКЭ с длинной З'-UTR, не содержащей делеций к уменьшению длительности инкубационноп периода. Приведенные результаты опровергаю распространенное мнение о «дрейфе»генов и i повышенной вариабельности структурных гено! по сравнению с неструктурными генами у РНК содержащих вирусов [3].
Таким образом, полученные данные позво ляют заключить, что биологические свойств, природной популяции ВКЭ претерпевают перио дические изменения, отражающиеся на заболева емости людей. Вместе с тем, изменения гемагглю тинирующей активности и нейровируленгност] ВКЭ не могут быть обусловлены изменениям] структуры очень консервативного гликопротеин, оболочки вирионов Е и «пептида слияния» [14]; отдельных штаммов. Нельзя исключить, что ко лебания биологической активности вируса воз можно связаны с изменениями количеств вири онов. Изменчивость репродуктивной активност] вируса может быть обусловлена комплексом фак торов, включающих и обнаруженную нами гете рогенность 3'UTR-y4acTKa вирусного генома.
5А
1937 (1985, DQ473404)
159 (1988, DQ473396)
766 (1992, DQ473399)
Oshima 5-10 (AB049390)
Oshima_I-l (ABO 4 9 391)
Oahim* A-l (AB049392)
VL99-mll (ABO 4 9393)
КЯ98-2 (ABO 4 9394)
КН98-5 (ABO 4 939 5)
КН98-10 (AB049396)
IR99-lml (AB049397)
IR99-lm4 (AB049398)
IR99-2m7 (AB049399)
IR99-2f13 (AB049400)
Sofjin-HO (ABO 4 9401)
Vasilchenko (L40361)
Sofjin (У088 6 3)
132 (TEU27490)
Neudoerfl (TEU27495)
Hypr (TEU39292)
consensus
-----------ТТТАААСА- • -----GT-AT- • -А- • TTG----
•-СС-----ААТ•С•А•GCC•С•--GA•-AT-•-А-••TG----
• - СС-----ААТ • S • A- GCCRC---GR • • АК • • • А • S • TG—S •
................Т- - -G.......................
................Т- • -G.......................
................Т- • -G.......................
•G 1252 (1982, DQ473400)
•G 1508 (1984, DQ473401)
•G 1629 (1984, DQ473403)
•G 163 (1988, DQ473397)
•G 311 (1988, DQ473398)
•G 2232 (2006)
consensus
1508 (1984, DQ473401)
1629 (1984, DQ473403)
163 (1988, DQ473397)
311 (1988, DQ473398)
1252 (1982, DQ473400)
2232 (2006)
-AAA • • - А А АА А А АААА ААС А • • • С.................Т.......
АААА • • • AA AA A AAAAAAA • С • • • С........-.7.. дтТ.........
• • • • С • GA - С • • Т • А • • • • Т • • GG • • TG.....А......ATT......G
• • • • С • GATC • • Т • А • • • ■ т • • GGG • TG.....А......ATT......G
ggggaaagctggccgggggagaaaaacacccccggagtgccccacggcaa
1937 (1985, DQ473404) -G-159 (1988, DQ473396) -G-766 (1992, DQ473399) -G-
CG-----------
• CG------------
• С • ССАТС •С-ССАТС •С-ССАТС
0shima_5-10
Oshima_I-l
Oshima_A-l
VL99-mll
KH98-2
KH98-5
KH98-10
IR99-lml
IR99-lm4
IR99-2m7
IR99-2f13
Sofjin-HO
Vasilchenko
Sofjin
132
Neudoerfl Hypr
(AB049390)
(ABO 4 9391)
(AB049392)
(ABO 4 9393)
(AB049394)
(AB049395)
(AB049396)
(AB04 93 97)
(AB049398)
(ABO 4 9399)
(AB049400)
(AB049401)
(L40361)
(YQ8863)
(TEU27490)
(TEU27495)
(TEU39292)
consensus
cacgtcagtgagagtggcgacgggaaaatggtcgatcccgacgtagggca
163 311
tttaaacaaaaaagccagaattgagctgaacctggagggctcattaaaca
•CCG•-C•-G-GGA-G
consensus ttgtccagacaaaacaaaacagacatgacacccccagagtgcactacggc
1508 (1984, DQ473401) 1629 (1984, DQ4734 03) (1988, DQ4733 97) (1988, DQ473398) 1252 (1982, DQ473400) 2232 (2006)
consensus
GGG-A--TG-
aacacgccagt
1937 (1985, DQ473404) 159 (1988, DQ473396) 766 (1992, DQ473399) (AB049390) (AB049391) (AB049392) (AB049393) (AB049394) (AB049395) (AB049396) (ABO 4 9 397) (AB049398) (AB049399) (ABO 4 94 00) (AB049401) (L40361) (У08863) (TEU27490) (TEU27495) (TEU392 92) consensus
• ATGAA • • • • С • • • • С...........CCGG • • • - • TAG •
• ATGAA • • • • С • • • • С...........CCGG - - - - • TGG • •
• AYGAA - T- -C-S--C...........CCGR • • - - • TGG • •
......--C............................T- • •
......—C............................T- • •
......--C............................T- • •
......--C................................
......--C................................
......--C.................T..............
......--C............................T- ■ •
.....C--...................T- • -T.........
•AC----
•----C-
ctctgtgcaaaactttgtgagacccccggcaccatgacaaggccgaacat
, DQ473404) ••-CAGG-GT-AAAA-ACA-•••CAG••TGCA•■G•G•CA•CAC•CC•GT
, DQ473396) • ••CRGG•GT•AAA---CA-• •-CAG--TGCA- •ATG•CA•CAC•CC•GT
, DQ473399) • ••CAGR•GT•ARA---CR•• ••CARR•AG-AGGR•G-
(ABO4 9390) .......A- .....................С...................
(AB049391) .......A- -A...................С...................
(AB049392) .......A- .....................С...................
(AB049393) ..........-.......................................
(AB049394) ..........-.......................................
(AB049395) ..........-.......................................
(AB049396) ..........-.......................................
(ABO 4 9397) -A- •• •С • • • •-......................................
(ABO49398) -A - • • - C- • - A-..................A...................
(ABO49399) -A- • • -C- • -A-..................A...................
(AB049400) -A- •• •С• •••-......................................
(AB049401) ..........-.......................................
(L40361) -A-- ••C-• .........................................
(Y08863) ..........-.......................................
(TEU27 4 90) .........TAG......................................
(TEU27495) ......T- • -AG......................................
(TEU39292) ......T- • • AA................T-C...................
consensus ggtgcaagaagcgggaggrccccggaagcatgcttccgggaggagggaag
Рис. 5. Выравнивание нуклеотидных последовательностей вариабельного участка З'иТК для штаммов ВКЭ Новосибирской обл. В скобках указан год выделения штамма
Работа поддержана междисциплинарным интеграционным грантом №19 СО РАН и грантом РФФИ 04-04-48545-а.
Данные о заболеваемости людей в ННЦ, любезно предоставлены сотрудниками эпидемиологической службы территориального отдела Управления Роспотребнадзора по Новосибирской области.
PROPERTIES OF THE TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS POPULATION IN NOVOSIBIRSK REGION DURING PERIOD 1980-2006 YEARS"
V. N. Bakhvalova, O.V. Morozova, I.V. Morozov
Analysis of the tick-borne encephalitis virus (TBEV) strains isolated from Ixodes persulcatus ticks in Novosibirsk region during period 1980-2006 years, revealed periodical changes of their hemagglutination properties and neuroinvasiveness. Screening of the TBEV full-length genomes of 79 strains by means of molecular hybridization of the viral RNA with radioactive oligonucleotide probes demonstrated high levels of homology of the TBEV E gene, internal coding regions of the structural genes С and M, as well as the first 14 nucleotides of 5'-untranslated region (UTR) and fragments of 3'UTR. Comparative analysis of the TBEV 5'-terminal E gene fragment nucleotide sequences confirmed their temporal stability. One of the most variable areas of the TBEV genome appeared to be 3'UTR. Variations of the 3'UTR variable fragment lengths from 100 to 400 nucleotides and a few groups of the nucleotide sequences were found. Thus, periodical changes of neurovirulence and hemagglutination could not be caused by the TBEV highly conservative E glycoprotein and its «fusion peptide»structural variations. Consequently, replication characteristics of the TBEV strains might differ because of the 3'UTR heterogeneity.
Литература
1. Цилинский, Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов / Я.Я. Цилинский. — М., 1988. — 240 с.
2. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia / M. Ecker, S.L. Allison, T. Meixner, F.X. Heinz // Journal of General Virology. - 1999. - Vol. 80. - P. 179-185.
3. Koonin, E.V. Evolution and taxonomy of positive-strand RNA viruses: implications of comparative analysis of amino acid sequences / E.V. Koonin, V.V. Dolja // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. - 1993. - Vol. 28. - №5. - P. 375-430.
4. Guirackhoo, F. Evidence for antigenic stability of tick-borne encephalitis virus by the analysis of natural isolates / F. Guirackhoo, A.C. Radda, F.X. Heinz, C. Kunz. // Journal of General Virology. - 1987. - Vol. 68. -P. 859-864.
5. Наумов, Р.Л. Цикличность изменения элементов паразитарной системы очагов клещевого энцефалита / Р.Л. Наумов, В.В. Лабзин // Паразитологический сборник. - Л. - 1984. - С. 139-159.
6. Злобин, В.И. Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири / В.И. Злобин, О.З. Горин. — Новосибирск, 1996. — 177 с.
7. Динамика параметров паразитарной системы клещевого энцефалита в условиях северной лесостепи Приобья / А.К. Добротворский, В.Н. Бахвалова, Н.Н. Харитонова, В.Ф. Сапегина // Сибирский экологический журнал. - 1994. - Т. 1. - № 4. - С. 369-375.
8. Коренберг, Э.И. Основные черты эко-эпидемиоло-гии клещевого энцефалита / Э.И. Коренберг, Ю.В. Ковалевский //www.infectology.spb.ru (ISSN 1609-9877).
- 2004. - Vol. 18. - P. 133-137.
9. Шаманин, В.А. Применение молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолигонуклеоти-дами для дифференциации штаммов вируса клещевого энцефалита / В.А. Шаманин, А.Г. Плетнев, В.И. Злобин // Вопросы вирусологии. — 1990. — Т. 35. — №6. — С. 474-478.
10. Добрикова, Е.Ю. Полноразмерная ДНК-копия генома вируса клещевого энцефалита. I. Анализ 5'- и З'-концевых некодирующих областей генома /Е.Ю. Добрикова, А.Г. Плетнев // Биоорганическая химия.
- 1995. — Т. 21. — № 7. — С. 528-534.
11. Natural tick-borne encephalitis virus infection among wild small mammals in the South-Eastern part of Western Siberia, Russia / V.N. Bakhvalova, A.K. Dobrotvorsky, V.V. Panov, et al. // Vector-Borne and Zoonotic Diseases. - 2006. - Vol. 6. - № 1. - P. 32-41.
12. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. — М., 1974.
- 343 с.
13. Смородинцев, А.А. Клещевой энцефалит и его вакцинопрофилактика / А.А. Смородинцев, А.В. Дубов. - М„ 1986. - 229 с.
14. Heinz, F.X. The entry machinery of flaviviruses / F.X. Heinz, K. Stiasny, S.L. Allison // Arch. Virol. Suppl.
- 2004. - Vol. 18. - P. 133-137.
15. Леонова, Г.Н. Современный взгляд на молекулярные основы вирулентности флавивирусов / Г.Н. Леонова, Н.В. Кулакова, С.И. Беликов //Журнал микробиологии. Приложение. — 2006. — №3. — С. 103-109.
16. Pletnev, A.G. Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus / A.G. Pletnev, V.F. Yamshchikov, V.M. Blinov // Virology. - 1990. - Vol. 174. - P. 250-263.
17. Tick-borne encephalitis virus strains of Western Siberia / V.N. Bakhvalova, V.A. Rar, S.E. Tkachev, et al. // Virus Res. - 2000. - Vol. 70. - № 1-2. - P. 1-12.
