CC BY
57
acid-synthesizing mononuclear leukocytes. I. Increased numbers of proliferating mononuclear leukocytes in inflammatory disease // J. Lab. Clin. Med. - 1970. - Vol. 76. - P 391-402.
12. RomeisB. Mikroskopische Technik. - Munich, 1948.
13. RowlandsR. J., MichaudV., HeathL. et al. African swine fever virus isolate, Georgia // Emerg. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 14, N 12. - P. 1870-1874.
14. Simon M. W. The atypical lymphocyte // Int. Pediatr. - 2003. - Vol. 18, N 1.
15. WardleyR. C., WilkinsonP. J. The association ofAfrican swine fever virus with blood components of infected pigs // Arch. Virol. - 1977.
- Vol. 55. - P. 327-334.
16. WardleyR. C., WilkinsonP. J., HamiltonF. African swine fever virus replication in porcine lymphocytes // J. Gen. Virol. - 1977. - Vol. 37.
- P. 425-427.
Поступила 27.01.11
© Ж. С. ТЮЛЬКО, В. В. ЯКИМЕНКО, 2012 УДК 578.833.29:578.53].083.2
Ж. С. Тюлько1, В. В. Якименко2
Корреляция изменений, возникающих в отдельных участках сегментов генома хантавирусов
'ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия; 2ФГУН Омский НИИ природно-очаговых инфекций Роспотребнадзора
Изучали корреляции в изменениях нуклеотидной и аминокислотной последовательностей у хантавирусов генотипа Хантаан, происходящих в разных частых M- и S-сегментов. Корреляции выявляли путем сравнения замен в массивах выровненных нуклеотидных последовательностей сегментов. Были обнаружены ранее не выявленные корреляции замен нуклеотидов, локализующихся в разных (S, M) сегментах. наличие таких корреляций может быть результатом корреляции изменений в этих сегментах, возникающей из-за особенностей третичной структуры молекул вирусной РнК.
Ключевые слова: хантавирусы, Хантаан, нуклеотидные замены, корреляции
coordination of the changes in Some Sites of the Hantaviral Segments
Zh. S. Tyul’ko1 and V. V. Yakimenko2
1 Omsk State Medical Academy, Omsk, Russia; 2 Omsk Scientific-Research Institute of Natural Focal Infections, Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Omsk, Russia
correlation in the changes of the nucleotide and amino acid sequences at the hantaan virus occurring in different parts of S- and M-segments were studied. The correlation was analyzed using comparison of substitutions in aligned nucleic sequences of the segments. correlations of the nucleotide substitutions between S- and M-segments were observed. Probably, this coordination of the changes in both segments reflects features of the tertiary structure of RNA.
Key words: hantavirus, Hantaan, nucleotides substitutions, correlation
Хантавирусы, получившие название от вируса Хантаан, выделенного в Корее [12], образуют род Hantavirus в составе семейства Bunyaviridae. Установлено глобальное распространение хантавирусов. Природным резервуаром и переносчиками хантавирусов являются грызуны семейств мышиных (Muridae) и хомяковых (Cricetidae). Филогения хантавирусов, как правило, соответствует филогении хозяев-грызунов [14, 16].
Известны две клинические формы хантавирусной инфекции:
- геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) в Евразии. Такое название рекомендовано ВОЗ в 1982 г. [12] для единого обозначения всех заболеваний, сходных этиологически и клинически, чтобы устранить употребление многочисленных названий - синонимов этой нозологической формы (геморрагический нефрозонефрит, эпидемическая, корейская, тульская, ярославская, уральская геморрагические лихорадки, скандинавская эпидемическая
нефропатия). Возбудителями этой формы заболеваний являются хантавирусы Хантаан, Пуумала, Сеул и Добрава [14, 16].
- хантавирусный пульмонарный синдром (ХПС) в Северной и Южной Америке, вызываемый хан-тавирусами Нью-Йорк, Син Номбре, Блэк Крик Кэ-нал, Бае, Андес, Лагуна Негра и др. [9]. В отличие от ГЛПС в клинической картине ХПС основным является поражение легких (интерстициальная пневмония), сопровождающееся тяжелым течением болезни.
При развитии болезней, вызываемых этими вирусами, отмечен высокий процент летальных исходов для ГЛПС - 5-10, для ХПС - 40 [1, 9], что делает необходимым более тщательное изучение закономерностей строения и эволюции этих вирусов.
Хантавирусный геном, как и геном других бу-ньявирусов, представлен тремя сегментами одно-нитевой негативной РНК: L - большой, M - средний, S - малый, которые заключены в трех вну-
Контактная информация:
Тюлько Жанна Сергеевна, канд. биол. наук, ст. преподаватель; e-mail: tjs@omsk-osma.ru
31
тренних нуклеокапсидах, окруженных липидной оболочкой [14].
S-сегмент генома кодирует 2 белка, считываемые с перекрывающихся рамок трансляции в комплементарной последовательности длиной около 1800 нуклеотидов (далее н.). Структурный белок нуклеокапсида (N-белок) закодирован в основной рамке считывания. Вторая рамка считывания имеется только у вирусов, хозяевами которых являются грызуны подсемейств Arvicolinae и Sigmodontinae, и кодирует неструктурный белок [15].
M-сегмент генома (~ 3700 н.) последовательно кодирует в комплементарной последовательности структурные белки гликопротеинов G1, G2 и неструктурный белок [14].
L-сегмент (« 6550 н.) кодирует последовательность РНК-зависимой полимеразы вируса [11].
Последовательность белка нуклеокапсида ханта-вирусов включает чередующиеся консервативные и вариабельные участки с координатами, сохраняющимися у различных генотипов [2]. Такое постоянство координат консервативных участков, вероятно, объясняется одинаковыми основными функциями, которые они выполняют: взаимодействие с вирусными РНК и другими молекулами N-белков. Вариабельность других участков, возможно, связана с их адаптивной функцией к иммунной системе конкретного типа хозяев-грызунов [3].
Хотя трехмерная структура капсидного белка полностью не определена, он активно изучается с помощью различных косвенных методов. За последние 2 года появился ряд экспериментальных и теоретических работ, в которых исследуется как роль отдельных участков белка нуклеокапсида и гликопротеинов G1 и G2, так и ранее не известные функции этих белков, проявляющиеся в различных стадиях вирусного цикла. Например, есть сведения о кооперативном взаимодействии белка нуклеокап-сида с РНК-полимеразой хантавирусов Син Номбре [9], его специфических взаимодействиях с рибосо-мальным белком S19 [7], а также об особенностях взаимодействия белка нуклеокапсида с белками гликопротеинов G1, G2 [8] при формировании поверхностной мембраны вирусной частицы. Кроме того, появились данные о взаимодействиях белка нуклео-капсида в составе вирусного рибонуклеопротеина с комплексом гликопротеинов G1, G2 [8, 10]. Установлена возможность существования сайтов связывания белка нуклеокапсида с цитоплазматическим хвостом G1. Считается, что такая схема может быть общей для всех буньявирусов [8, 13].
Эти данные позволяют сделать вывод о большой сложности и многообразии взаимодействий между вирусными белками нуклеокапсида и белками гликопротеинов, которые выявляются в сходстве их эволюционных путей и скоростей накопления нуклеотидных замен [3] и должны отражаться в статистических закономерностях, обнаруживаемых при изучении хантавирусных генетических последовательностей. Дополнительный статистический анализ генетических последовательностей хантавирусов позволяет представить результаты изучения структуры вирусных белков, полученных различными косвенными методами, в более достоверной форме, что важно в связи со сложностью эксперименталь-
ного изучения данных процессов у хантавирусов [1]. При этом могут обнаруживаться корреляции в изменениях нуклеотидной или аминокислотной последовательностей вирусов, происходящих в разных частях сегмента или в двух различных сегментах. Так как механизмы этих изменений не ясны, должен быть введен критерий значимости выявляемых корреляций.
Материалы и методы
Объектами исследования являлись нуклеотидные последовательности малого и среднего сегментов генома хантавирусов генотипа Хантаан, полученные из банков данных (GenBank и EMBL). Коды доступа использованных последовательностей S- и M-сегментов (указаны в скобках для одних и тех же изоля-тов): D25530 (D25529); D25533 (D25532); U37768 (U37729); EU092220 (EU092224); AY017064
(AF345636); AF366568 (AF366569); AB027097
(AB027061); EF990915 (EF990929); EU092219
(EU092223); EF990910 (EF990924); EF990912
(EF990926); EF990913 (EF990927); EF990914
(EF990928); EU363812 (EU363815); EF990905
(EF990919); EF990906 (EF990920); EF990907
(EF990921); EF990904 (EF990918); EU092221
(EU092225); EU363810 (EU363814); EU363808
(EU363817); EU363811 (EU363816); EU363813
(EU363819); EU092218 (EU092222); EU363809
(EU363818); EF990909 (EF990923); EF990908
(EF990922); AB127998 (AB127995); AF329390
(AF035831); M14626(M14627);AB027108 (AF143675); AF288646 (AF288645); EF595840 (GQ120966);
AY839871 (EU074672).
Корреляции при изменении разных частей генетических последовательностей S- и M-сегментов выявляли путем сравнения нуклеотидных замен в массивах выровненных последовательностей [2, 4]. При сравнении символьных последовательностей в качестве меры подобия использовали значение взаимной информации - MJ [2, 4]. Удвоенное значение MJ распределено как случайная величина %2, что позволяет оценить вероятность случайной взаимосвязи двух символьных последовательностей в одном испытании и выбрать значение минимального уровня взаимной информации MJmin, обеспечивающее обнаружение статистически значимой взаимосвязи последовательностей с заданной вероятностью ошибки [2, 4].
Массивы выровненных нуклеотидных последовательностей каждого вирусного генотипа проверяли на наличие связанных между собой замен в столбцах с разными координатами, отсчитываемыми от первого нуклеотида в кодирующей части последовательности, оцениваемых по уровню взаимной информации [2, 4]. В результате для каждого столбца с номером i (отсчитываемым от начала последовательности) в массиве выровненных последовательностей был получен набор значений MJ^, характеризующий возможную связь между заменами нуклеотидов этой позиции и заменами во всех других позициях последовательности (рис. 1). Полученные значения MJij образуют двухмерную матрицу с размерностью L х L, где L - длина выровненных последовательностей. Кроме теоретических расчетов, проведен эксперимент по тестированию рассчитан-
32
j
Рис. 1. Схема поиска корреляций в столбцах выровненных нуклеотидных последовательностей при анализе замен нуклеотидов.
О
го
О
♦♦ ♦ £ * ♦ ♦
♦ ♦ ** ♦ 4»
♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦
трЬ^
|л|Ш
Zf
ных MJ в случайным образом сгене-
mm J г
рированном тексте.
Результаты
При анализе первичной структуры S-и M-сегментов генома хантавирусов генотипа Хантаан была получена картина распределения связанных между собой нуклеотидных замен, представленная на рис. 2. При этом статистически значимые связи наблюдали при возникновении как нуклеотидных замен внутри одного и того же сегмента, так и нуклеотидных замен, расположенных в разных сегментах (см. рис. 2, а, б). Полученное распределение корреляций при возникновении нуклеотидных замен внутри S-сегмента соответствует распределению корреляций, выявленному ранее при анализе меньшего числа нуклеотидных последовательностей [4]. Внутри M-сегмента отмечены также корреляции между заменами, локализующимися в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей G1, и заменами, возникающими в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин G2 (см. рис. 2, а). Корреляции между заменами нуклеотидов, расположенных в разных сегментах генома (S- и M-сегменты), обнаружены впервые и, вероятно, отражают согласованность изменений, происходящих в этих сегментах.
Обсуждение
X
Ч
S-сегмент G1 G2
б
М а.к.
1000^
800- • • •
600- • ' 0 • •
400- • . * • • • • • • 0 • •
200- • • • • • •
100 200 300 400
S а.к.
Рис. 2. Распределение обнаруженных корреляций вдоль нуклеотидных последовательностей сегментов (а).
Маркеры на схеме обозначают наличие значимых (MJ > 25) корреляций при возникновении замен в столбцах выровненных нуклеотидных последовательностей, координаты которых откладываются по горизонтальной и вертикальной оси соответственно. Прямоугольниками на осях отмечены участки, соответствующие S-сегменту, а также участки M-сегмента, кодирующие гликопротеины G1 и G2. Жирной штриховой линией отмечено положение участка M-сегмента, кодирующего последовательности домена, образованного цинковыми пальцами (Zf); распределение обнаруженных корреляций вдоль аминокислотных последовательностей S-сегмента (координаты по горизонтали) и M-сегмента (координаты по вертикали) (б). Пунктирная линия показывает границу между последовательностями гликопротеинов G1 и G2.
Возможностью согласованных изменений S- и M-сегментов генома хантавирусов генотипа Ханта-ан, выявленную в виде корреляций, наблюдаемых при возникновении нуклеотидных замен в отдельных участках первичных последовательностей этих сегментов, можно объяснить одинаковую скорость накопления нуклеотидных замен, приписываемую S- и M-сегментам генома хантавирусов [14]. Как показывают исследования, проведенные для хантавирусов генотипа Тула [8], центральная многофункциональная часть N-белка, соответствующая аминокислотам (далее а. к.) с номерами 80-248, отвечает за взаимодействие с цитоплазматической частью G1, которое необходимо для успешной самосборки вирусной частицы. В проведенном нами исследовании именно в этой части последовательности S-сегмента наблюдается наибольшее количество корреляций с последовательностью M-сегмента, кодирующей белок гликопротеина G1 (см. рис. 2, б).
33
Кроме того, аминокислоты N-белка с номерами 175196 а. к. обеспечивают специфичность распознавания вирусной РНК при связывании ее с N-белком [17]. Удаление их из последовательности не позволяет N-белку эффективно связываться с вирусной РНК. Поэтому можно предположить, что выявляемые корреляции нуклеотидных замен отражают особенности третичной структуры молекул РНК, необходимые для правильного пространственного расположения структур, используемых в распознавании.
Распределение корреляций внутри M-сегмента подтверждает эту точку зрения. Наибольшее число корреляций, обнаруженных внутри M-сегмента (см. рис. 2, а, б), приходится на нуклеотидную последовательность, кодирующую G1, и начало нуклеотидной последовательности, кодирующей G2. При этом участок в нуклеотидной последовательности G1, содержащий такой компактный домен, как комплекс двух цинковых пальцев, не взаимодействующих с РНК [6, 8], оказался свободным от наличия корреляций, в то время как сайты связывания с белком нуклеокапсида, между которыми он расположен, характеризуются наличием многочисленных корреляций (см. рис. 2, б). Классические цинковые пальцы в белках представляют собой РНК- и ДНК-связывающие домены, однако у хантавирусов более вероятным считается их участие в белок-белковых взаимодействиях. Предполагается также, что хвост нуклеотидной последовательности G1, кодирующий часть белка, соответствующую цинковым пальцам, важен при взаимодействиях типа хозяин-вирус [5, 6] и при самосборке вирусных частиц [6], обеспечивая формирование рибонуклеопротеино-вого комплекса.
Известно также, что конец последовательности G1 подвергается деградации, происходящей при связывании убикитина и протеолитическом расщеплении в случае хантавирусов, вызывающих патологию, что позволяет регулировать их активность в организме хозяина, в то время как у непатогенных вирусов он сохраняется и стабилен [6]. Именно на эту часть G1 приходится большинство корреляций, связывающих S- и M-сегменты, поэтому можно предположить, что механизмом такой регуляции является нарушение имеющейся схемы корреляций, которое приводит к менее эффективной продукции вирусных частиц.
ЛИТЕРАТУРА
1. Слонова Р. А. и др. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. - Владивосток, 2006.
2. Тюлько Ж. С., Якименко В. В. Изучение филогенетических отношений хантавирусов с применением метода вычисления взаимной информации (на примере Хантаан-подобных вирусов // Хантавирусы и хантавирусные инфекции. - Владивосток, 2003.
- С. 173-181.
3. Тюлько Ж. С., Якименко В. В. К вопросу о темпах эволюции хантавирусов генотипа Пуумала // Тихоокеан. мед. журн. - 2008.
- № 2. - С. 28-32.
4. Тюлько Ж. С., Якименко В. В. Связанные замены в малом сегменте генома хантавирусов Старого света // Вопр. вирусол. -2008. - № 3. - С. 28-34.
5. Alff P. J. et al. The NY-1 hantavirus Gn cytoplasmic tail coprecipitates TRAF3 and inhibits cellular interferon responses by disrupting TBK1-TRAF3 complex formation // J. Virol. - 2008. - Vol. 82. -P. 9115-9122.
6. EstradaD. F et al. The hantavirus glycoprotein G1 tail contains dual CCHC-type classical zinc fingers // J. Biol. Chem. - 2009. - Vol. 284. - P. 8654-8660.
7. Haque A., Mir M. A. Interaction of hantavirus nucleocapsid protein (N)with ribosomal protein S19 // J. Virol. - 2010. - Vol. 84, N 23. -P. 12450-12453.
8. Hepojoki J. et al. Cytoplasmic tails of hantavirus glycoproteins interact with the nucleocapsid protein // J. Gen. Virol. - 2010. - Vol. 91. - P. 2341-2350.
9. HjelleB., Torres-PerezF Hantaviruses in the Americas and their role as emerging pathogens // Viruses. - 2010. - Vol. 2. - P. 2559-2586.
10. Huiskonen J. T. et al. Electron cryo-tomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. - P. 4889-4897.
11. Kukkonen S. K. J., Vaheri A., Plyusnin A. Completion of the Tula hantavirus genome sequence: properties of the L segment and heterogeneity found in the 3’ termini of S and L genome RNAs // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol. 78. - P. 2615-2622.
12. Lee H. W., Lee P. W., Johnson K. M. Isolation of the Hantaan virus, etiological agent of Korean hemorrhagic fever // J. Infect. Dis. -1978. - Vol. 137. - P. 298-308.
13. Overby A. K., Pettersson R. F., Neve E. P. A. The glycoprotein cytoplasmic tail of uukuniemi virus (Bunyaviridae) interacts with ribonucleoproteins and is critical for genome packaging // J. Virol. -2007. - Vol. 81. - P. 3198-3205.
14. Plyusnin A. Genetics of hantaviruses: implications to taxonomy. Brief review // Arch. Virol. - 2002. - Vol. 147. - P. 665-682.
15. Plysnin A. et al. Transfection-mediated generation of functionally competent Tula hantavirus with recombinant S RNA segment // EMBO J. - 2002. - Vol. 21, N 6. - P. 1479-1503.
16. Sironen T., Vaheri A., Plysnin A. Molecular evolution of puumala hantavirus // J. Virol. - 2001. - Vol. 75, N 23. - P. 11803-11810.
17. XuX. et al. The RNA binding domain of the hantaan virus N protein maps to a central, conserved region // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, N 7. - P. 3301-3308.
Поступила 08.06.11
34
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 578.841.1.083.2
С. А. Бахвалов1, В. В. Мартемъянов1, В. Н. Бахвалова1, О. В. Морозова2
Детекция ДНК вируса ядерного полиэдроза в образцах из яиц и гусениц в разных фазах популяционной динамики непарного
шелкопряда Lymantria dispar (L.)
'ФГБУН Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск;
2ФГБУН Институт химической биологии и фундаментальной медицины, Новосибирск
ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) в образцах из яиц и гусениц непарного шелкопряда, собранных в природных популяциях западной Сибири и урала, детектировали с помощью ПЦР с праймерами, соответствующими гену полиэдрина. Согласно данным учетов численности, западносибирская популяция Lymantria dispar (L.) находилась в фазе депрессии. При этом частота детекции ДнК вяп в яйцах (8,6 ± 4,8-13,6 ± 5,2%) и гусеницах (21,0 ± 6,3-22,2 ± 6,7%) достоверно не различалась. На Урале сбор насекомых проводили в очаге их массового размножения в фазе максимальной численности. Частота детекции ДНК ВЯП в яйцах (11,4 ± 5,0%) была значимо (р < 0,001) меньше, чем в гусеницах (59,8 ± 5,6%). По-видимому, изменение уровней вирусоносительства в онтогенезе Lymantria dispar (L.) от яиц к гусеницам связано с градационным циклом популяционной динамики насекомого.
Ключевые слова: непарный шелкопряд, вирус ядерного полиэдроза, вирусоносительство у насекомых, трансовариальная передача вируса ядерного полиэдроза
Detection of the Nuclear Polyhedrosis Virus DNA in Samples from Eggs and Caterpillars at Different Stages of the Gypsy Moth Lymantria Dispar (L.) Population Dynamics
S. A. Bakhvalov1, V. V. Martemyanov1, V. N. Bakhvalova1, and O. V. Morozova2
1 Institute of Systematics and Ecology of Animals, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia; 2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Siberian Branch of the Russian Academy of
Sciences, Novosibirsk, Russia
The nuclear polyhedrosis virus (NPV) DNA was detected in samples from eggs and caterpillars of the gypsy moth collected in natural populations of the Western Siberia and Ural by means of PCR with primers corresponding to the polyhedrin gene. According to censuring data, the gypsy moth populations of Western Siberia were at the depression stage. The NPV DNA detection frequencies in eggs (8.6 ± 4.8% - 13.6 ± 5.2%) and caterpillars (21.0 ± 6.3% - 22.2 ± 6.7%) were not significantly differed. In the Urals, collection of the insects was performed in their gradation focus at the phase of maximal abundance. The DNA detection rate in eggs (11.4 ± 5.0%) was confidently (p < 0.001) lower than in caterpillars (59.8 ± 5.6%). Consequently, variations of the NPV infection prevalence during ontogenesis of Lymantria dispar (L.) was associated with the gradation cycle of the insect population dynamics.
Key words: gypsy moth, nuclear polyhedrosis virus, virus-carriage among insects, transovarial transmission of the nuclear polyhedrosis virus
На территории Северной Европы, Азии и Америки периодически наблюдаются вспышки массового размножения непарного шелкопряда с сильным объеданием лесных насаждений, чем наносится существенный вред лесному хозяйству и экологии регионов [1, 3, 6, 8]. В естественных популяциях непарного шелкопряда в период достижения ими критических значений плотности около половины особей являются носителями латентного вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) из семейства ДНК-содержащих бакуловирусов [4]. Бакуловирусы содержат геномную двухцепочечную кольцевую ДНК длиной более 160 тыс. п. н. (номера доступа в базе данных GenBank NC_001973 и AF081810 (длина 161046 п. н.).
Вирусоносительство во всех фазах развития насекомых с передачей вируса через яйца следующей генерации обеспечивает постоянство вирусной инфекции в поколениях насекомых и объясняет часто наблюдаемые в их популяциях одновременные заболевания полиэдрозом с гибелью большей части особей и деградацией очагов массового размножения на значительных территориях [2, 4, 5, 12].
Латентные бакуловирусные инфекции выявлены у многих видов насекомых [4, 11, 12, 18]. Они могут вызываться зрелыми вирионами и полиэдрами и посредством интеграции вирусного и клеточного геномов насекомого-хозяина [7, 10, 20]. Доказана способность вирусоносителей родительского поколения к передаче вирусов дочернему поколению насекомых через яйца [5, 10, 14, 15, 19]. Вопрос о том, насколько важна трансовальная (на поверхности хориона яйца) и трансовариальная (внутри яйца) вертикальная передача ВЯП для персистенции вирусной инфекции в популяциях насекомых, до настоящего времени является предметом исследований [4, 17, 19]. По нашим данным, вирусоносительство в ювенильных фазах развития насекомых и в фазе яйца обеспечивает постоянство вирусной инфекции в поколениях насекомых и тем самым оказывает большое влияние на динамику системы насекомое-вирус [4].
Ранее мы уже сообщали о выявлении ДНК ВЯП в яйцах и гусеницах непарного шелкопряда из различных очагов его массового размножения [5]. В продолжение этих работ мы исследовали яйцекладки и
Контактная информация:
Бахвалов Станислав Андреевич, д-р биол. наук, вед. науч. сотр.; e-mail: bahvalov60@list.ru
35
