Вариабельность генов, ассоциированных с бронхолегочной дисплазией и ретинопатией у недоношенных новорожденных Текст научной статьи по специальности «Медицинские науки и общественное здравоохранение»

УДК 577.21:575.174.015.3

вариабельность генов, ассоциированных с бронхолегочной дисплазией и ретинопатией у недоношенных новорожденных

Государственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси»

Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: o.malysheva@igc.by

Бронхолегочная дисплазия (БЛД) и ретинопатия недоношенных (РН) являются наиболее распространенными патологическими состояниями недоношенных новорожденных. Заболевания имеют многофакторную этиологию со значительным генетическим компонентом. У 59 недоношенных новорожденных срока гестации 28-36 недель с использованием полноэкзомного секвенирования (whole exome sequencing, WES) определен спектр из 376 нуклеотидных вариантов кодирующих областей 88 генов, ассоциированных с развитием БЛД и РН, из них 126 вариантов с MAF <0,01. Редкие варианты с патогенным эффектом или неопределенной клинической значимостью выявлены у младенцев с РН (rs138792485 гена TLR6, вариант p.Gln101Ter гена TIRAP, rs104894223 и rs773474310 гена FZD4, rs368951368 гена AGTR1, rs111513627 гена TGFBR1, rs80265967 гена SOD1). Используя метод поиска вариантов, связанных с мультифакториальными заболеваниями в когортах ограниченного размера, выявлены предварительные статистически значимые различия по распределению частот генотипов вариантов rs323043 ABCA3, rs2227984 EGFR, rs1965707 SFTPA2 между младенцами с БЛД и недоношенными новорожденными без БЛД.

Ключевые слова: вариант нуклеотидной последовательности, недоношенные новорожденные, бронхолегочная дисплазия, ретинопатия недоношенных, полноэкзомное секвенирование.

Введение

Бронхолегочная дисплазия (БЛД) и ретинопатия недоношенных (РН) относятся к наиболее распространенным осложнениям неонатального периода новорожденных, которые оказывают долгосрочное влияние на здоровье ребенка (повышенная восприимчивость к инфекциям верхних дыхательных путей, легочная гипертензия, бронхиальная астма, отслойка сетчатки, снижение остроты зрения, слепота).

Незрелость легких и недостаточное количество сурфактанта для обеспечения полноценной вентиляции и газообмена, низкий уровень антиоксидантной и иммунной защиты, а также высокая концентрация кислорода и его токсичность, баротравма вследствие проводимой искусственной вентиляции легких и инфекции являются основными факторами развития БЛД [1, 2]. Терапевтическое использование дополнительного кислорода у недоношенных новорожденных запускает патологические процессы в незрелой сосудистой сети сетчатки:

на первой стадии образование новых сосудов подавляется, на второй — происходит их аномальная пролиферация, деформация сетчатки с последующей отслойкой [3].

БЛД и РН являются многофакторными заболеваниями, на развитие которых оказывают влияние пренатальные условия, постнатальные факторы, оказываемая терапия и генетическая детерминанта, на долю которой приходится более половины различий в предрасположенности к развитию заболевания [2, 3]. Несмотря на то, что знания о патогенезе осложнений значительно улучшились в последнее время, механизмы, которые к ним приводят, до конца не изучены.

В течение последнего десятилетия широкое применение методов полногеномного анализа ассоциаций и полноэкзомного секвенирования позволило выявить потенциальные генетические факторы (гены-кандидаты, отдельные генетические варианты) риска развития БЛД и РН. Обнаруженные ассоциации не достиг-

ли общегеномного значения, вероятно, из-за гетерогенности заболеваний, включая потенциальные различия в генетической структуре БЛД и РН между этническими группами [2-4].

Цель исследования заключалась в поиске клинически значимых вариантов нуклеотидной последовательности генов, ассоциированных с развитием БЛД и РН у недоношенных новорожденных, с использованием технологии WES.

Материалы и методы

В исследование включены 59 образцов ДНК недоношенных новорожденных срока гестации 28-36 недель, родившихся в УЗ «Клинический родильный дом Минской области». На проведение исследования получено разрешение Комитета по этике «Института повышения квалификации и переподготовки кадров здравоохранения учреждения образования «Белорусский государственный медицинский университет» (ИПКиПКЗ УО БГМУ), а также для всех пациентов оформлено письменное информированное согласие законного представителя на участие в эксперименте.

Исследуемая выборка детей представлена 17 новорожденными с диагностированными БЛД и РН, 10 — с БЛД, 15 — с РН, 17 — без БЛД и РН. Критериями включения в экспериментальную группу были наличие клинически (кислородная поддержка более 28 дней) и рентгенологически подтвержденной БЛД у ребенка и/или РН различной степени тяжести, отсутствие врожденных пороков развития и наследственных заболеваний. Клинический диагноз поставлен сотрудниками кафедры не-онатологии ИПКиПКЗ УО БГМУ.

Геномная ДНК выделена из венозной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Полноэкзомное секвенирование выполнено по гибридному протоколу Illumina DNA prep with enrichment / xGen™ hybridization capture of DNA libraries (Illumina / IDT) на приборе NextSeq 550 (Illumina).

Обработка первичных данных, получение прочтений с дальнейшим их выравниванием на целевые участки референсного генома (hg19) осуществлена с помощью онлайн-приложений Dragen FASTQ Toolkit и Dragen germline pipeline (BaseSpace, Illumina); фильтрация, аннотирование, верификация и ин-

терпретация вариантов — с помощью программных средств wANNOVAR, Integrative Genomics Viewer, MS Excel 2016.

Первичная фильтрация обнаруженных полиморфных вариантов заключалась в исключении из анализа некодирующих (интронных) замен, замен с глубиной прочтения менее 10 и не удовлетворяющих фильтрам качества (Pass-filter). Также выполнена фильтрация по набору генов. По имеющимся литературным источникам [2-6], базам данных MalaCards и DisGeNET были подобраны 88 генов, ассоциированных с исследуемыми осложнениями неонатального периода недоношенных детей (6 генов — с РН, 14 — с БЛД, 68 генов с двумя осложнениями), в их числе гены метаболизма сурфактанта, ремоделирования тканей, развития сосудов, ренин-ангиотензиновой системы (renin-angiotensin system, RAS), гены, связанные с антиоксидантной защитой, с иммунной системой и воспалением, факторами роста, их рецепторами и регуляторами, а также гены Wnt/p-катенин-сигнального пути развития сетчатки (рис. 1).

Для поиска вариантов, потенциально повышающих восприимчивость к БЛД и РН, были использованы два подхода: отбор нуклеотидных замен с частотой минорного аллеля (minor allele frequency, MAF) >0,01 по базам данных ExAC и GnomAD (genomes, exomes) и определение статистически значимых ассоциаций генетического варианта и осложнения; отбор нуклеотидных замен с MAF <0,01 (редкие) по базам данных ExAC и GnomAD, с умеренным и высоким прогнозируемым функциональным воздействием в соответствии с SnpEff (несинонимичное кодирование, вставки или делеции кодонов, приобретение или потеря стоп-кодонов, варианты со сдвигом рамки считывания, потеря стартовых кодонов), клинически значимых вариантов по ClinVar и программам предсказания патогенности (интернет-портал VarSome).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием статистического пакета MS Excel 2016. Уровень значимости р определяли с поправкой Йетса. Статистически значимыми различия считались при р <0,05. По величине показателя отношения шансов и 95% доверительного интервала (confidence interval, CI) судили об ассоциации генотипа с развитием осложнения.

БЛД

АСЕ AGT PH

AGTR1 ANG ANGPT1 ANGPT2 CAT EPAS1 ЕРО FGF2 FZD4 FGF3 FGF7 FGFR2 FGFR3 FGFR4 FLT1 GPX1 GSTM1 GSTP1 GSTT1 LRP5 HIF1A ICAM1 IGF1 IGF1R IGFBP2 1GFBP3 IGFBP4 IGFBP5 IL10 IL1B IL1S NDP IL18R1 1L18RAP ILIA 1LIRI IL1RN IL6 IL33 KDR ММР1 ММР2 ММР9 ММР12 MMPI4 PRSS23 ММР16 MTHFR NFKB1 NOS1 NOS2 NOS3 SERPINF1 SOD1 SOD2 SOD3 TSPAN12 SPOCK2 ТЕК TGFB1 TGFB1R TGFBR2T1MP1 Т1МР2 T1RAP ZNF408 TLR2 TLR4 TLR5 TLR6 TNF VEGFA

АВСАЗ EGF EGFR FOXF1 IFNG IP013 MBL2 MIF NKX2-1 SFTPA1 SFTPA2 SFTPB SFTPC SFTPD

Рис. 1. Гены, ассоциированные с развитием БЛД и РН у недоношенных новорожденных (цветовая индикация ассоциации гена с осложнением неонатального периода: голубой — БЛД, желтый — РН, зеленый — два осложнения)

Результаты и обсуждение

Проанализированы кодирующие области 88 генов, в 78 из которых обнаружено 376 вариантов нуклеотидной последовательности с альтернативными аллелями, из них 126 с MAF <0,01 (рис. 2).

При этом среднее количество вариантов нуклеотидной последовательности на один образец ДНК пациента по всем изученным генам составило 83 ± 7.

В генах FGF7, FOXF1, IFNG, MIF, MMP16, NKX2-1, IGF1, IL10, TNF, NDP в 59 образцах ДНК исследуемой выборки замен с альтернативными аллелями обнаружено не было.

Выявленные замены преимущественно представлены синонимичными и несинонимичными вариантами, соотношение которых в группе с MAF >0,01 составляет 60% к 40%, а среди редких замен — 40% к 60%. В числе обнаруженных вариантов также присутствуют две делеции и две инсерции без сдвига рамки считывания, две нонсенс-замены, одна деле-ция со сдвигом рамки считывания.

Определение риска развития БЛД и РН у недоношенных новорожденных по вариантам нуклеотидной последовательности c MAF <0,01

В исследуемой группе недоношенных новорожденных выявлено 126 нуклеотидных замен с MAF <0,01. В генах, ассоциированных с развитием БЛД, обнаружено 18 редких вариантов, с РН — 13 вариантов, с обоими осложнениями — 95. На рисунке 3 показано распределе-

ние редких вариантов нуклеотидной последовательности у пациентов в изучаемых группах.

Большая часть редких вариантов нуклеотидной последовательности (97 замен) выявлена единично, оставшиеся встречались в 2-8 исследуемых образцах. Среди несинонимичных вариантов нуклеотидной последовательности, выявленных в двух и более образцах недоношенных новорожденных с осложнениями и отсутствующих у детей без БЛД и РН, обнаружены замены rs61735104 гена fGfR3, rs34216045 гена IL18R1 и rs79487279 гена NOS1 (доброкачественные по базе данных ClinVar и программам предсказания патогенности in silico), и вариант rs11549467(c.1762G > A, p.Ala588Thr) гена HIF1A, клиническая значимость которого по ClinVar не определена. Индуцируемый гипоксией фактор 1 (HIF1) является важным регулятором кислородного гомеостаза, обеспечивающим адаптивные реакции на гипоксию. Ген HIF1A кодирует одну из двух субъединиц (HIF-1a) этого фактора. В условиях недостатка кислорода субъединица HIF-1a не разрушается, HIF1 накапливается, что приводит к усилению регуляции многочисленных генов (например, VEGFA ), участвующих в различных биологических процессах, включая гликолиз, ангиогенез и эритропоэз. Нуклеотидная замена C.1762G > A расположена в пределах домена, стабилизирующего субъединицу HIF-1a от деградации. По литературным данным альтернативный аллель А является независимым фактором защиты от

ЛВСЛЗ

EGF

EGFR

IP013

MBL2

SFTPA1

SFTPA2

SFTPB

SFTPC

SFTPD

АСЕ

AGT

AGTR1

ANG

ANGPT1

ANGPT2

CAT

EPAS1

ЕРО

FGF2

FGF3

FGFR2

FGFR3

FGFR4

FLT1

GPX1

GSTM1

GSTP1

GSTT1

HIF1A

ICAM1

IGF1R

IGFBP2

IGFBP3

IGFBP4

IGFBP5

IL1S

IL1SR1

IL18RAP

ILIA

IL1B

IL1R1

IL1RN

IL33

ILo

KDR

ММР1

ММР12

ММР14

ММР2

ММР9

MTHFR

NFKB1

NOS1

NOS2

NOS3

SERPINF1

SOD1

SOD2

SOD3

SPOCK2

ТЕК

TGFB1

TGFB1R

TGFBR2

ПМР1

ПМР2

ПИАР

TLR2

TLR4

TLR5

TLR6

VEGFA

FZD4

LRP5

PRSS23

TSPAN12

ZNF408

MAF>0,01

MAF<0,01

0123456789 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20

Рис. 2. Распределение выявленных нуклеотидных замен по генам (цветовая индикация ассоциации гена с осложнением неонатального периода: голубой — БЛД, желтый — РН, зеленый — два осложнения)

синдрома дыхательного расстройства недоношенных новорожденных [7]. Данный вариант в нашей выборке определен у пациента с двумя осложнениями (БЛД и РН). Можно предположить, что изменение структуры и/или экспрессии HIF1A способствует развитию второй фазы РН, когда происходит аномальная неоваскуляризация сетчатки.

Среди генов, ассоциированных с развитием и БЛД, и РН, большее количество редких замен выявлено в гене NOS3 и EPAS1, с развитием РН — в генах FZD4, LRP5 (по разнице между количеством замен в основной и контрольной группе). Данные гены кодируют белки, участвующие в развитии сосудов.

Ген NOS3 кодирует эндотелиальную синтазу оксида азота, которая принимает участие в синтезе оксида азота в эндотелии, действующем как сосудорасширяющее средство, обеспечивая адекватный кровоток через ткани. Оксид азота также оказывает защитное действие на стенки сосудов, ингибируя окисление липидов и инактивируя свободные радикалы кислорода [8]. Снижение экспрессии NOS3 ухудшает VEGF-опосредованный ангиогенез и неоваскуляризацию [9]. Снижение экспрессии гена EPAS1, кодирующего эндотелиальный белок домена PAS 1, приводит к нарушению экспрессии гена эритропоэтина, который стимулирует образование красных кровяных телец в костном мозге, что вызывает уменьшение устойчивости к гипероксической терапии у недоношенного новорожденного и повышение восприимчивости к РН [10].

Гены FZD4 и LRP5 кодируют рецепторы Wnt/p-катенин-сигнального пути. Их взаимодействие с лигандом норрином активирует нижележащий каскад реакций, в результате чего происходит инициация экспрессии генов, ответственных за васкуляризацию сетчатки. Мутации в гене FZD4 и LRP5 обеспечивают ~10% случаев тяжелой формы РН у недоношенных новорожденных [10].

Особый интерес представляют 40 редких однонуклеотидных несинонимичных гетерозиготных замен, обнаруженных единожды у детей с БЛД и/или РН и отсутствующих в группе сравнения (табл. 1).

По клинической значимости 16 из представленных вариантов классифицируются как варианты с неопределенным клиническим

12

10

8

6

4

2

0

БЛД

1

2

11В 1 i В ш

Г*} Рч рИ сп

и w о о он m w й d

б

fflUQ Пн Он ex, Н Н Е-с Рн [X [х, СО СО СО

БЛД и PH

В 0 2

1

т

О <4 <*">

1 Ц 1 1

р 'га2 2 ш 11; в в ш2 1 3

в

в

2 2

Ш 1 BB1B

1 О О (X

<н

йЙёё52Ы “133Е|ггйй-осср

8rt2dco^^^HP4i2;5ddddd3f'ih-lndddEpqcoi>onQr3cqc4d

^ ^ Г") П СХ ^ Г1 Г"! Lx СО Н “X Г") Lx tx Lx —' «1-1

[1111 Ш

!>

PH

4

1 [T]

\f 1Л fO oo Q РЦ <N О

sBgi

S N

■ Осложнение Нет осложнения ■ В обеих группах Рис. 3. Распределение редких вариантов нуклеотидной последовательности по изучаемым группам генов

значением (VUS) либо их интерпретация конфликтная (при отсутствии информации в базе данных ClinVar были использованы программы предсказания патогенности in silico). В генах, ассоциированных с развитием БЛД, выявлены две такие замены: rs148671332 в гене ABCA3 и rs781195445 в гене SFTPD.

Ген ABCA3 кодирует АТФ-зависимый транспортер сурфактанта А3, который преимущественно экспрессируется в легочной ткани, локализуется на мембранах пластинчатых телец альвеолоцитов II типа, где имеет решающее значение для синтеза (транспортирует фосфолипиды) и процессинга сурфактанта. Мутации в гене ABCA3 связаны с нарушением метаболизма сурфактанта, который проявляет-

ся различными респираторными заболеваниями у детей и взрослых [11]. В нашем исследовании у одного недоношенного ребенка с БЛД обнаружена замена цитозина на тимин в 14-ом экзоне гена ABCA3 (rs148671332), приводящая к замещению аминокислоты аргинина на несхожий ей по своим свойствам триптофан, с конфликтной интерпретацией патогенности (доброкачественная in silico). По литературным данным такая же гетерозиготная замена выявлялась при таких заболеваниях, как легочный альвеолярный протеиноз и интерстициальное заболевание легких у взрослых пациентов и у новорожденного с респираторным дистрессом [11].

Сурфактантный белок D гена SFTPD явля-

Таблица 1

Редкие генетические варианты, встречающиеся единожды у пациентов c бронхолегочной дисплазией и/или ретинопатией недоношенных

Ген rs dbSNP Замена нуклеотида, аминокислоты Частота (GnomAD genome) Клиническая значимость (ClinVar) Осложнение

Варианты в генах, ассоциированных с БЛД (группа сравнения 32 ребенка без БЛД)

ABCA3 rs148671332 c.2125C > T, p.Arg709Trp 0,00162 VUS:5, LB:2 БЛД

rs146709251 c.4420C > T, p.Arg1474Trp 0,00296 LB:4, B:4 БЛД

SFTPD rs781195445 c.400A > G, p.Lys134Glu 0,00002 VUS:1 БЛД

IPO13 rs139063607 c.731A > T, p.Gln244Leu 0,00139 B* БЛД

Варианты в генах, ассоциированных с РН (группа сравнения 27 детей без РН)

FZD4 rs140601725 c.76C > A, p.Gln26Lys 0,00041 VUS:1, B:1 РН

rs139401671 c.118G > C, p.Glu40Gln 0,00031 VUS:1, LB:1 РН

rs104894223 c.766A > G, p.Ile256Val 0,00051 P:2, LB:1 РН

rs773474310 c.1128G > T, p.Leu376Phe 0,00002 VUS:1 РН

LRP5 rs143433231 c.290C > T, p.Ala97Val 0,00013 LB:1 РН

rs1127291 c.4574C > T, p.Ala1525Val 0,0096 LB:4, B:7 РН

Окончание таблицы 1

Ген rs dbSNP Замена нуклеотида, аминокислоты Частота (GnomAD genome) Клиническая значимость (ClinVar) Осложнение

Варианты в генах, ассоциированных и с БЛД, и с РН (группа сравнения 17 детей без обоих осложнений)

SOD1 rs80265967 c.272A > C, p.Asp91Ala 0,0012 P:4, LP:5, VUS:4 РН

TIRAP - c.301C > T, p.Gln101Ter - LP* РН

rs200632029 c.427C > T, p.Arg143Trp 0,00005 B* БЛД + РН

TLR6 rs138792485 c.392A > G, p.Asn131Ser 0,00017 VUS* РН

AGT rs201777691 c.148A > T, p.Thr50Ser 0,00015 VUS:1, B:1 БЛД + РН

AGTR1 rs368951368 c.893A > G, p.Asn298Ser 0,00015 VUS:3 БЛД + РН

EPAS1 rs141965374 c.481G > A, p.Asp161Asn 0,00012 LB:1 БЛД + РН

rs1169287303 c.1256A > G, p.Gln419Arg 0,0000014 VUS:1 БЛД + РН

IGF1R rs45451896 c.1976G > A, p.Arg659Gln 0,00029 VUS:1, LB:1 РН

IL33 rs138513976 c.164A > G, p.Lys55Arg 0,00037 VUS:1 БЛД

- c.133A > G, p.Met45Val - B* РН

MMP9 rs201975453 c.878T > A, p.Ile293Asn 0,00017 VUS:3 БЛД

TGFBR1 rs111513627 c.214A > T, p.Ile72Leu 0,00019 VUS:7, LB:5 РН

ACE rs749779360 c.1324C > T, p.Arg442Cys 0,00002 B* БЛД + РН

rs4314 c.1681C > T, p.Arg561Trp 0,00289 LB:1, B:2 БЛД

rs752660066 c.1931C > G, p.Thr644Ser 0,00001 B* РН

EPO rs62483572 c.208G > A, p.Asp70Asn 0,00266 LB:1 БЛД + РН

GSTP1 rs192307201 c.67G > T, p.Ala23Ser 0,00145 B* РН

IL18RAP rs11695455 c.407A > G, p.Asp136Gly 0,00436 B* БЛД + РН

IL6 rs2069860 c.485A > T, p.Asp162Val 0,00548 B:2 БЛД + РН

KDR rs139156665 c.1362T > A, p.His454Gln 0,00017 B* БЛД

rs34038364 c.2066C > T, p.Thr689Met 0,00291 VUS:1 LB:1 B:1 РН

NFKB1 - c.283A > G, p.Lys95Glu - B* РН

NOS3 rs3918232 c.2479G > A, p.Val827Met 0,0033 B:1 БЛД

rs148359917 c.383G > A, p.Arg128Gln 0,00115 B:1 БЛД + РН

rs749398455 c.3560G > A, p.Gly1187Asp 0,00115 B* БЛД

TEK rs138894008 c.1565G > T, p.Arg522Leu 0,00038 LB:1, B:1 БЛД + РН

TGFBR2 rs35719192 c.1119G > A, p.Met373Ile 0,00131 VUS:1, LB:19, B:6 БЛД + РН

TLR4 rs5030724 c.2500C > A, p.Gln834Lys 0,00039 B* РН

TLR5 rs374080914 c.335C>G, p.Pro112Arg 0,00018 B* БЛД

Примечание. B — benign (доброкачественный), LB — likely benign (вероятно доброкачественный), VUS — uncertain significance (неопределенного значения), LP — likely pathogenic (вероятно патогенный), P — pathogenic (патогенный); *—значения по предикторам патогенности базы данных VarSome

ется частью врожденного иммунного ответа, защищающего легкие от вдыхаемых микроорганизмов, органических антигенов и токсинов, модулирует активность лейкоцитов в иммунном ответе, а также вовлечен в метаболизм сурфактанта [12]. Нуклеотидный вариант p.Lys134Glu (rs781195445) гена SFTPD

не описан в литературе, по программам предсказания патогенности in silico определяется как доброкачественный.

В гене FZD4, ассоциированном с развитием РН, выявлены четыре несинонимичные замены, одна из которых rs104894223 (p.Ile256Val) c конфликтной интерпретацией патогенности

(известная патогенная мутация по базе данных HGMD, ID CM050620, по состоянию на 2021 г.). Миссенс-вариант p.Ile256Val находится в высоко консервативной области рецептора FZD4 и может привести к его структурному дефекту. Белок FZD4 экспрессируется в сетчатке, обеспечивает нормальное развитие ее сосудов путем активации канонического пути Wnt/p-катенина и генов-мишеней. Отсутствие рецептора приводит к дефектному развитию сосудов с последующей неоваскуляризацией сетчатки и экссудацией. Течение ретинопатии при наличии редких нуклеотидных вариантов гена FZD4 у недоношенных детей может усугубляться, что показано и для варианта p.Ile256Val [13]. Замена лейцина на фенилаланин в кодоне 376 белка FZD4 (rs773474310) и по ClinVar, и по предикторам патогенности имеет неопределенное клиническое значение. Клиническая значимость двух других вариантов p.Gln26Lys и p.Glu40Gln, обнаруженных в этом гене, определена как доброкачественная с использованием программ in silico.

В генах, ассоциированных с развитием и БЛД, и РН, обнаружено 10 однонуклеотидных замен с неопределенным клиническим значением или конфликтной интерпретацией патогенности по ClinVar.

Вариант rs80265967 гена SOD1 с конфликтной интерпретацией патогенности выявлен у одного недоношенного новорожденного с РН. Замена аспарагиновой кислоты на аланин в положении 91-й аминокислотной последовательности приводит к образованию белка с измененной функцией. Ген SOD1 кодирует цитоплазматическую супероксиддисмутазу, которая преобразует супероксидные радикалы в молекулярный кислород и перекись водорода. Несовершенство антиоксидантной защиты у недоношенных новорожденных и избыточный синтез свободных радикалов при оксигенотерапии способствуют развитию бронхолегочной дисплазии и ретинопатии недоношенных. Повреждение тканей за счет образования реактивных промежуточных продуктов окисления кислорода и перекисного окисления мембранных липидов вызывает ва-зоконстрикцию в сетчатке, которая приводит к вазооблитерации, неоваскуляризации и отслойке сетчатки [14].

В гене TIRAP, кодирующем адаптерный

белок, ассоциированный с толл-подобными рецепторами, выявлен гетерозиготный нонсенс-вариант (p.Gln101Ter), отсутствующий в базе данных dbSNP, патогенный по программам предсказания клинической значимости. Замена цитозина на тимин в положении 301 приводит к появлению стоп-кодона в TIR-домене белка, ответственном за взаимодействия с другими молекулами, ассоциированными с воспалительным ответом. TIRAP участвует в передаче сигнала по TLR-опосредованным сигнальным путям (TLR2, TLR4), что приводит к активации основных факторов транскрипции NF-kB и AP-1 и, следовательно, экспрессии провоспалительных цитокинов [15].

Несинонимичная замена rs138792485 гена TLR6, выявленная у одного ребенка с РН, приводит к замещению аспарагина на серин в положении 131 аминокислотной последовательности. Вариант отсутствует в базе данных ClinVar, и о его клинической значимости можно судить только по программам предсказания in silico (умеренно патогенный). Толл-по-добный рецептор 6, кодируемый геном TLR6, расположен на поверхности эндотелиальных клеток сетчатки и хориоидеи. Рецептор отвечает главным образом за распознавание компонентов бактериальной мембраны, инициирует сложный каскад передачи сигнала, индуцирует выработку воспалительных цитокинов и регулирует уровень костимулирующих молекул, которые играют важную роль в патогенезе ишемических заболеваний сетчатки [16].

Продукты генов AGT и AGTR1 относятся к ренин-ангиотензиновой системе. RAS регулирует развитие и функционирование многих органов, активен как в здоровой, так и в пораженной легочной ткани. Существует два предполагаемых пути, с помощью которых RAS может влиять на развитие и функцию легких. Эти пути опосредуются рецепторами ангиотензина II 1-го (AGTR1) и 2-го (AGTR2) типов. Предполагается, что гипероксия может способствовать активации пути через рецептор AGTR1, вызывая усиление воспаления, гипертрофии, фиброза и эндотелиальной дисфункции, и снижать активность пути через рецептор AGTR2 с противоположным эффектом [17]. Замена треонина на серин в положении 50 аминокислотной последовательности в гене AGT по предикторам in silico определяется

как доброкачественная. Вариант p.Asn298Ser гена AGTR1 по алгоритмам предсказания их влияния определяется как умеренно патогенный. Замена аспарагина на серин происходит в высоко консервативном мотиве NPxxY, который участвует в инициации передачи сигнала после связывания лиганда. Исследования сайт-направленного мутагенеза показали, что замена p.Asn298Ser уменьшает количество сайтов связывания и нарушает передачу сигналов рецептором [18].

Транскрипционный фактор EPAS1, кодируемый геном EPAS1, вовлечен в индукцию генов, экспрессия которых зависит от уровня кислорода. Белок регулирует экспрессию сосудистого эндотелиального фактора роста и, по-видимому, участвует в развитии кровеносных сосудов и канальцевой системы легких, может также играть роль в формировании эндотелия, создающего гематоэнцефалический барьер, является активатором экспрессии тирозинкиназы Tie-2 [19]. Замена глицина на аргинин в положении 419 аминокислотной последовательности гена EPAS1 по предикторам in silico определяется как доброкачественная.

Рецептор инсулиноподобного фактора роста, кодируемый геном IGF1R, передает сигнал от фактора роста, играющего ключевую роль в нормальном развитии сетчатки и в патогенезе РН [10]. В гене рецептора определен несинонимичный редкий вариант c.1976G > A, p.Arg659Gln (rs45451896) с конфликтной интерпретацией патогенности по ClinVar и доброкачественный по программам предсказания in silico.

Вариант rs138513976 гена IL33 с неопределенной клинической значимостью по базе данных ClinVar и доброкачественный по программам предсказания патогенности обнаружен у недоношенного новорожденного с БЛД. Интерлейкин 33 (IL-33), кодируемый геном IL33, высвобождается из поврежденных и некротизированных клеток и стимулирует иммунный ответ. IL-33 играет важную роль в иммунитете тканей слизистых оболочек, воспалении, гомеостазе, патогенезе тяжелых заболеваний дыхательных путей человека (воспаление легких, астма, аллергия). По литературным данным тяжесть течения БЛД коррелирует с уровнем IL-33 в плазме [20].

Матриксная металлопротеиназа 9, кодиру-

емая геном MMP9, участвует как в физиологических, так и в патологических процессах: разрушает белки внеклеточного матрикса, индуцирует образование сосудов, усиливает миграцию клеток, активирует или инактивирует провоспалительные цитокины, модифицирует образование новых сосудов, усиливает миграцию воспалительных клеток и способствует ремоделированию тканей в легких [21]. Редкий вариант c.878T > A (rs201975453) гена MMP9 обнаружен у одного недоношенного новорожденного с БЛД и заключается в замене неполярной аминокислоты изолейцин на полярный аспарагин в позиции 293 аминокислотной последовательности. Клиническая значимость замены по ClinVar не определена, по алгоритмам прогнозирования влияния является доброкачественной.

Нуклеотидная замена rs111513627 гена TGFBR1 с конфликтной интерпретацией патогенности как по базе данных ClinVar, так и по программам предсказания патогенности выявлена у младенца с РН. Кодируемый этим геном рецептор 1 трансформирующего фактора роста участвует в передаче сигнала по TGF-P сигнальному пути, играющему важную роль в ангиогенезе, пролиферации клеток эндотелия, ремоделировании внеклеточного матрикса, нарушении гематоретинального барьера [22].

Исходя из проведенного анализа, среди 42 недоношенных новорожденных с одним или двумя осложнениями, выявлены семь редких вариантов, которые могут вносить существенный вклад в исследуемый фенотип (rs138792485 гена TLR6, не встречаемый ранее вариант p.Gln101Ter гена TIRAP, rs104894223 и rs773474310 гена FZD4, rs368951368 гена AGTR1, rs111513627 гена TGFBR1, rs80265967 гена SOD1).

Определение риска развития БЛД и РН у недоношенных новорожденных по вариантам нуклеотидной последовательности с MAF >0,01

Учитывая низкую статистическую мощность анализа вследствие ограниченных выборок пациентов, поиск ассоциации кандидатных вариантов нуклеотидной последовательности проводился для БЛД по 10 генам (ABCA3, EGF, EGFR, IPO13, MBL2, SFTPA1, SFTPA2, SFTPB, SFTPC, SFTPD), для РН по 5 генам (FZD4, LRP5, PRSS23, TSPAN12, ZNF408), значимость

которых в развитии осложнений ранее была установлена в работах других исследователей [2-6]. К полиморфным вариантам с MAF >0,1 был применен уровень значимости р = 0,05; вариантам с частотой альтернативного аллеля O,0l< MAF <0,1 — р = 0,001. Схожий подход применялся при исследовании заболеваний мультифакторной этиологии — сахарного диабета 2-го типа и ожирения — на небольшой когорте пациентов (49 и 21 соответственно) с использованием WES [23, 24].

Попарное сравнение частот распределения генотипов 14 выявленных вариантов нуклеотидной последовательности генов, ассоциированных с РН, между группой младенцев

с ретинопатией (32 ребенка) и без нее (27 детей) не показало статистически достоверных различий.

Группа сравнения для пациентов с БЛД (27 младенцев) была представлена недоношенными новорожденными без исследуемого осложнения (32 ребенка). В генах, ассоциированных с развитием БЛД, выявлен 51 полиморфный вариант с MAF >0,01. В таблице 2 представлены замены, в которых достигнуты статистически значимые различия по распределению частот их генотипов в сравниваемых группах.

Представленные однонуклеотидные замены являются синонимичными и не оказывают влияния на структуру кодируемых ими белков.

Таблица 2

Распределение частот генотипов полиморфных локусов генов, ассоциированных

с развитием БЛД

Ген rs замены Генотип Пациенты с БЛД Пациенты без БЛД Р OR(95% Cl)

ABCA3 rs323043 GG 88,9 62,5 0,044 4,8(1,19-19,4)

GC 7,4 37,5 0,016 0,13(0,03-0,67)

CC 3,7 0 0,93 3,68(0,14-94,2)

EGFR rs2227984 TT 18,5 50 0,025 0,23(0,07-0,75)

TA 66,7 37,5 0,049 3,33(1,14-9,76)

AA 14,8 12,5 0,90 1,22(0,27-5,41)

SFTPA2 rs1965707 GG 40,7 75 0,009 0,23(0,08-0,70)

GA 55,6 12,5 0,001 8,75(2,40-31,9)

AA 3,7 12,5 0,46 0,27(0,03-2,57)

Заключение

С использованием полноэкзомного секве-нирования у 59 недоношенных новорожденных проведен анализ спектра нуклеотидных вариантов 88 генов, ассоциированных с развитием БЛД и РН. Выявлено 376 нуклеотидных вариантов, из них 126 с MAF <0,01.

Редкие варианты с патогенным эффектом или неопределенной клинической значимостью выявлены у недоношенных младенцев с РН (rs138792485 гена TLR6, не встречаемый ранее вариант p.Gln101Ter гена TIRAP, rs104894223 и rs773474310 гена FZD4, rs368951368 гена AGTR1, rs111513627 гена TGFBR1, rs80265967 гена SOD1). Эти варианты с большей долей вероятности могут вносить вклад в проявление осложнений в сочетании с другими генетическими факторами

и факторами окружающей среды.

Несмотря на то, что исследование выполнено на сравнительно небольшом числе образцов (вследствие его высокой стоимости), ассоциативный анализ вариантов нуклеотидной последовательности с MAF >0,01 выявил статистически значимые различия в трех из них (rs323043 ABCA3, rs2227984 EGFR, rs1965707 SFTPA2) между младенцами с БЛД и недоношенными новорожденными без БЛД. Полученные результаты являются предварительными.

Необходимо продолжить исследования на большей выборке пациентов для проверки воспроизводимости обнаруженных клинико-генетических ассоциаций и поиска новых потенциальных кандидатных генов и вариантов, ассоциированных с осложнениями, а также подтвердить выявленные генетические

замены с патогенным эффектом или неопределенной клинической значимостью методом секвенирования по Сэнгеру.

Авторы выражают благодарность сотрудникам кафедры неонатологии ИПКиПКЗ УО БГМУ — Шишко Г. А., Артюшевской М. В., Сухаревой А. П., осуществлявших в 20182022 гг. сбор образцов биологического материала и анкетных данных пациентов.

Список использованных источников

1. Ancestry and genetic associations with bronchopulmonary dysplasia in preterm infants / D. G. Torgerson [et al.] // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. - 2018. - Vol. 315. - P. 858-869.

2. Exome sequencing and pathway analysis for identification of genetic variability relevant for bronchopulmonary dysplasia (BPD) in preterm newborns: A pilot study / P. Carrera [et al.] // Clin. Chim. Acta. - 2015. - Vol. 451. - P. 39-45.

3. Retinopathy of prematurity: a review of risk factors and their clinical significance / S. J. Kim [et al.] // Surv. Ophthalmol. - 2018. - Vol. 63. -P. 618-637.

4. Exome sequencing identifies gene variants and networks associated with extreme respiratory outcomes following preterm birth [Electronic resource] / A. Hamvas [et al.] // Genet. - 2018. -A. 94. - Mode of access: https://bmcgenomdata. biomedcentral.com/articles/10.1186/s12863 -0180679-7. - Date of access: 28.01.2024.

5. A pathogenic relationship of bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity? A review of angiogenic mediators in both diseases [Electronic resource] / A. Stark [et al.] // Front. Pediatr. - 2018. - Vol. 6. - Mode of access: https://www.frontiersin.org/arti-cles/10.3389/fped.2018.00125/full. - Date of access: 28.01.2024.

6. Genetic contributions to the development of complications in preterm newborns [Electronic resource] / C. Poggi [et al.] // pLoS ONE.

- 2015. - Vol. 10. - A. e0131741. - Mode of access: https://journals.plos.org/plosone/ article?id=10.1371/journal.pone.0131741. - Date of access: 28.01.2024.

7. Hypoxia-inducible pathway polymorphisms and their role in the complications of prematurity [Electronic resource] / E. Strauss [et al.] // Genes.

- 2023. - Vol. 14. - Mode of access: https://www.

mdpi.com/2073-4425/14/5/975. - Date of access:

28.01.2024.

8. The role of genetic factors in the pathogenesis of neonatal intraventricular hemorrhage [Electronic resource] / D. Szpecht [et al.] // Folia Neuropathol. - 2015. - Vol. 1. - P. 1-7.

- Mode of access: https://www.termedia.pl/ Review-paper-The-role-of-genetic-factors-in-the-pathogenesis-of-neonatal-intraventricular-hemorrhage,20,24859,1,1.html. - Date of access:

16.02.2024.

9. Alvira, C. M. Aberrant pulmonary vascular growth and remodeling in bronchopulmonary dysplasia [Electronic resource] / C. M. Alvira // Front. Med.- 2016. - Vol. 3, A. 21. - P. 1-21.

- Mode of access: https://www.frontiersin.org/ articles/10.3389/fmed.2016.00021/full. - Date of access: 28.01.2024.

10. The genetics of retinopathy of prematurity: a model for neovascular retinal disease / R. Swan [et al.] // Ophthalm. Retina. - 2018. - Vol. 2. -P. 949-962.

11. Lung disease caused by ABCA3 mutations / C. Kroner [et al.] // Thorax. - 2017. - Vol. 72. -P. 213-220.

12. GeneCards®: The human gene database [Electronic resource]. - Mode of access: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp. pl?gene=SFTPD. - Date of access: 28.01.2024.

13. Kondo, H. Complex genetics of familial exudative vitreoretinopathy and related pediatric retinal detachments / H. Kondo // Taiwan. J. Ophthalmol. - 2015. - Vol. 5. - P. 56-62.

14. Free radical status in retinopathy of prematurity / U. Garg [et al.] // Indian J. Clin. Biochem. - 2011. - Vol. 27. - P. 196-199.

15. TIRAP in the mechanism of inflammation [Electronic resource] / S. Rajpoot [et al.] // Front. Immunol. - 2021. - Vol. 12. - A. 697588.

- Mode of access: https://www.frontiersin. org/journals/immunology/articles/10.3389/ fimmu.2021.697588/full. - Date of access:

28.01.2024.

16. Titi-Lartey, O. Toll-like receptor signalling pathways and the pathogenesis of retinal diseases [Electronic resource] / O. Titi-Lartey, I. Mohammed, W. M. Amoaku // Front. Ophthalmol. - 2022. - Vol. 2. - A. 850394. -Mode of access: https://www.frontiersin.org/ articles/10.3389/fopht.2022.850394/full. - Date of access: 28.01.2024.

17. Hyperoxia-induced airflow restriction and renin-angiotensin system expression in a bronchopulmonary dysplasia mouse model [Electronic resource] / J. Dowell [et al.] // Physiol. Reports. - 2024. - Vol. 12, A. e15895. - Mode of access: https://physoc.onlinelibrary.wiley. com/doi/10.14814/phy2.15895. - Date of access:

28.01.2024.

18. Variations of the angiotensin II type 1 receptor gene are associated with extreme human longevity / A. Benigni [et al.] // AGE. - 2012. -Vol. 35, № 3. - P. 993-1 005.

19. GeneCards®: The human gene database [Electronic resource]. - Mode of access: https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp. pl?gene=EPAS1&keywords=EPAS1. - Date of access: 14.02.2024.

20. Cakir, U. A novel diagnostic marker for the severity of bronchopulmonary dysplasia in very low birth weight infants: interleukin-33 [Electronic resource] / U. Cakir, C. Tayman, C. Yucel // Pediatr. Allerg. Immunol. Pulm. -2019. - Vol. 32. - P. 12-17. - Mode of access: https://www.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/ ped.2019.0994. - Date of access: 28.01.2024.

21. Matrix metalloproteinase-9 deficiency worsens lung injury in a model of bronchopulmonary dysplasia / H. Lukkarinen [et al.] // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2009. - Vol. 41, № 1.

- P. 59-68.

22. Complex roles of TGF-P signaling pathways in lung development and bronchopulmonary dysplasia [Electronic resource] / R. J. Calthorpe [et al.] // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.

- 2023. - Vol. 324. - P. 285-296. - Mode of access: https://journals.physiology.org/doi/ full/10.1152/ajplung.00106.2021. - Date of access: 28.01.2024.

23. Identification of novel candidate markers of type 2 diabetes and obesity in Russia by exome sequencing with a limited sample size [Electronic resource] / Y. A. Barbitoff [et al.] // Genes. - 2018.

- Vol. 9, A. 415. - Mode of access: https://www. mdpi.com/2073-4425/9/8/415. - Date of access:

23.02.2024.

24. Глотов, О. С. Секвенирование экзома человека и перспективы предиктивной медицины : дис. ... д-ра биол. наук : 01.05.07 / О. С. Глотов. - Санкт-Петербург, 2023. - 242 л.

V. М. Malyshava, A. P. Mikhalenka, A. Ch. Mazur, A. V. Kilchevsky

variability of genes associated with bronchopulmonary dysplasia and retinopathy in premature newborns

State Scientific Institution

“Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus”

27 Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: o.malysheva@igc.by

Bronchopulmonary dysplasia (BPD) and retinopathy of prematurity (ROP) are the most common pathological conditions of premature newborns. The diseases have multifactorial etiology with a significant genetic component. A spectrum of 376 nucleotide variants (126 with MAF <0,01) in 88 genes associated with BPD and ROP was determined by exome sequencing in 59 premature newborns with a gestational age of 28-36 weeks. Rare pathogenic or uncertain significance variants were identified in the group of infants with ROP (rs138792485 of the TLR6 gene, p.Gln101Ter of the TIRAP gene, rs104894223 and rs773474310 of the FZD4 gene, rs368951368 of the AGTR1 gene, rs111513627 of the TGFBR1 gene, rs80265967 of the SOD1 gene). Using the search method for variations associated with multifactorial diseases in the cohorts of a limited size, preliminary statistically significant differences were achieved in the distribution of the genotype frequencies of rs323043 ABCA3, rs2227984 EGFR, rs1965707 SFTPA2 variants among the infants with BPD and premature newborns without BPD.

Keywords: nucleotide sequence variant, premature newborns, bronchopulmonary dysplasia, retinopathy of prematurity, whole-exome sequencing.

Дата поступления в редакцию: 12 февраля 2024 г.