CC BY
2УДК 577.21:575.174.015.3:617.735-007.281:616.24-008.4
О. М. Малышева1, Е. П. Михаленко1, Ю. В. Полюхович1, Е. И. Кузьминова1, А. П. Сухарева2, М. В. Артюшевская3, К. А. Гомолко2, А. В. Кильчевский1
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ
АНГИОГЕНЕЗА И ТКАНЕВОГО РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С ОСЛОЖНЕНИЯМИ
НЕОНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДА
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: o.malysheva@igc.by 2Учреждение здравоохранения «Клинический родильный дом Минской области» Республика Беларусь, 220076, г. Минск, ул. Ф. Скорины, 16 3Институт повышения квалификации и переподготовки кадров здравоохранения
учреждения образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, ул. П. Бровки, 3, корпус 3
С целью поиска молекулярных маркеров развития синдрома дыхательного расстройства (СДР), бронхоле-гочной дисплазии (БЛД) и ретинопатии недоношенных (РН) исследована частота встречаемости полиморфных вариантов генов MMP2 (-735C > T, -1575G > A), MMP9 (-1562C > T, 2660A > G), VEGF(-2578A > C, -634C > G, +936C > T), KDR (-906A > G, 1719T > A), TGFB1 (-509A > G), TGFBR1 (TGFBR1*6A) у 325 недоношенных младенцев в сроке гестации 28-36 недель с осложнениями неонатального периода и 242 доношенных новорожденных (группа сравнения).
Обнаружено статистически значимое влияние на риск развития СДР и тяжесть его течения полиморфных вариантов локуса -735C > T гена MMP2 как независимо (рисковый аллель Т и протективный — С), так и в комбинации с другими исследуемыми локусами (шесть протективных комбинаций), и локуса -1562C > T гена MMP9 только в сочетании с другими локусами (две рисковые, пять протективных комбинаций). У мальчиков степень тяжести течения СДР ассоциирована с полиморфными вариантами локуса -509A > G гена TGFB1, в том числе в комбинации с исследуемыми локусами генов MMP2 и MMP9, у девочек течение СДР связано с комбинациями полиморфных вариантов генов KDR (1719T > A) и VEGF(-2578A > C, +936C > T). Полиморфные варианты локусов 2660A > G гена MMP9 и TGFBR1*6A гена TGFBR1 ассоциированы с риском развития ретинопатии независимо и в комбинации с другими локусами.
Ключевые слова: полиморфизм генов, недоношенные новорожденные, синдром дыхательного расстройства, бронхолегочная дисплазия, ретинопатия недоношенных, фактор роста эндотелия сосудов, трансформирующий фактор роста, матриксные металлопротеиназы.
Введение
По статистике Всемирной Организации Здравоохранения ежегодно в мире каждый 10 младенец рождается недоношенным, при этом 10% из них не выживает. В Республике Беларусь неонатальная и младенческая смертность за последние годы снизилась в два раза при сохраняющихся 4% преждевременных родов [1, 2]. Совершенствование мероприятий по выхаживанию детей, рожденных преждевременно, спо-
собствует их выживаемости, но не исключает развитие серьезных нарушений здоровья, которые могут повлиять на их дальнейшую жизнь.
Незрелость органов и систем, характерная недоношенным детям, может способствовать возникновению различных патологий неона-тального периода. Синдром дыхательного расстройства (СДР) возникает из-за незрелости легких и дефицита сурфактанта, что приводит к гипоксии и необходимости применения
искусственной вентиляции легких и/или кис-лородотерапии. В то же время повышенные дозы кислорода негативно влияют на формирующиеся легкие и сетчатку глаза недоношенных детей, что повышает риск развития таких осложнений неонатального периода, как брон-холегочная дисплазия (БЛД) и ретинопатия недоношенных (РН) [3, 4].
Ключевое значение в опосредованном ги-пероксией воспалении, фиброгенезе легочной паренхимы, ремоделировании сосудистой сети имеют трансформирующий фактор роста TGFpl, фактор роста эндотелия сосудов VEGF и их рецепторы, матриксные металлопротеи-назы (ММП) 2 и 9. В физиологических процессах динамическое изменение концентраций этих соединений строго контролируется, а их избыток или недостаток может привести к нарушению биологических процессов в организме и развитию различных заболеваний. Например, повышенные концентрации ММП-2 и ММП-9 ведут к изменению содержания компонентов внеклеточного ма-трикса (ВКМ), развитию фиброзной ткани и формированию БЛД, повышенный уровень VEGF — развитию РН [5]. Полиморфные локусы в генах ММР2, ММР9, УЕв¥, КВЯ, ТО¥В1 и ТО¥ВЯ1 могут изменять их экспрессию, снижая или повышая концентрацию белковых продуктов, приводить к модификации структуры белка, влияя на его функцию, что может вызвать нарушение физиологического ангиогенеза и ремоделирования ткани и способствовать развитию различных заболеваний.
Поэтому с целью поиска прогностических маркеров развития СДР и тяжести его течения,
развития БЛД и РН были проанализированы полиморфные локусы -735С > Т и -1575G > А гена ММР2, -1562С > Т и 836А > G (2660А > G) гена ММР9, -2578А > С, -634С > G и +936С > Т гена УЕв¥, -906А > G и 1719Т > А гена КБЯ, -509А > G гена Тв¥В1, TGFBR1*6A гена Тв¥ВЯ1.
Материалы и методы
В анализ включены 567 образцов ДНК новорожденных, родившихся в УЗ «Клинический родильный дом Минской области». Сбор биологического материала осуществлялся с 2016 по 2020 гг. с письменного информированного согласия законного представителя ребенка и разрешения Комитета по этике БелМАПО на проведение исследований.
Наследственные и врожденные заболевания, ВИЧ-инфекция у матери, инфекционные болезни, специфичные для перинатального периода, являлись критериями исключения новорожденных из исследования.
Распределение новорожденных по исследуемым патологиям представлено на рисунке 1.
Среди недоношенных новорожденных 87 детей характеризовались наличием осложнений неонатального периода: 44 ребенка имели диагноз ретинопатия недоношенных, 20 детей — диагноз бронхолегочная дисплазия и 23 пациента — сочетание РН и БЛД. Исследуемые осложнения встречались у пациентов в сроке гестации 28-34 недели, при этом БЛД — только у пациентов с СДР тяжелой степени.
У пациентов проведен анализ 11 полиморфных вариантов генов, контролирующих
567 новорождённых
325 недоношенных новорождённых в сроке гестации 28-36 недель с СДР
242 доношенных новорождённых 5 сроке гестации 37-40 недель с отсутствием исследуемых патологий
79 недоношенных новорождённых с осложнениями: - 20 с БЛД - 36 с РН - 23 с БЛД и РН
198 недоношенных новорождённых с тяжелой формой СДР
127 недоношенных новорождённых с умеренной формой СДР 8 недоношенных новорождённых с осложнениями: - 8 с РН
Рис. 1. Характеристика исследуемой группы новорожденных детей
компоненты системы ангиогенеза и ремоде-лирования ткани. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови проводили с помощью метода фенольно-хлороформ-ной экстракции [6]. Для выявления полиморфных вариантов c.-735C > T (rs2285053), C.-1575G > A (rs243 866) гена MMP2 и C.836A > G (2660А > G) p.Gln279Arg (rs17576), С.-1562С > T (rs3918242) гена MMP9; C.-634C > G (rs2010963), C.+936C > T (rs3025039) и C.-2578A > C/A > T (rs699947) гена VEGF; C.1416T > A (1719T > A), p.Gln472His (rs1870377) и с.-906A > G (rs2071559) гена KDR использовали метод ПЦР с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Для анализа полиморфизма C.-509A > G (rs1800469) гена TGFB1 применяли метод ПЦР в режиме реального времени, а микросателлитного локуса TGFBR1*6A гена TGFBR1 — фрагментный анализ. Шести аланинам (6А) в сигнальном домене рецептора TGFBR1 соответствовал детектируемый аллель 107 п. н., а девяти аланинам (9А) — аллель 115 п. н.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием программного обеспечения GraphPadlnStat Version 3.05 и онлайн-ресурса SNPStats. Для сравнения качественных признаков применяли критерий х2. Для проверки достоверности при сравнении частот генотипов в группах использовали точный критерий Фишера и отношение шансов (OR) с расчетом 95% доверительного интервала (CI). Статистически значимыми различия считались при р <0,05. При условии, когда объем выборки не превышал пяти случаев, использовали значение р с поправкой Йетса.
Результаты и обсуждение
Анализ распределения исследуемых полиморфных вариантов генов MMP2, MMP9, VEGF, KDR, TGFB1 и TGFBR1 проводили в четыре этапа: выявление риска развития СДР, анализ тяжести его течения, оценка риска развития БЛД и РН.
При анализе риска развития СДР у недоношенных новорожденных группу сравнения составили 242 доношенных новорожденных без исследуемых патологий (срок гестации 3740 недель). Распределение частот полиморф-
ных вариантов исследуемых полиморфных локусов у доношенных новорожденных соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.
Для выявления риска развития СДР тяжелой степени из 325 недоношенных новорожденных срока гестации 28-36 недель были сформированы две группы наблюдений: группа из 198 недоношенных детей с тяжелой формой СДР, критериями включения в которую являлись сурфактантная терапия, респираторная поддержка более суток, оксигенотерапия после перевода на спонтанное дыхание, и группа из 127 недоношенных новорожденных с СДР умеренной формы (респираторная поддержка не более суток).
Для оценки риска развития БЛД в качестве контроля подобрана группа из 100 недоношенных детей срока гестации 28-34 недели с СДР тяжелой формы без БЛД и РН, для выявления риска развития РН — группа из 187 недоношенных младенцев срока гестации 28-34 недели с СДР различной степени тяжести без исследуемых осложнений.
Определение риска развития СДР и тяжести его течения проводили как с учетом, так и без учета пола, в то время как деление групп с РН и БЛД по полу нецелесообразно из-за небольшого размера выборок. Доношенные новорожденные представлены по полу равномерно (1:1). В группу недоношенных младенцев входило 180 мальчиков (55%) и 145 девочек (45%). Распределение мальчиков и девочек в группах с СДР тяжелой и умеренной формы составляло 59% / 41% и 50% / 50% соответственно.
Помимо независимого анализа локусов в поиске рисковых и протективных полиморфных вариантов, ассоциированных с дыхательными расстройствами и РН, проводилось исследование комбинаций полиморфных локусов как относящихся к одному гену, так и к разным, учитывая их функциональную значимость. Так как ферменты ММП-2 и ММП-9 относятся к классу желатиназ, имеют схожие субстраты для расщепления, функции и регулируются схожими транскрипционными факторами, был проведен анализ сравнения комбинаций ло-кусов, кодирующих их генов ММР2 и ММР9. Сигнал от молекулы фактора роста внутрь клетки передается через его рецептор, поэтому проведен анализ комбинаций локусов генов,
кодирующих факторы роста и их рецепторы: УЕОГ/КОЯ и TGFp1/TGFBRL Фактор TGFpl может контролировать экспрессию ММП-2 и ММП-9 на уровне транскрипции, которые, в свою очередь, активируют путем протеолиза латентные TGFpl во внеклеточном матриксе [5, 7]. Исходя из этого, проведен поиск ассоциации комбинаций исследуемых локусов с риском развития и тяжести течения СДР, БЛД и РН.
Определение риска развития СДР у недоношенных новорожденных с учетом и без учета пола
Сравнение групп доношенных и недоношенных новорожденных с СДР без учета пола не выявило значимых различий во встречаемости генотипов исследуемых локусов, за исключением полиморфного локуса -735С > Т ММР2 (ге243866). Обнаружено, что мажорный аллель -735С достоверно реже, а минорный аллель -735Т достоверно чаще (р = 0,047) встречались в группе недоношенных новорожденных.
При разделении сравниваемых групп по гендерному признаку обнаружено, что генотип 2660АА (ге17576) гена ММР9 в 1,5 раза чаще встречался у недоношенных девочек (р = 0,02). В группе мальчиков достоверных различий распределения частоты встречаемости полиморфных вариантов исследуемых локусов выявлено не было.
Анализ комбинации локусов выявил, что носительство комбинации -1575GG/ -1562СС ММР2/ММР9 повышает риск развития СДР (р = 0,015), в то время как ком-
бинации -1575GG/-1562CT MMP2/MMP9, -735CC/-1562CTMMP2/MMP9 снижают этот риск (р = 0,008 и р = 0,016 соответственно). Комбинация -2578AA/-906AG VEGF/KDR встречалась в 1,7 раза чаще в группе доношенных новорожденных, чем в группе недоношенных младенцев (р = 0,017). При поиске ассоциации с риском развития СДР сочетания генов, кодирующих ММП и трансформирующий фактор роста и его рецептор, обнаружено, что гетерозигота локуса -1562C > T MMP9 в составе с гомозиготой 9А/9А гена TGFBR1 и гомозиготой -509GG гена TGFB1 образует две протективные комбинации (р = 0,02 и р = 0,028 соответственно).
При разделении исследуемых групп по полу выявлено, что сочетание -1575GG/-1562CT MMP2/MMP9 встречалось в 2,3 раза чаще среди доношенных мальчиков, чем среди недоношенных (р = 0,007). У девочек обнаружено, что встречаемость комбинации -735CC/2660AG MMP2/MMP9 в 1,4 раза выше среди доношенных (р = 0,036), чем среди недоношенных. Также показана рисковая значимость в развитии СДР среди недоношенных девочек комбинации -1562CC/2660AA гена MMP9 (р = 0,011), что соответствует рисковому среди девочек генотипу 2660AA гена MMP9 при независимом анализе локусов.
В таблице 1 представлены повышающие и снижающие риск развития СДР у недоношенных детей полиморфные варианты и их комбинации генов MMP2, MMP9, VEGF, KDR, TGFB1 и TGFBR1.
Таблица 1
Рисковые и протективные полиморфные варианты и их комбинации в развитии СДР
Полиморфные варианты и их комбинации генов VEGF, KDR, MMP2, MMP9, TGFB1, TGFBRI Выборка, n (N) OR (95% CI); р
Пациенты Группа сравнения Все пациенты Мальчики Девочки
-735C MMP2 526 (628)1 419 (476)1 0,70 (0,50-0,99); 0,047
-735T MMP2 102 (628)1 57 (476)1 1,43 (1,01-2,02); 0,047
2660AA MMP9 59 (142)3 30 (109)3 1,87 (1,09-3,20); 0,02
-1575GG/-1562CC MMP2/MMP9 126 (296)1 75 (235)1 1,58 (1,11-2,26); 0,015
Окончание таблицы 1
Полиморфные варианты и их комбинации генов УБОГ, КБЯ, ММР2, ММР9, TGFB1, TGFВRI Выборка, п (№) OR (95% С1); р
Пациенты Группа сравнения Все пациенты Мальчики Девочки
-157500/-1562СТ ММР2/ММР9 35 (296)1 48 (235)1 0,52 (0,33-0,84); 0,008
-157500/-1562СТ ММР2/ММР9 16 (173)2 23 (107)2 0,37 (0,19-0,74); 0,007
-735СС/-1562СТ ММР2/ММР9 55 (310)1 62 (235)1 0,60 (0,40-0,91); 0,016
-2578АА-906А0 УЕОЕ/КВЯ 31 (284)1 43 (234)1 0,54 (0,33-0,90); 0,017
9А_9А/-1562СТ ТОЕВЯ1/ММР9 59 (297)1 61 (232)1 0,62 (0,41-0,93); 0,02
-50900/-1562СТ ТОЕВ1/ММР9 31 (304)1 39 (232)1 0,56 (0,34-0,93); 0,028
-1562СС/2660АА ММР9 59 (139)3 29 (109)3 2,03 (1,18-3,50); 0,011
-735СС/2660А0 ММР2/ММР9 45 (141)3 49 (109)3 0,57 (0,34-0,96); 0,036
Примечание. п — количество новорожденных (аллелей) с исследуемым полиморфным вариантом или их комбинацией, N — общее количество исследуемых новорожденных (аллелей): 1 — без учета пола; 2 — среди мальчиков; 3 — среди девочек. В таблице представлены только статистически значимые различия между сравниваемыми группами
Определение риска тяжести течения СДР у недоношенных новорожденных с учетом и без учета пола
Статистически значимых различий по частотам встречаемости генотипов и аллелей локусов исследуемых генов в изучаемых выборках независимо от пола обнаружено не было. В группе мальчиков с СДР тяжелой степени в гене TGFB1 аллель -509А встречался в 1,5 раза чаще, чем у мальчиков с СДР умеренной степени, а аллель -5090 — в 1,2 раза реже (р = 0,02). Также у мальчиков, носителей генотипа -50900 TGFB1, риск развития СДР тяжелой степени (р = 0,02) снижен. Среди девочек достоверной разницы в частотах распределения генотипов и аллелей исследуемых локусов генов ММР2, ММР9, УЕОГ, КБЯ, ТОГВ1 и ТОГВЯ! не выявлено.
При анализе комбинаций локусов обнаружено, что гомозигота по аллелю 6А микро-сателлитного локуса TGFBR1*6A совместно с генотипом -735СС и -15750А гена ММР2 образует два сочетания, протективных в разви-
тии СДР тяжелой степени (р = 0,01 и р = 0,02 соответственно). При учете гендерного признака у мальчиков выявлена одна повышающая и шесть снижающих риск развития СДР тяжелой степени комбинации. Так, гетерозигота -509А0 гена TGFB1 в комбинации с гомозиготой 00 локуса -15750 > А гена ММР2 является рисковой (р = 0,031) в развитии СДР тяжелой степени. А генотип -50900 гена TGFB1, снижающий риск развития СДР тяжелой степени среди мальчиков при независимом анализе ло-кусов, вошел в три протективные комбинации в сочетании с генотипами -157500 (р = 0,02) и -735СС (р = 0,033) генаММР2, и 2660А0 гена ММР9 (р = 0,005). Также выявлены две благоприятные комбинации, в составе которых содержится гомозигота СС локуса -735С > Т гена ММР2 совместно с гомозиготой 6А/6А микро-сателлитного локуса гена ТОГВЯ! и генотипом 2660А0 генаММР9 (р = 0,033 и р = 0,038 соответственно). Обнаружено, что мальчики, носители комбинации +936СТ/-2578АА УЕОГ, имели сниженный риск развития СДР тяжелой
степени (р = 0,039).
Среди девочек риск развития СДР тяжелой степени повышен при наличии комбинации +936СТ/1719ТА ГЕОГ/КБЯ (р = 0,021), а комбинации -2578АС/1719ТТ ГЕОГ/КБЯ (р = 0,035) и -509AG/-1562CC ТОГВ1/ММР9
(р = 0,028) являются протективными при развитии СДР тяжелой степени.
Все значимые в развитии СДР тяжелой степени полиморфные варианты и их комбинации генов ММР2, ММР9, ГЕОГ, КОЯ, ТОГВ1 и ТОГВЯ1 представлены в таблице 2.
Таблица 2
Рисковые и протективные полиморфные варианты и их комбинации в развитии СДР
тяжелой степени
Полиморфные варианты и их комбинации генов VEGF, KDR, MMP2, MMP9, TGFB1, TGFBRI Выборка, n (N) OR (95% CI); р
Пациенты Группа сравнения Все пациенты Мальчики Девочки
-509A TGFB1 85 (218)2 31 (120)2 1,84 (1,12-3,0); 0,02
-509G TGFB1 133 (218)2 89 (120)2 0,55 (0,33-0,89); 0,02
-509GG TGFB1 41 (109)2 34 (109)2 0,46 (0,24-0,88); 0,02
6A_6A/-1575GA TGFBR1/MMP2 4 (183)1 10 (117)1 0,24 (0,07-0,78); 0,02
6A_6A/-735CC TGFBR1/MMP2 10 (181)1 17 (116)1 0,34 (0,15-0,77); 0,01
6A_6A/-735CC TGFBR1/MMP2 4 (109)2 8 (57)2 0,23 (0,07-0,81); 0,033
-735CC/2660AG MMP2/MMP9 28 (112)2 25 (61)2 0,48 (0,25-0,93); 0,038
+936CT/-2578AA VEGF 4 (111)2 8 (60)2 0,24 (0,07-0,84); 0,039
-509AG/-1575GG TGFB1/MMP2 35 (109)2 10 (60)2 2,37 (1,07-5,21); 0,031
-509GG/-1575GG TGFB1/MMP2 18 (109)2 20 (60)2 0,40 (0,19-0,83); 0,02
-509GG/-735CC TGFB1/MMP2 25 (108)2 24 (60)2 0,45 (0,23-0,90); 0,033
-509GG/2660AG TGFB1/MMP9 15 (109)2 20 (60)2 0,32 (0,15-0,69); 0,005
-509AG/-1562CC TGFB1/MMP9 18 (73)3 27 (62)3 0,42 (0,20-0,88); 0,028
+936CT/1719TA VEGF/KDR 13 (76)3 2 (61)3 6,09 (1,32-28,1); 0,021
-2578AC/1719TT VEGF/KDR 15 (73)3 23 (61)3 0,43 (0,20-0,92); 0,035
Примечание. п — количество новорожденных (аллелей) с исследуемым полиморфным вариантом или их комбинацией, N — общее количество исследуемых новорожденных (аллелей): 1 — без учета пола; 2 — среди мальчиков; 3 — среди девочек. В таблице представлены только статистически значимые различия между сравниваемыми группами
Определение риска развития БЛД у недоношенных новорожденных
Независимый и комбинативный анализ локусов генов ММР2, ММР9, УЕОР, КОЯ, ТОРВ1 и ТОРВЯ1 выявил повышенный риск развития БЛД только у носителей комбинации -50900/266000 ТОРВ1/ММР9 (р = 0,03).
Определение риска развития РН у недоношенных новорожденных
Статистически значимые различия в частотах распределения генотипов 11 исследуемых локусов генов ММР2, ММР9, УЕОР, КОЯ, ТОРВ1 и ТОРВЯ1 между недоношенными новорожденными с РН и контрольной для них группой обнаружены только в локусе 2660А > 0 генаММР9: генотип 2660АА достоверно чаще встречался у новорожденных с РН (р = 0,02), а 2660А0 — у новорожденных без данного осложнения (р = 0,029).
Поиск комбинаций полиморфных вариантов исследуемых генов, ассоциированных с риском развития РН, выявил пять рисковых и три протективных сочетания. Так, частота встречаемости комбинации -2578АА/-906АА УЕОР/КОЯ в 2,2 раза выше у младенцев с РН, чем у недоношенных детей без осложнений в сроке гестации 28-34 недели (р = 0,047). Также риск развития ретинопатии недоношенных повышен у носителей комбинаций, в составе
которых встречается выявленный при независимом анализе рисковый в развитии РН генотип 2660АА гена ММР9: -735СТ/2660АА ММР2/ММР9 (р = 0,044), -157500/2660АА ММР2/ММР9 (р = 0,024), -1562СС/2660АА ММР9 (р = 0,013). В группе младенцев с РН встречаемость комбинации 6А_9А/-1575АА ТОРВЯ1/ММР2 составила 6,5%, в то время как в контрольной группе такая комбинация не встречалась (р = 0,005).
Две комбинации, в состав которых входит выявленная при независимом анализе про-тективная гетерозигота 2660А0 гена ММР9, снижают риск развития РН: 9А_9А/2660А0 ТОРВЯ1/ММР9 (р = 0,04) и -50900/2660А0 ТОРВ1/ММР9 (р = 0,03). Также протективным является сочетание гомозиготы по аллелю 9А микросателлитного локуса TGFBR1*6A и гомозиготы СС локуса 735С > Т гена ММР2 (р = 0,037).
В таблице 3 представлены все значимые в развитии БЛД и РН полиморфные варианты и их комбинации генов ММР2, ММР9, УЕОР, КОЯ, ТОРВ1 и ТОРВЯ1.
На рисунке 2 представлены генотипы, аллели, комбинации генотипов исследуемых локу-сов генов УЕОР, КОЯ, ММР2, ММР9, TGFB1, TGFВR1, для которых выявлены статистически значимые различия в группах сравнения.
Таблица 3
Рисковые и протективные полиморфные варианты и их комбинации в развитии БЛД и РН
Полиморфные варианты и их комбинации генов УБОГ, КБЯ, ММР2, ММР9, TGFB1, TGFВRI Выборка, п (№) OR (95% С1); р
Пациенты Группа сравнения
Риск развития БЛД
-50900/266000 ТОРВ1/ММР9 6 (38) 3 (94) 5,69 (1,34-24,1); 0,03
Риск развития РН
2660АА ММР9 37 (66) 70 (182) 2,04 (1,15-3,61); 0,02
2660А0 ММР9 20 (66) 85 (182) 0,50 (0,27-0,90); 0,029
-2578АА/-906АА УЕОР/КБЯ 10 (60) 13 (174) 2,48 (1,02-5,99); 0,047
-735СТ/2660АА ММР2/ММР9 10 (65) 12 (180) 2,55 (1,04-6,22); 0,044
-157500/2660АА ММР2/ММР9 25 (65) 43 (182) 2,02 (1,10-3,70); 0,024
Окончание таблицы 3
Полиморфные варианты и их комбинации генов УБвГ, КОЯ, ММР2, ММР9, TGFB1, TGFВRI Выборка, п (№) OR (95% С1); р
Пациенты Группа сравнения
-1562СС/2660АА ММР9 37 (64) 70 (179) 2,13 (1,20-3,81); 0,013
6А_9А/-1575АА ТОЕБЯ1/ММР2 4 (62) 0(172) 26,5 (1,4-500,7); 0,005
9А_9А/-735СС ТО¥БК1/ММР2 25(62) 96(169) 0,51 (0,28-0,93); 0,037
9А_9А/2660Ав ТОЕБЯ1/ММР9 13 (63) 60 (171) 0,48 (0,24-0,96); 0,04
-5090в/2660Ав ТОЕБ1/ММР9 4 (61) 34 (176) 0,29 (0,10-0,86); 0,033
Примечание. п — количество новорожденных с исследуемым полиморфным вариантом или их комбинацией, N — общее количество исследуемых новорожденных
Рис. 2. Рисковые (А, Б) и протективные (В, Г) генотипы локусов и их комбинации генов УЕОГ, КВЯ, ММР2, ММР9, TGFB1, TGFВR1 в развитии и тяжести течения СДР, БЛД и РН
Рассматриваемые полиморфизмы генов VEGF, KDR, MMP2, MMP9, TGFB1, TGFBR1 имеют функциональное значение: локусы, расположенные в промоторной области гена, ответственны за дифференцированную экспрессию генов за счет изменения взаимодействия между транскрипционными факторами и сайтами их связывания; локусы, расположенные в экзонах, ответственны за модификацию структуры белков.
Однонуклеотидные полиморфные варианты генов VEGF и KDR, рассматриваемые независимо друг от друга в нашем исследовании, не показали значимой ассоциации с риском развития СДР, тяжести его течения, РН и БЛД. Схожие результаты были получены у M. Mahlman с соавторами при поиске ассоциации 31 полиморфизма генов VEGF и KDR с риском развития БЛД в финской популяции [8]. В других исследованиях показано, что аллель -634G локуса rs2010963 гена VEGF является рисковым в развитии БЛД в японской популяции [9], ассоциирован с тяжестью течения РН среди младенцев из Египта и Турции, что характерно и для аллеля +936T (rs3025039) гена VEGF [10, 11]. Повышен риск развития диабетической РН у носителей аллеля С ло-куса -2578C > A (rs699947) гена VEGF в азиатской популяции и индонезийцев, но не в европейской популяции [12]. В этом же локусе аллель А встречался достоверно реже у турецких мальчиков с РН 4-5 стадии по сравнению с недоношенными без РН или с РН 1-3 стадии [11]. В исследованиях Yuan с соавторами не наблюдалось связи локуса -906A > G гена KDR с диабетической и пролиферативной диабетической РН у пациентов Северного Китая, хотя в других исследованиях такая связь была выявлена [13]. Противоречивые результаты разных исследователей об ассоциации полиморфных локусов генов VEGF и KDR и риска развития БЛД и РН, могут быть связаны с этнической принадлежностью, размером выборки, дизайном исследования, включением или исключением критериев в анализе.
Снижение риска развития СДР при наличии комбинации -2578AA/-906AG VEGF/ KDR и тяжести его течения у мальчиков при наличии сочетания +936CT/-2578AA VEGF с функциональной точки зрения может обеспечиваться генотипом -906AG и +936CT
соответственно, так как генотип -2578АА снижает уровень экспрессии гена УЕОР за счет изменения сайта связывания с фактором транскрипции, что нарушает ангиогенез и способствует нарастанию дыхательной недостаточности [14]. В локусе +936С > Т (ге3025039) гена УЕОР и -906А > 0 (^2071559) гена КОЯ потеря потенциального сайта связывания с транскрипционными факторами, снижение экспрессии гена и уровня белка в плазме происходит при наличии аллелей Т и 0 соответственно [15, 16].
Рисковая +936СТ/1719ТА УЕОР/КОЯ и про-тективная -2578АС/1719ТТ УЕОР/КОЯ комбинации, ассоциированные с тяжестью течения СДР у девочек, объясняются, вероятно, кумулятивным функциональным действием входящих в них генотипов. У носителей генотипа ТТ локуса 1719Т > А (^1870377) гена КОЯ эффективность связывания рецептора с фактором роста эндотелия сосудов не изменена (при генотипе АА — снижена) [16].
Комбинаций генотипов локусов генов УЕОР и/или КОЯ, сопряженных с развитием БЛД и РН, не выявлено, за исключением рисковой в развитии РН -2578АА/-906АА УЕОР/КОЯ. Гипероксией индуцированное снижение концентрации фактора роста 'УЕ0Е в сочетании с генотипом -2578АА играют ключевую роль в развитии первой фазы РН.
Отсутствие значимых в определении риска развитии РН результатов при независимом анализе локусов генов УЕОР и КОЯ и только одна выявленная рисковая комбинация (при известном факте участия "УЕ0Б в неоваскуляризации и ангиогенезе), вероятно, объясняется небольшим размером выборки пациентов с осложнением, акцентом на риск развития РН, а не тяжестью ее течения (пациентов с 1-3 и 4-5 стадиями РН были объединены в одну группу).
В нашем исследовании в наибольшее количество комбинаций, как рисковых, так и протек-тивных, входили локусы генов ММР2 и ММР9.
Концентрация ММП динамически изменяется как в физиологических, так и в патологических процессах. Низкая активность ММП-2 является фактором риска развития дыхательных нарушений у недоношенных новорожденных, при этом для развития БЛД необходима высокая концентрация ММП-2 в первые дни после рождения [17]. Однако в дальнейшем,
уже при наличии БЛД, наблюдаются сниженные концентрации ММП-2 и повышенные концентрации ММП-9 [18]. При кислородной терапии и/или ИВЛ у недоношенных новорожденных происходит увеличение уровня Т0Бр1 (контролирует экспрессию ММП-2 и ММП-9), что приводит к воспалению, индуцированному гипоксией острому повреждению легких и развитию БЛД [19].
Обнаруженный в нашем исследовании повышающий риск развития СДР без учета пола аллель Т локуса -735С > Т (ге2285053) гена ММР2 снижает активность промотора, концентрацию белка в плазме, что повышает риск развития дыхательных осложнений у недоношенных детей [20]. Протективный в развитии СДР без учета пола аллель -735С и комбинации, в состав которых входит генотип -735СС гена ММР2 (-735СС/-1562СТ ММР2/ММР9 без учета пола, -735СС/2660А0 ММР2/ММР9 у девочек) (рис. 2В), обеспечивают снижение риска развития СДР и тяжести его течения за счет нормальной или повышенной активности промоторов их генов.
Повышающая риск развития СДР комбинация -157500/-1562СС ММР2/ММР9 вне зависимости от пола и комбинация -1562СС/2660АА гена ММР9 у девочек функционально объясняется генотипом СС локуса -1562С > Т гена ММР9 (аллель С обеспечивает связь промотора гена с ингибитором транскрипции) при нормальной активности промотора гена ММР2 (генотип 00 локуса -15750 > А) и нормальной аффинности ММП-9 с субстратом (генотип 2660ААММР9) [20]. В то же время выявленная при независимом анализе рисковость генотипа 2660АА гена ММР9 у девочек, вероятно, обеспечивается другими факторами.
Комбинации 9А_9А/-1562СТ ТОРВЯ1/ ММР9, -73 5СС/-1562СТ ММР2/ММР9 и -50900/-1562СТ ТОРВ1/ММР9 без учета пола и -157500/-1562СТ ММР2/ММР9 у мальчиков снижают риск развития СДР, что функционально обеспечивается кумулятивным эффектом входящих в них генотипов, одним из которых во всех 4 вариантах является гетерозигота локуса -1562С > Т гена ММР9.
В развитии СДР тяжелой формы среди мальчиков статистически значимые результаты показал локус -509А > 0 гена TGFB1 как неза-
висимо, так и в сочетании с локусами других генов. Так, рисковый аллель -509А увеличивает сродство промотора к транскрипционному фактору на 30%, тем самым увеличивает уровни Т0Бр1 в плазме и опосредованно влияет на воспаление и ремоделирование дыхательных путей [21], что объясняет и рисковость комбинации -509А0/-157500 ТОРВ1/ММР2 (генотип 00 локуса -15750 > А гена ММР2 обеспечивает нормальную активность промотора). Аллель -5090 и генотип -50900, снижающие активность промотора гена TGFB1, а также сочетания этого генотипа с локусами генов ММР2 и ММР9, характеризуются про-тективным эффектом в риске развития СДР тяжелой степени у мальчиков. У девочек про-тективные свойства комбинации -509А0/-1562СС ТОРВ1/ММР9 в риске развития СДР тяжелой степени, вероятно, обеспечиваются аллелем 0 гетерозиготы локуса -509А0 гена ТОРВ1. Противоречивые результаты показаны относительно ассоциации этого полиморфного локуса и заболеваний дыхательной системы: например, как генотип АА [21], так и генотип 00 [22] был связан с повышенным риском развития астмы.
У носителей комбинаций 6А_6А/-735СС ТОРВЯ1/ММР2 (особенно среди мальчиков), 6А_6А/-15750А ТОРВЯ1/ММР2 риск развития СДР тяжелой степени снижен, что функционально связано с генотипами локусов гена ММР2. Генотипу 6А соответствует делеция трех аланинов в гидрофобном ядре сигнальной последовательности рецептора. В результате посттрансляционного расщепления пробелка TGFBR1 высвобождаются разные сигнальные пептиды, один из которых короче на три аланина, в результате чего рецептор обладает сниженной активностью передачи рост-инги-бирующих сигналов [23, 24].
Рисковая в развитии БЛД комбинация -50900/266000 ТОРВ1/ММР9 приводит к снижению активности промотора гена TGFB1 и снижению аффинности связывания ММП-9 с субстратом (при генотипе 00 изменяется конформация белка ММП-9), что функционально должно снижать риск развития БЛД. Вероятно, противоположный эффект выявленного сочетания генотипов обеспечивается другими факторами. По литературным данным зависимости этого локуса с риском
развития БЛД выявлено не было [25].
Повышающие риск развития РН сочетания генотипов исследуемых локусов функционально определяются входящим в их состав генотипом АА локуса 2660А > 0 гена ММР9 (связывание фермента с субстратом не нарушено, что способствует неоваскуляризации) и генотипами других локусов, обеспечивающих нормальную активность промоторов их генов. Протективный в развитии РН генотип 2660А0 гена ММР9, выявленный при независимом исследовании локусов, обеспечивает протективность комбинаций 9А_9А/2660А0 ТОРВЯ1/ММР9 и -50900/2660А0 ТОРВ1/ ММР9. Гомозигота по варианту 9А гена ТОРВЯ1 в сочетании с генотипом -735СС гена ММР2 снижает риск развития РН, а гетерози-гота 6А/9А локуса TGFBR1*6A в комбинации с -1575АА гена ММР2 — увеличивает, что функционально обеспечивается вариантами локуса TGFBR1*6A.
Так как рассматриваемые заболевания являются полиэтиологическими, выявленные рисковые полиморфные варианты рассматриваются как один из факторов, способствующих развитию патологии.
Заключение
Выявлено влияние локуса -735С > Т гена ММР2 на риск развития СДР при независимом исследовании локусов: аллель Т — рисковый, аллель С — протективный без учета пола. При комбинативном анализе определены шесть снижающих риск развития СДР и тяжесть его течения сочетаний генотипа -735СС с локуса-ми генов ММР9, TGFB1 и TGFВR1.
Обнаружено статистически значимое влияние на риск развития СДР как с учетом, так и без учета пола локуса -1562С > Т гена ММР9 только в комбинации с другими локу-сами, рисковой из которых без учета пола является -157500/-1562СС ММР2/ММР9.
Определены статистически значимые различия в ассоциации полиморфных вариантов изучаемых локусов с развитием и течением СДР с учетом пола. Так, у девочек значимым в развитии СДР является генотип 2660АА ло-куса 2660А > 0 гена ММР9, который образует значимые комбинации с другими локусами, рисковой из них является -1562СС/2660АА ММР9. Значимым в развитии тяжелой формы
СДР у девочек является локус 1719T > A гена KDR (только в комбинации с другими локуса-ми), а у мальчиков — локус -509А > G гена TGFB1 (аллель -509А — рисковый, аллель -509G и генотип -509GG — протективные). У девочек риск развития СДР тяжелой степени связан с комбинацией +936CT/1719TA VEGF/KDR, у мальчиков — с комбинацией -509AG/-1575GG TGFB1/MMP2.
Риск развития БЛД и РН у недоношенных новорожденных срока гестации 28-34 недели связан с полиморфными вариантами локуса 2660А > G гена MMP9. Риск развития БЛД повышен у носителей комбинации -509GG/2660GG TGFB1/MMP9. С риском развития ретинопатии ассоциированы генотип 2660AAMMP9 и три комбинации, в состав которых он входит.
С риском развития РН связаны также комбинации локусов 6А_9А/-1575AA TGFBR1/ MMP2 и -2578AA/-906АА VEGF/KDR.
Полученные данные могут быть использованы в клинической практике в качестве генетических маркеров раннего выявления осложнений перинатального периода, что позволит скорректировать тактику лечения недоношенных новорожденных, увеличить показатели выживаемости, а также снизить тяжесть инвалидности детей.
Список использованных источников
1. Child mortality and causes of death [Electronic resource] // World Health Organization. - Mode of access: https://www.who.int/data/gho/data/ indicators. - Date of access: 07.08.2023.
2. Гнедько, Т. В. Технологии выхаживания недоношенных детей: индикаторы эффективности внедрения / Т. В. Гнедько // Рос. Вестн. Перинат. Педиатр. - 2021. - Т. 66, № 3. -С.102-109.
3. Chandrasekharan, P. Complications of prematurity: an infographic / P. Chandrasekharan, M. Rawat, S. Lakshminrusimha // J. Perinatol. -2017. - Vol. 37. - P. 1 185-1 186.
4. Retinopathy of prematurity: a review of risk factors and their clinical significance / S. J. Kim [et al.] // Surv. Ophthalmol. - 2018. - Vol. 63. -P. 618-637.
5. Krstic, J. Transforming growth factor-beta and matrix metalloproteinases: functional interactions in tumor stroma-infiltrating
myeloid cells [Electronic resource] / J. Krstic, J. F. Santibanez // Sci. World. J. - 2014. -A. 521754. - P. 1-14. - Mode of access: http:// dx.doi.org/10.1155/2014/521754. - Date of access: 04.08.2023.
6. Mathew, C. C. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA / C.C. Mathew // Methods in Molecular Biology. - Clifton: Human Press. -1984. - Vol. 2, № 4. - P. 31-34.
7. Cui, N. Biochemical and biological attributes of matrix metalloproteinases / N. Cui, M. Hu, R. A. Khalil // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. -2017. - Vol. 147. - P. 1-73.
8. Genes encoding vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) and VEGF receptor 2 (VEGFR-2) and risk for bronchopulmonary dysplasia / M. Mahlman [et al.] // Neonatol. -2015. - Vol. 108. - P. 53-59.
9. Association of a vascular endothelial growth factor polymorphism with the development of bronchopulmonary dysplasia in Japanese premature newborns [Electronic resource] / K. Fujioka [et al.] // Sci. Rep. - 2014. - A. 4459. -Mode of access: https:// DOI: 10.1038/srep04459.
- Date of access: 04.08.2023.
10. An updated and comprehensive meta-anal-ysis of association between VEGFA -634G > C, -460T > C, +405G > C and +936C > T polymorphisms and retinopathy of prematurity risk, fetal and pediatric pathology [Electronic resource] / M. Gohari [et al.] // Fet. Pediatr. Pathol. - 2019.
- P. 1-17. - Mode of access: doi:10.1080/15513 815.2019.1703227. - Date of access: 12.12.2022.
11. Genetic polymorphisms of vascular endothelial growth factor in neonatal pathologies: a systematic search and narrative synthesis of the literature / M. G. Hasmasanu [et al.] // Children.
- 2023. - Mode of access: https://www.mdpi. com/2227-9067/10/4/744. - Date of access: 04.08.2023.
12. Polymorphisms of vascular endothelial growth factor -2578C/A rs699947 are risk factors for diabetic retinopathy in type-2 diabetes mellitus patients in Bali, Indonesia / W. A. Rachel [et al.] // BioMed. - 2021. - Vol. 11, № 2. - P. 11-17.
13. Association between the VEGFR-2 -604T/ C polymorphism (rs2071559) and type 2 diabetic retinopathy [Electronic resource] / Y. Yuan [et al.] // Open. Life. Sci. - 2023. - Vol. 18. - Mode of access: https://doi.org/10.1515/biol-2022-0081.
- Date of access: 04.08.2023.
14. Association of rs699947 (-2578 C/A) and rs2010963 (-634 G/C) single nucleotide polymorphisms of the VEGF gene, VEGF-A and leptin serum level, and cardiovascular risk in patients with excess body mass: a case-control study [Electronic resource] / D. Skrypnik [et al.] // J. Clin. Med. - 2020. - Vol. 9. - Р. 1-16. -Mode of access: https://www.mdpi.com/2077-0383/9/2/469. - Date of access: 04.08.2023.
15. Association of the rs2071559 (T/C) polymorphism with lymphatic metastasis in patients with nasopharyngeal carcinoma / K. Hu [et al.] // Onc. Lett. - 2017. - Vol. 14, № 6. -P. 7 681-7 686.
16. Germline polymorphisms of the VEGF pathway predict recurrence in nonadvanced differentiated thyroid cancer / V. Marotta [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2017. - Vol. 102, № 2. - P. 661-671.
17. Very low birth weight outcomes of the national institute of child health and human development neonatal network / M. Hack [et al.] // Pediatrics. - 1991. - Vol. 87. - P. 587-597.
18. Вязовая, И. В. Бронхолегочная диспла-зия у детей в фокусе фенотип-ассоциирован-ных полиморфизмов кандидатных генов / И. В. Вязовая, П. Б. Хиштилова // Фарматека.
- 2021. - № 10. - С. 46-51.
19. Conditional overexpression of TGFfil promotes pulmonary inflammation, apoptosis and mortality via TGFfiR2 in the developing mouse lung [Electronic resource] / A. Sureshbabu [et al.] // Resp. Res. - 2015. - Vol. 16. - Mode of access: https://doi.org/10.1186/s12931-014-0162-6. -Date of access: 04.08.2023.
20. Полиморфизмы генов MMP2 и MMP9 у недоношенных новорожденных с синдромом дыхательных расстройств / О. М. Малышева [и др.] // Молекулярная и прикладная генетика. - 2020. - Т. 28. - С. 59-69.
21. Transforming growth factor-b1 C-509T polymorphism, oxidant stress, and early-onset childhood asthma / M. T. Salam [et al.] / Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 2007. - Vol. 176.
- P. 1 192-1 199.
22. Variants in TGFB1, dust mite exposure, and disease severity in children with asthma / S. Sharma [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care. Med. - 2009. - Vol. 179, № 5. - P. 356-362.
23. Somatic acquisition and signaling of TGFBR1*6A in cancer / B. Pasche [et al.] //
JAMA. - 2005. - Vol. 294. - P. 1 634-1 646.
24. TGFBR1*6A as a modifier of breast cancer risk and progression: advances and future prospects [Electronic resource] / K. Agyemang [et al.] // Breast. Cancer. - 2022. - Vol. 84. - P. 1-9. - Mode of access: https://doi.org/10.1038/s41523-
022-00446-6. - Date of access: 04.08.2023.
25. Беляшова, М. А. Молекулярно-генети-ческие механизмы развития бронхолегочной дисплазии / М. А. Беляшова, Д. Ю. Овсянников, Л. М. Огородова // Неонат. Нов. Мнен. Обучен. - 2015. - № 3. - C. 50-68.
V. M. Malyshava1, A. P. Mikhalenka1, Yu. V. Paliukhovich1, E. I. Kuzminova1, A. P. Sukharava2, M. V. Artsiusheuskaya3, K. A. Gamolka2, A. V. Kilchevsky1
GENETIC POLYMORPHISM OF ANGIOGENESIS AND TISSUE REMODELING SYSTEM COMPONENTS IN PREMATURE NEWBORNS
WITH NEONATAL COMPLICATION
1 State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27 Akademicheskaya St., 220076 Minsk, the Republic of Belarus e-mail: o.malysheva@igc.by 2Clinical Maternity Hospital of Minsk Region 16 F. Skoriny St., 220114 Minsk, the Republic of Belarus
3State Educational Establishment "Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education" 3/3 P. Brovky St., 220013 Minsk, the Republic of Belarus
The allele frequency and genotype distribution ofMMP2 (-735C > T, -1575G > A),MMP9 (-1562C > T, 2660A > G), VEGF (-2578A > C, -634C > G, +936C > T), KDR (-906A>G, 1719T > A), TGFB1 (-509A > G), TGFBR1 (TGFBR1*6A) polymorphisms were investigated in 325 preterm neonates with a gestational age 28-36 weeks and in 242 full-term newborns (comparison group) in order to search for molecular markers in the development of respiratory distress syndrome (RDS), bronchopulmonary dysplasia (BPD) and retinopathy of prematurity (ROP).
A statistically significant effect on the risk of RDS development and its severity was found for the -735C > T MMP2 polymorphism, both independently (risk T allele and protective C allele), and in combination with other studied loci (6 protective combinations), and for the -1562C > T MMP9 polymorphism only in combination with other loci (2 risk and 5 protective combinations). In boys, the RDS severity is associated with the TGFB1 -509A > G gene polymorphism, including in combination with the analyzed MMP2 and MMP9 loci; in girls, the RDS severity is associated with the combinations of polymorphic variants of the KDR (1719T > A) and VEGF (-2578A > C, +936C > T) genes. The MMP9 2660A > G polymorphism and the TGFBR1*6A microsatellite are associated with the risk of a retinopathy incidence, both independently and in combination with other loci.
Keywords: gene polymorphism, premature newborns, respiratory distress syndrome, bronchopulmonary dysplasia, retinopathy of prematurity, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor, matrix metalloproteinases.
Дата поступления в редакцию: 31 августа 2023 г.
