CC BY
5УДК 577.21:575.174.015.3
О. М. Малышева1, Е. П. Михаленко1, М. В. Артюшевская2, А. П. Сухарева2'3, К. А. Гомолко23,
А. В. Кильчевский1, Г. А. Шишко2
ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ MMP2 И MMP9 У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С СИНДРОМОМ ДЫХАТЕЛЬНЫХ
РАССТРОЙСТВ
Тосударственное научное учреждение «Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 e-mail: o.malysheva@igc.by ^Государственное учреждение образования «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, ул. П. Бровки, 3, корпус 3 3Учреждение здравоохранения «Клинический родильный дом Минской области» Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Ф. Скорины, 16
Исследована частота встречаемости полиморфных вариантов -735 C>T rs2285053, -1575 G>A rs243866 гена MMP2 и c.836A>G p.Gln279Arg rs17576, -1562 C>T rs3918242 гена MMP9 у 188 недоношенных новорожденных в сроке гестации 28-36 недель с синдромом дыхательных расстройств (СДР) и 189 доношенных новорожденных (группа сравнения). Обнаружено статистически значимое увеличение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа -735СТ в группе недоношенных новорожденных с дыхательными нарушениями по сравнению c группой сравнения (p = 0,033) и у новорожденных с СДР тяжелой степени по сравнению с СДР умеренной степени тяжести (p = 0,035). Степень тяжести течения СДР у девочек ассоциировалась с аллелем -735Т, а у мальчиков — с -1575G гена ММР2. Показано, что генотип 836GG rs17576 гена MMP9 является рисковым в развитии СДР для девочек. Комбинации генотипов 836АА/-1562СС гена MMP9 и -735CC/-1575A- гена MMP2 достоверно чаще встречались у пациентов с СДР умеренной степени тяжести (p = 0,038 и p = 0,019 соответственно).
Ключевые слова: синдром дыхательных расстройств, бронхолегочная дисплазия, недоношенные новорожденные, матриксные металлопротеиназы, полиморфизмы генов MMP2 и MMP9.
Введение
За период 2017-2019 гг. согласно отчетам об оказании медицинской помощи беременным, роженицам и родильницам в Республике Беларусь удельный вес преждевременных родов составил около 4%. Недоношенные новорожденные из-за незрелости органов и систем испытывают проблемы с дыханием, питанием, зрением, слухом, имеют неврологические расстройства, задержку развития. Риск смерти в периоде новорожденности у недоношенных детей в 20 раз превышает этот показатель у детей, родившихся в срок [1-3]. Поэтому проблема недоношенности остается актуальной для нашей страны.
Наиболее частым нарушением со стороны дыхательной системы у недоношенных новорожденных является синдром дыха-
тельных расстройств, который развивается из-за недостатка сурфактанта и незрелости легких и является наиболее частой причиной формирования хронической патологии дыхательной системы, а также смерти новорожденного [4-6].
Легкие недоношенного новорожденного, родившегося в сроке гестации 28-36 недель, проходят саккулярную и альвеолярную стадии развития. В этот период образуются альвеолярные протоки, альвеолы (путем сеп-тации альвеолярных саккул) и сеть капилляров, окружающая альвеолы, увеличивается газообменная поверхность и синтезируется сурфактант (с 26 недели гестации) [7]. Ключевую роль в ремоделировании внеклеточного матрикса, происходящем при альвеоля-ризации и ангиогенезе, играют матриксные
металлопротеиназы (ММП), цинк-зависимые протеолитические ферменты, расщепляющие все формы компонентов матрикса. ММП оказывают регуляторное влияние на ангиогенез в легком, высвобождая из внеклеточного матрикса фактор роста фибробластов (FGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), которые, в свою очередь, способны увеличивать экспрессию металлопротеиназ, важных для развития сосудов. В образовании альвеолярных протоков и альвеол принимают участие ММП-14 и ММП-2. Дефицит ММП-2 приводит к отсроченной альвеоляризации в ассоциации с утолщенными легочными артериями и повышенным периваскулярным содержанием коллагена и эластина. Во время альвеоляри-зации увеличивается экспрессия ММП-9, источником которой являются клетки бронхиального эпителия, макрофаги и альвеолоциты II типа [7-9].
Полиморфизмы в генах ММР2 и ММР9 могут модифицировать их экспрессию, влиять на функцию активных ферментов и изменять их роль как в физиологическом ангиогенезе и альвеоляризации, так и в патогенезе респираторных нарушений.
Цель данного исследования — изучить связь полиморфных вариантов генов ММР2
и ММР9 с тяжестью синдрома дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных, а также их распределение в основной группе и в группе сравнения (здоровые доношенные новорожденные).
Материалы и методы
В исследование включен 377 образец ДНК детей, родившихся в УЗ «Клинический родильный дом Минской области» в 2016-2020 гг.
Распределение пациентов по группам, а также критерии включения пациентов в исследуемые группы показано на рисунке 1.
Соотношение мальчиков и девочек было одинаковым в подгруппах с умеренной и тяжелой формами СДР. В подгруппе СДР умеренной степени преобладали новорожденные со сроком гестации 32-36 недель (57,1%), а в подгруппе СДР тяжелой степени — новорожденные 28-32 недели (81,1%) (р < 0,001).
Критерии исключения пациентов из исследования: многоплодная беременность, наследственные и врожденные заболевания, ВИЧ-инфекция у матери, инфекционные болезни, специфичные для перинатального периода.
Сбор биологического материала проводился с соблюдением этических норм (добро-
Рис. 1. Распределение пациентов и критерии их включения в исследуемые группы
вольность, конфиденциальность) с письменного информированного согласия законного представителя пациента. Получено разрешение Комитета по этике БелМАПО на проведение исследования.
Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов пуповинной и периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К с последующей очисткой этанолом [10]. Для выявления полиморфизмов -735 C>T (rs2285053), -1575 G>A (rs243866) гена MMP2 и c.836A>G p.Gln279Arg (rs17576), -1562 C>T (rs3918242) гена MMP9 использовали метод ПЦР с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). В таблице 1 представлены праймеры и эндонуклеазы рестрикции, использованные в работе [11-15].
Условия ПЦР подбирали экспериментально для каждой пары праймеров. Амплифи-цированные фрагменты исследуемых генов подвергали рестрикционному расщеплению соответствующей эндонуклеазой согласно инструкции фирмы-производителя. Продукты рестрикции фракционировали в горизонтальном агарозном геле с концентрацией 1,8-2,2% в зависимости от длины ПДРФ-фрагментов.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием онлайн-ресур-са SNPStats [16] и прикладной программы GraphPad InStat Version 3.05. Тест на соответствие контрольной выборки (группа сравнения) равновесию Харди-Вайнберга проводили с использованием метода х2 (а = 0,05; df = 1).
Связь между генотипами, гаплотипами и течением заболевания оценивали по отношению шансов (OR (95% CI)) с использованием кодо-минантной модели SNPStats. OR указан с 95%-ным доверительным интервалом (confidence interval — CI) [16]. Значение p менее 0,05 считалось статистически значимым. Когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали точный тест Фишера.
Результаты и обсуждение
Распределение частот полиморфных вариантов исследуемых локусов у новорожденных группы сравнения соответствовало равновесию Харди-Вайнберга.
Поиск ассоциаций между исследуемыми полиморфизмами и риском развития СДР проводили между общей выборкой недоношенных детей (основная группа) и группой сравнения (табл. 2).
Обнаружено, что генотип -735СС и мажорный аллель С достоверно чаще (OR = 0,52; 95% CI: 0,32-0,82; p = 0,0054 и OR = 0,51; 95% CI: 0,29-0,90; p = 0,022 соответственно) встречались в группе доношенных новорожденных, а генотип -735СТ и минорный аллель Т — достоверно чаще в основной группе (OR = 1,69; 95% CI: 1,05-2,71; p = 0,033 и OR = 1,95; 95% CI:1,11-3,43; p = 0,022). Можно предположить, что носительство генотипа СТ и аллеля Т полиморфизма rs2285053 является рисковым фактором в развитии СДР. Анализ распределения частоты встречаемости полиморфных вариантов rs243866, rs17576, rs3918242 у пациентов с СДР и в контрольной группе не выявил достоверных различий.
Полиморфизм Праймеры 5'-3' Длина продукта, п. н. Рестриктаза Длина ПДРФ-фрагментов, п. н. (аллель)
-735 C>T MMP2 F: ATAGGGTAAACCTCCCCACATT R: GCGTTAGAGACGTTGGAACC 349 HinfI 320+29 (C) 255+65+29 (T)
-1575 G>A MMP2 F: GTCTGAAGCCCACTGAGACC R: CTAGGAAGGGGGCAGATAGG 175 NlaIII 175 (G) 112+63 (A)
-1562 С>Т MMP9 F:ACGGTGCTTGACACAGTAAATCT R:GGCAGGGTCTATATTCACCTTCT 652 SphI 652 (С) 431+221 (T)
c.836 A>G MMP9 F: AATTCACCCTCCCGCACTCT R: GTTTTGGGGGCCAATACATGA 397 SmaI 397 (A) 224+173(G)
Таблица 1
Праймеры и эндонуклеазы рестрикции, использованные в работе
Таблица 2
Распределение частот полиморфных вариантов -735 ОТ, -1575 С>АтеяаММР2 и с.836А>0, -1562 ОТ генаММР9 у недоношенных новорожденных с СДР и в группе сравнения с учетом и без учета пола
Генотип Группа сравнения, п= 189 Основная группа, п= 188 ОЯ (95% С1) Р Мальчики Девочки
Группа сравнения, п= 96 Основная группа, 11 = 95 ОЯ (95% С1) Р Группа сравнения, п=93 Основная группа, 11 = 93 ОЯ (95% С1) Р
-735 С>Т (П52285053)Л4МР2
С/С 150 (79,4%) 125 (66,5%) 0,52 (0,32-0,82) 0,007 73 (76%) 61 (64,2%) 0,57(0,30-1,06) 0,1 77 (82,8%) 64 (68,8%) 0,46 (0,23-0,92) 0,052
С/Т 38 (20,1%) 56 (29,8%) 1,69 (1,05-2,71) 23 (24%) 32 (33,7%) 1,61 (0,86-3,04) 15(16,1%) 24 (25,8%) 1,81 (0,88-3,72)
тя 1 (0,5%) 7 (3,7%) 7,27 (0,89-59,69) 0 (0%) 2 (2,1%) ЫА (0,00-ЫА) 1 (1,1%) 5 (5,4%) 5,23 (0,60^15,64)
С 134 (87,0%) 172 (77,5%) 0,51 (0,29-0,90) 0,02 169 (88,0%) 154(81,1%) 0,58 (0,33-1,03) 0,06 169 (90,9%) 152(81,7%) 0,45 (0,24-0,84) 0,01
т 20(13,0%) 50 (22,5%) 1,95 (1,11-3,43) 23 (12,0%) 36(18,9%) 1,72 (0,97-3,03) 17(9,1%) 34(18,3%) 2,22 (1,19-4,14)
-1575 0>А (ге243866) А1А1Р2
О/О 105 (55,6%) 103 (54,8%) 0,97 (0,65-1,46) 0,99 60 (62,5%) 56 (59,0%) 0,86 (0,48-1,54) 0,87 45 (48,4%) 47 (50,5%) 1,09 (0,61-1,94) 0,95
О/А 71 (37,6%) 72 (38,3%) 1,03 (0,68-1,56) 31 (32,3%) 34 (35,8%) 1,17(0,64-2,13) 40 (43,0%) 38 (40,9%) 0,92 (0,51-1,64)
А/А 13(6,8%) 13 (6,9%) 1,01 (0,45-2,23) 5 (5,2%) 5 (5,2%) 1,01 (0,28-3,61) 8 (8,6%) 8 (8,6%) 1,00 (0,36-2,79)
О 281 (74,3%) 278 (73,9%) 0,98 (0,71-1,36) 0,90 151 (78,6%) 146 (76,8%) 0,90 (0,57-1,46) 0,67 130 (69,9%) 132 (71,0%) 1,05 (0,68-1,64) 0,82
А 97 (25,7%) 98 (26,1%) 1,02 (0,74-1,42) 41 (21,4%) 44 (23,2%) 1,11 (0,69-1,80) 56 (30,1%) 54 (29,0%) 0,95 (0,61-1,48)
с.836А>0р.01п279А^(ге17576)АШР9
О/О 56 (29,6%) 62 (33,0%) 1,17(0,77-1,81) 0,61 35 (36,5%) 28 (29,5%) 0,73 (0,40-1,34) 0,58 21 (22,6%) 34 (36,6%) 1,98 (1,04-3,76) 0,061
О/А 93 (49,2%) 83 (44,1%) 0,82 (0,54-1,22) 39 (40,6%) 44 (46,3%) 1,26 (0,71-2,24) 54 (58,1%) 39(41,9%) 0,52 (0,29-0,93)
А/А 40 (21,2%) 43 (22,9%) 1,10(0,68-1,80) 22 (22,9%) 23 (24,2%) 1,07(0,55-2,10) 18(19,3%) 20 (21,5%) 1,14(0,56-2,33)
О 205 (54,2%) 207(55,1%) 1,03 (0,78-1,38) 0,82 109 (56,8%) 100 (52,6%) 0,85 (0,57-1,27) 0,42 96(51,6%) 107 (57,5%) 1,27(0,84-1,91) 0,25
А 173(45,8%) 169 (44,9%) 0,97 (0,73-1,29) 83 (43,2%) 90 (47,4%) 1,18(0,79-1,77) 90 (48,4%) 79 (42,5%) 0,79 (0,52-1,19)
-1562 С>Т (геЗ918242) ММР9
С/С 120 (63,5%) 132 (70,2%) 1,40 (0,91-2,14) 0,61 63 (65,6%) 66 (69,5%) 1,19(0,65-2,19) 0,72 57(61,3%) 66 (71,0%) 1,54 (0,84-2,85) 0,36
С/Т 64 (33,9%) 50 (26,6%) 0,71 (0,45-1,10) 30 (31,3%) 25 (26,3%) 0,79 (0,42-1,47) 34 (36,6%) 25 (26,9%) 0,64 (0,34-1,19)
ТЯ 5 (2,6%) 6 (3,2%) 1,21 (0,36^,05) 3 (3,1%) 4 (4,2%) 1,36 (0,30-6,26) 2 (2,1%) 2 (2,1%) 1,00 (0,14-7,25)
С 304 (80,4%) 314 (83,5%) 1,23 (0,85-1,79) 0,27 156(81,3%) 157(82,6%) 1,10(0,65-1,85) 0,73 148 (79,6%) 157(84,4%) 1,39(0,82-2,37) 0,23
т 74(19,6%) 62 (16,5%) 0,81 (0,56-1,18) 36(18,8%) 33 (17,4%) 0,91 (0,54-1,54) 38 (20,4%) 29(15,6%) 0,72 (0,42-1,23)
Известно, что экспрессия и активность ММП регулируется половыми гормонами [8]. Поэтому проведено сравнение встречаемости генотипов исследуемых полиморфных вариантов между основной группой и группой сравнения с учетом пола (табл. 2). В группе мальчиков достоверных различий распределения частоты встречаемости полиморфных вариантов исследуемых локусов выявлено не было. В группе девочек выявлены достоверные различия по полиморфному варианту ге2285053 гена ММР2: генотип -735СС достоверно чаще ^ = 0,46; 95% С1: 0,23-0,92; р = 0,039) встречался в группе доношенных девочек. Как и при анализе основной группы без учета пола мажорный аллель С полиморфизма ге2285053 достоверно чаще встречался у доношенных девочек, а минорный аллель Т — у девочек с СДР (р = 0,011).
Также было обнаружено, что генотип 836GА ге17576 ММР9 достоверно чаще встречался у доношенных девочек (OR = 0,52; 95% С1: 0,29-0,93; р = 0,40), в то время как генотип 836GG ММР9 — у недоношенных девочек: OR = 1,98; 95% С1: 1,04-3,76; р = 0,053, однако статистическая достоверность не была достигнута (рис. 2).
Был проведен анализ связи исследуемых полиморфизмов с полом как в основной группе, так и в контрольной (расчетные данные не
приведены). Отличия между мальчиками и девочками в группе недоношенных новорожденных выявлены не были. В группе доношенных новорожденных выявлены достоверные различия по распределению полиморфных вариантов ге17576 гена ММР9: у мальчиков генотип 836 00 встречался в 1,62 раза достоверно чаще ДО = 1,97; 95% С1: 1,04-3,73; р = 0,04) чем у девочек; у девочек достоверно чаще встречался генотип 836GA: OR = 0,49; 95% С1: 0,28-0,88; р = 0,02 (рис. 2).
На следующем этапе проводился анализ связи изучаемых полиморфизмов с тяжестью течения синдрома дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных (табл. 3). Учитывая, что в исследуемой группе пациентов с СДР выявлено влияние гестацион-ного срока на тяжесть течения СДР, нами был проведен анализ частот встречаемости генотипов и аллелей -735 С>Т (ге2285053), -1575 G>A (^243866) генаММР2 и с.836 А^ р.^п279А^ (ге17576), -1562 С>Т (^3918242) у пациентов основновной группы со сроком гестации 28-32 недели и со сроком геста-ции 32-36 недель. Проведенный анализ не выявил достоверных различий в частотах распределения полиморфных вариантов изучаемых локусов в зависимости от гестаци-онного срока пациентов (расчетные данные не представлены).
р=0,04
70
$60 £
§ 50
Е а
£ 40
Щ
5 30 со
| 20 н
I 10
р=0,053
р=0,04
р=0,02
(
58Д
36,6
29,5
41,9
46,3
36,5
22,6
40,6
21 ч 24'2 22,9 - 19)4
С/С
С/А Генотип
А/А
Основная группа Группа сравнения
девочки а мальчики ■ девочки и мальчики
Рис. 2. Распределение частоты встречаемости генотипов полиморфизма ге17576 гена ММР9 в исследуемой
группе и в группе сравнения с учетом пола
Таблица 3
Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфизмов генов ММР2 и ММР9 у недоношенных новорожденных с СДР
разной степени тяжести с учетом и без учета пола
Генотип СДР умеренный, 11 = 77 СДР тяжелый, п= 111 ОЯ (95% С1) Р Мальчики Девочки
СДР умеренный, 11 = 38 СДР тяжелый, п=57 ОЯ (95% С1) Р СДР умеренный, 11 = 40 СДР тяжелый, п=53 ОЯ (95% С1) Р
-735 С>Т (гз2285053)Л4МР2
С/С 59 (76,6%) 66 (59,5%) 0,45 (0,23-0,86) 0,05 27(71,1%) 34 (59,6%) 0,63 (0,26-1,52) 0,46 32 (80,0%) 32 (60,4%) 0,38 (0,18-0,99) 0,12
С/Т 16 (20,8%) 40 (36,0%) 2,15 (1,10-4,21) 10 (26,3%) 22 (38,6%) 1,76 (0,72^1,32) 7(17,5%) 17(32,1%) 2,23 (0,82-6,05)
ТЯ 2 (2,6%) 5 (4,5%) 1,77 (0,33-9,36) 1 (2,6%) 1 (1,8%) 0,66 (0,04-10,90) 1 (2,5%) 4 (7,5%) 3,18(0,34-29,65)
С 134 (87,0%) 172 (77,5%) 0,51 (0,29-0,90) 0,02 64 (84,2%) 90 (78,9%) 0,70 (0,33-1,51) 0,37 71 (88,8%) 81 (76,4%) 0,41 (0,18-0,94) 0,032
т 20(13,0%) 50 (22,5%) 1,95 (1,11-3,43) 12(15,8%) 24 (21,1%) 1,42 (0,66-3,05) 9(11,3%) 25 (23,6%) 2,44(1,07-5,56)
-1575 0>А (ге243866) А1А1Р2
О/О 36 (46,8%) 67 (60,4%) 1,73 (0,96-3,12) 0,046 17(44,7%) 39 (68,4%) 2,68 (1,15-6,26) 0,032 19(47,5%) 28 (52.8%) 1,24 (0,54-2,82) 0,5
О/А 32 (41,5%) 40 (36,0%) 0,79 (0,44-1,44) 17(44,7%) 17 (29,8%) 0,53 (0,22-1,23) 16 (40,0%) 22 (41,5%) 1,06 (0,46-2,46)
А/А 9(11,7%) 4 (3,6%) 0,28 (0,08-0,95) 4(10,6%) 1 (1,8%) 0,15(0,02-1,41) 5(12,5%) 3 (5,7%) 0,42 (0,09-1,87)
О 104 (67,5%) 174 (78,4%) 1,74 (1,10-2,77) 0,019 51 (67,1%) 95 (83,3%) 2,45 (1,23-4,87) 0,01 54(67,5%) 78 (73,6%) 1,31 (0,71-2,54) 0,37
А 50 (32,5%) 48 (21,6%) 0,57 (0,36-0,91) 25 (32,9%) 19(16,7%) 0,41 (0,21-0,81) 26 (32,5%) 28 (26,4%) 0,75 (0,39-1,41)
с.836А>0р.01п279А^(ге17576)АШР9
О/О 20 (26,0%) 42 (37,8%) 1,74(0,92-3,28) 0,2 7(18,4%) 21 (36,8%) 2,58 (0,97-6,89) 0,11 14 (35,0%) 20 (37,7%) 1,13 (0,48-2,65) 0,96
О/А 39 (50,6%) 44 (39,6%) 0,64 (0,36-1,15) 22 (57,9%) 22 (38,6%) 0,46 (0,20-1,05) 17(42,5%) 22 (41,5%) 0,96 (0,42-2,21)
А/А 18(23,4%) 25 (22,6%) 0,95 (0,48-1,90) 9 (23,7%) 14 (24,6%) 1,05 (0,40-2,74) 9 (22,5%) 11 (20,8%) 0,90 (0,33-2,44)
О 79(51,3%) 128 (57,7%) 1,29(0,86-1,95) 0,22 36 (47,4%) 64 (56,1%) 1,42 (0,79-2,55) 0,24 45 (56,3%) 62 (58,5%) 1,10(0,61-1,97) 0,76
А 75 (48,7%) 94 (42,3%) 0,77 (0,51-1,17) 40 (52,6%) 50 (43,9%) 0,70 (0,39-1,26) 35 (43,8%) 44 (41,5%) 0,91 (0,51-1,64)
-1562 С>Т (геЗ918242) ММР9
С/С 56 (72,7%) 76 (68,5%) 0,81 (0,43-1,55) 0,18 27(71,1%) 39 (68,4%) 0,88 (0,36-2,16) 0,24 30 (75,0%) 36 (67,9%) 0,71 (0,28-1,77) 0,42
с/т 21 (27,3%) 29 (26,1%) 0,94 (0,49-1,82) 11 (28,9%) 14 (24,6%) 0,80 (0,32-2,01) 10 (25,0%) 15 (28,3%) 1,18(0,47-3,01)
ТЯ 0 (0%) 6 (5,4%) ЫА (0,00-ЫА) 0 (0%) 4 (7,0%) ЫА(ОД)-ЫА) 0 (0%) 2 (3,8%) ЫА(ОД)-ЫА)
С 133 (86,4%) 181 (81,5%) 0,70 (0,39-1,24) 0,22 65 (85,5%) 92 ( 80,7%) 0,71 (0,32-1,56) 0,39 70 (87,5%) 87(82,1%) 0,65 (0,29-1,50) 0,31
т 21 (13,6%) 41 (18,5%) 1,44 (0,81-2,54) 11 (14,5%) 22(19,3%) 1,41 (0,64-3,16) 10(12,5%) 19(174,9%) 1,53 (0,67-3,50)
Анализ ассоциации изучаемых генотипов показал, что рисковыми аллелями в развитии тяжелого СДР являлись аллели -735Т (р = 0,020), -15750 (р = 0,019) и генотип -735СТ ^ = 2,15; 95% С1: 1,10-4,21; р = 0,035) генаММР2. Интересным оказался результат поиска ассоциации между исследуемыми генотипами и тяжестью течения СДР с учетом пола. Так, у мальчиков обнаружен рисковый аллель -15750 (р = 0,010) и генотип -157500 ДО = 2,68; 95% С1: 1,15-6,26; р = 0,033) полиморфизма ге243866ММР2, а у девочек — рисковый аллель -735Т (р = 0,032) полиморфизма ге2285053 ММР2. Найденные рисковые аллели оказывают противоположное действие на экспрессию ММР2: -15750 повышает, а -735Т снижает экспрессию гена. Низкая ферментативная активность протеина-зы ММП2 является фактором риска развития дыхательных нарушений у недоношенных новорожденных [7]. Известно, что у недоношенных мальчиков достоверно выше содержание эстрадиола в пуповинной крови, чем у девочек [17], а эстрогены влияют на активность ММП (снижают), повышая экспрессию тканевых ингибиторов матриксных металло-протеиназ.
Далее был проведен анализ сравнения комбинаций генотипов по полиморфизмам генов
ММР2 и ММР9 у пациентов с СДР различной степени тяжести (рис. 3, рис. 4).
Комбинация генотипов -735СС ге2285053 и -1575А- ге243866 гена ММР2 достоверно чаще встречалась у пациентов с СДР умеренной степени тяжести (OR = 0,47; 95% С1: 0,25-0,86; р = 0,019), а частота встречаемости комбинации генотипов СТ/00 этих же полиморфных локусов была выше у пациентов с тяжелым течением СДР, однако статистическая достоверность не была достигнута ДО = 2,12; 95% С1: 0,98-4,56; р = 0,051). Полученные результаты подтверждают гипотезу о рисковом значении генотипа СТ и ал-леля Т полиморфизма ге2285053 и защитном эффекте при носительстве генотипа -735 СС ге2285053 и аллеля -1575А ге243866 в развитии СДР тяжелой степени.
При анализе ассоциации комбинаций полиморфных локусов ге17576 и ге3918242 гена ММР9 со степенью тяжести СДР выявлено, что комбинация генотипов АА/СС встречалась в 2,1 раза реже у пациентов с тяжелым СДР ДО = 0,45; 95% С1: 0,17-0,97; р = 0,038). Можно предположить наличие кумулятивного влияния сочетания полиморфных вариантов локуса Ы7576 и ^3918242 гена ММР9 на тяжесть течения СДР у недоношенных новорожденных.
Рис. 3. Распределение частоты встречаемости комбинаций генотипов полиморфных локусов гена ММР2 в основной группе пациентов с разделением по степени тяжести СДР
I СДР тяжелой степени СДР умеренной степени
Рис. 4. Распределение частоты встречаемости комбинаций генотипов полиморфных локусов гена ММР9 в основной группе пациентов с разделением по степени тяжести СДР
Полученные данные об аллелях и генотипах полиморфных вариантов матриксных метал-лопротеиназ, достоверно ассоциированных с риском развития респираторных заболеваний с учетом пола представлены на рисунке 5.
Полиморфизмы в генах ММП могут изменять экспрессию генов, влияя на взаимодействие между факторами транскрипции и сайтами их связывания в промоторной области, что может способствовать повышенной восприимчивости к развитию различных патологий. В случае гена ММР2 в его промоторной области картированы 2 функциональных однонуклеотидных полиморфизма: -735 С>Т (ге2285053) и -1575 G>A (ге243866). Полиморфный вариант в положении -735 представляет собой замену цитозина на ти-мин, что приводит к устранению сайта связывания транскрипционного фактора Sp-1, причем аллель Т связан с уменьшенной актив-
Рис. 5. Генотипы и аллели полиморфных вариантов генов ММР2 и ММР9, ассоциированные с риском развития респираторных нарушений (пунктиром выделены генотипы, проявившие себя только в одном из полов при анализе данных с учетом пола)
ностью промотора. Замена гуанина на аденин в положении -1575 промотора ММР2 нарушает связывание эстрогенового рецептора, а также приводит к снижению транскрипционной активности (аллель -1575G функционирует как энхансер, тогда как аллель - 1575А снижает активность транскрипции). Однонуклео-тидный полиморфизм в промоторной области гена ММР9 в положении -1562 (ге3918242) представляет собой замену цитозина на ти-мин и находится в сайте узнавания ингибиторов транскрипции. Следовательно, замена С на Т приводит к разрушению сайта связывания ингибитора и значительно увеличивает активность промотора. Несинонимичный вариант с.836 А^ р^1п279А^ (^17576) гена ММР9 представляет замену аденина на гуанин в положении с.836, в результате чего незаряженный глутамин замещается на положительно заряженный аргинин в положении 279 зрелого белка. Этот полиморфизм влияет на конформацию белка, вызывая снижение аффинности связывания коллагена типа IV с ММП9 [18-21]. Возможно, этим обусловлена защитная роль комбинации генотипов АА/СС гена ММР9 в тяжести течения синдрома дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных.
Роль ММП2 в патофизиологии дыхательных нарушений у недоношенных новорожденных спорна. Исследования экспрессии ММП у недоношенных детей, указывают на
то, что риск развития респираторных осложнений обусловлен несколькими факторами, в том числе повышенной экспрессией ММП2 в течение первых трех дней жизни. Сочетание более высокой концентрации ММП2 и более низкой концентрации сурфактанта приводит к недостаточной защите от окислительного повреждения, вызванного искусственной вентиляцией легких.
Существуют разные мнения по поводу роли ММП9 в развитии респираторных нарушений [13-15]. Так, повышенные уровни ММП9 в трахее в ранние сроки после рождения коррелировали с разрешением СДР, что позволяет предположить, что повышение активности ММП9 является реакцией физиологического восстановления, защитой легкого от воспалительного повреждения.
Заключение
Выявлено влияние полиморфных вариантов ге2285053 гена ММР2 на риск развития и формы течения СДР: носительство генотипа -735СТ и аллеля -735Т является фактором риска развития и формирования тяжелой формы СДР у недоношенных новорожденных.
Генотипы -735СС ^2285053, -1575АА гб243866, а также комбинации генотипов 836АА/-1562СС гена ММР9 и -735СС /-1575А-гена ММР2 достоверно чаще встречаются у недоношенных новорожденных с СДР умеренной степени тяжести.
Выявлены статистически значимые различия в ассоциации полиморфных вариантов изучаемых локусов с развитием и течением респираторных нарушений с учетом пола. Показано, что генотип 836GG гб17576 гена ММР9 является рисковым в развитии СДР для девочек. Степень тяжести течения СДР у девочек ассоциировалась с аллелем -735Т ге2285053, а у мальчиков — с аллелем -15750 ге243866 гена ММР2.
Список использованных источников
1. Современные аспекты организации нео-натальной помощи / Громов К. Л. [и др.] ; под ред. Д. О. Иванова, Ю. В. Петренко. - СПб. : Н-Л, 2011. - 463 с.
2. Суханова, Л. П. Детская и перинатальная смертность в России: тенденции, структура, факторы риска [Электронный ре-
сурс] / Л. П. Суханова, М. С. Скляр // Социальные аспекты здоровья населения. -2007. - № 4. - Режим доступа: http ://vestnik. mednet.ru/ content/view/46/3. - Дата доступа: 20.05.2020.
3. Сидельникова, В. М. Преждевременные роды. Недоношенный ребёнок / В. М. Сидельникова, А. Г. Антонов. - М. : Изд. группа «ГЭОТАР Медиа», 2006. - 371 с.
4. Практическая пульмонология детского возраста (справочник) / В. К. Таточенко [и др.] ; под ред. В. К. Таточенко. - М., 2000. -268 с.
5. Дементьева, Г. М. Пульмонологические проблемы в неонатологии / Г. М. Дементьева // Пульмонология. - 2002. - № 1. - С. 6-12.
6. Risk factors for the different types of chronic lung diseases of prematurity according to the preceding respiratory distress syndrome / C. W. Choi [et al.] // Pediatr. Int. - 2005. -Vol. 47. - P. 417-423.
7. Hendrix, A. Y. The role of matrix metallopro-teinases in development, repair, and destruction of the lungs / A. Y. Hendrix, F. Kheradmand // Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. - 2017. - Vol. 148. -P. 1-29.
8. Extracellular matrix in lung development, homeostasis and disease / Y. Zhou [et al.] // Matrix Biology. - 2018. - Vol. 73. - P. 77-104.
9. Mizikova, I. The extracellular matrix in bronchopulmonary dysplasia: target and source [Electronic resource] / I. Mizikova, R. E. Morty // Frontiers in Medicine. - 2015. - Vol. 2. - Article 91. - Mode of access: https://www.frontiersin. org/articles/10.3389/fmed.2015.00091/full. Date of access: 27.04.2020.
10. Mathew, C. C. The isolation of high molecular weight eucaryotic DNA / C. C. Mathew // Methods in Molecular Biology. - Clifton: Human Press. - 1984. - Vol. 2, № 4. - P. 31-34.
11. Genetic polymorphisms in MMP 2, 9 and 3 genes modify lung cancer risk and survival / P. Gonzalez-Arriaga [et al.] // BMC Cancer. -2012. - Vol. 12, № 121. - P. 1-10.
12. Functional polymorphisms in the promoter regions of MMP2 and MMP3 are not associated with melanoma progression / J. Cotignola [et al.] // Journal of Negative Results in BioMedi-cine. - 2007. - Vol. 6, № 1. - P. 1-8.
13. The MMP-2 and MMP-9 promoter polymorphisms and susceptibility to salivary gland
cancer / M. Radunovic [et al.] // JBUON. -2016. - Vol. 21, № 3. - P. 597-602.
14. Association study of polymorphisms within matrix metalloproteinase 9 with bronchial asthma/ K. Ganter [et al.] // Int. J. Immunogen-et. - 2005. - Vol. 32. - P. 233-236.
15. MMP9 promoter polymorphism (-1562 C/T) does not affect the serum levels of soluble MICB and MICA in breast cancer / M. H. Bar-gostavan [et al.] // Iran. J. Immunol. - 2016. -Vol. 13. - P. 45-53.
16. SNPStats: your web tool for SNP analysis [Electronic resource]. - Mode of access: https:// www.snpstats.net/start.htm?. - Date of access: 28.04.2020.
17. Елгина, С. И. Функциональные взаимоотношения между гонадотропногонадной системой и плацентой у доношенных и недоношенных новорожденных / С. И. Елгина // Казанский медицинский журнал. - 2010. -Т. 91, № 1. - С. 59-61.
18. Matrix metalloproteinases: evolution, gene regulation and functional analysis in mouse models / M. Fanjul-Fernandez [et al.] // Biochi-
mica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. - 2010. - Vol. 1803. - P. 3-19.
19. Amaya, C. N. Differential expression of angiogenic gene networks during post-natal lung alveolarization [Electronic resource] / C. N. Amaya, B. A. Bryan // Angiol. - 2016. -Vol. 4, Issue 4. - Mode of access: https://www. longdom.org/open-access/differential-expres-sion-of-angiogenic-gene-networks-during-post-natal-lungalveolarization-2329-9495-1000187. pdf. - Date of access: 27.04.2020.
20. Matrix metalloproteinase gene polymorphisms and bronchopulmonary dysplasia: identification of MMP16 as a new player in lung development [Electronic resource] / A. Hadchouel [et al.] // PLoS ONE. - 2008. - Vol. 3. - Mode of access: https://journals.plos.org/plosone/ article?id=10.1371/journal.pone.0003188. Date of access: 27.04.2020.
21. Association of a FGFR-4 gene polymorphism with bronchopulmonary dysplasia and neonatal respiratory distress / M. Rezvani [et al.] // Disease Markers. - 2013. - Vol. 35. - P. 633-640.
V. M. Malyshava1, A. P. Mikhalenka1, M. V. Artsiusheuskaya3, A. P. Sukharava2"3, K. A. Gamolka2"3,
A. V. Kilchevsky1, G. A. Shyshko3
POLYMORPHISMS OF MMP2 AND MMP9 GENES IN PREMATURE NEWBORNS WITH RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME
1State Scientific Institution "Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus" 27, Akademicheskaya St., 220072 Minsk, the Republic of Belarus email: o.malysheva@igc.by 2State Educational Establishment "Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education" 3/3 P. Brovki St., 220013 Minsk, the Republic of Belarus 3Health Care Institution "Clinical Maternity Hospital of Minsk Region" 16, F. Skoriny St., 220114 Minsk, the Republic of Belarus
The incidence of -735 C>T rs2285053, -1575 G>A rs243866 MMP2 and c.836 A>G p.Gln279Arg rs17576, -1562 C>T rs3918242 polymorphic variants of the MMP9 gene were investigated in 188 premature newborns of 28-36 weeks of gestational age with respiratory distress syndrome and in 189 mature newborns (the control group). A statistically significant increase in the incidence of the heterozygous genotype -735CT was found in the group of premature newborns with respiratory disorders as compared with the control group (p = 0.033) and in newborns with severe RDS as compared with moderate RDS (p = 0.035). The severity of RDS in girls was associated with the -735T allele and in boys with -1575G of the MMP2 gene. It was shown that the 836GG rs17576 genotype of the MMP9 gene is a risk factor of RDS development in girls. Combinations of 836AA / -1562CC of the MMP9 gene and -735CC / -1575A- of the MMP2 gene occurred more frequently in patients with the moderate severity of RDS (p = 0.038 and p = 0.019 respectively).
Keywords: respiratory distress syndrome, bronchopulmonary dysplasia, premature newborns, matrix metallopro-teinases, MMP2 and MMP9 gene polymorphism.
