CC BY
5УДК 577.21:575.174.015.3:616.24-008.4
О.М. Малышева1, Е.П. Михаленко1, В.Ф. Аджиева1, А.П. Сухарева2'3, М.В. Артюшевская3, К.А. Гомолко2, А.В. Кильчевский1, Г.А. Шишко3
ПОЛИМОРФНЫЕ ВАРИАНТЫ RS1124, RS4715 И RS2070687 ГЕНА SFTPС У НЕДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С СИНДРОМОМ
ДЫХАТЕЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ
1Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27 2УЗ «Клинический родильный дом Минской области» Республика Беларусь, 220114, г. Минск, ул. Ф. Скорины, 16 3ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования» Республика Беларусь, 220013, г. Минск, ул. П. Бровки, 3, корпус 3
Исследована частота встречаемости полиморфных вариантов ге4715 (с.413С^А, р.Т138М), ге1124 (с.557 G^■A, Ser186Asn) и ге2070687 (с.436-8 С^О) гена SFTPC у 125 недоношенных новорожденных в сроке гестации 28-34 недели с синдромом дыхательных расстройств (СДР) и у 146 здоровых доношенных новорожденных (группа сравнения). Обнаружено статистически значимое увеличение (р = 0,044) частоты встречаемости гетерозиготного генотипа С/А ге4715 в 4 экзоне в группе недоношенных новорожденных с тяжелым СДР по сравнению с группой СДР умеренной степени тяжести среди мальчиков. В группе девочек с тяжелым СДР достоверно чаще (р = 0,009) встречался гомозиготный вариант С/С ге4715 по сравнению с группой с умеренным СДР.
Ключевые слова: полиморфизм генов, синдром дыхательных расстройств, недоношенные новорожденные, сурфактантный белок С.
Введение
В структуре заболеваемости и смертности недоношенных новорожденных дыхательные расстройства занимают значительный удельный вес. Частота развития патологии органов дыхания у недоношенных младенцев составляет 5% и увеличивается с уменьшением гестационного возраста, достигая 40-60% у детей с экстремально низкой массой тела при рождении. Наиболее частой причиной нарушения дыхательной функции у новорожденных является синдром дыхательных расстройств (СДР) [1, 2, 3].
Синдром дыхательных расстройств характеризуется дыхательной недостаточностью, обусловленной незрелостью легких и недостатком сурфактанта, возникающим вследствие нарушения его синтеза и экскреции и/ или врожденного дефекта его структуры [4]. Сурфактант представляет собой липопротеи-новый комплекс, покрывающий поверхность альвеолярного эпителия. Липидная фракция составляет чуть более 90 % общей массы сурфактанта, белковая часть (10%) представлена
преимущественно 4 протеинами — БР-А, БР-В, БР-С и БР-О. Сурфактант синтезируется и се-кретируется альвеолоцитами II типа и обнаруживается в легких с 24 недели гестации, однако его активная продукция начинается с 28-й недели [4]. Перинатальными факторами риска развития СДР у недоношенного новорожденного являются: мужской пол, принадлежность к европеоидной расе, кесарево сечение при отсутствии родовой деятельности, сахарный или гестационный диабет у матери, многоплодная беременность, второй из двойни [5].
СДР является многофакторной и полигенной патологией, развитие которой обусловлено сложным взаимодействием как генетических, так и внешнесредовых факторов. Изучение таких факторов даст возможность разработать методы профилактики и прогнозирования постнатального развития заболевания и лечения детей с СДР. Учитывая, что в патогенезе синдрома дыхательных расстройств ключевым моментом является недостаточность сурфактантной системы легких, во многих научных центрах проводятся
исследования роли полиморфных вариантов генов белков сурфактанта в формировании наследственной предрасположенности к дыхательным расстройствам у новорожденных [6]. Наибольший интерес представляют молекулярные нарушения в генах SFTPB и БРТРС, кодирующих гидрофобные белки SP-B и SP-C, которые играют непосредственную роль в сборке сурфактантного комплекса. В гене $ЕТРС выявляется широкий спектр нарушений от патогенных мутаций до нейтральных полиморфных вариантов, при этом фенотипи-ческое проявление этих изменений во многом определяется этнической принадлежностью исследуемых групп [3, 6].
Цель данного исследования — изучение связи полиморфных вариантов ге1124, ге4715 и ге2070687 гена БРТРС с течением синдрома дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных, а также их распределение в изучаемой группе и в группе сравнения (здоровые доношенные новорожденные).
Материалы и методы
В работе проанализированы образцы ДНК 271 ребенка, родившегося в УЗ «Клинический родильный дом Минской области» в 20162018 гг. Основную группу исследования составили 125 недоношенных новорожденных.
Критерии включения пациентов в исследование:
• гестационный возраст от 28 до 34 недель;
• синдром дыхательных расстройств различной степени тяжести;
• наличие письменного информированного согласия законного представителя.
Критерии исключения пациентов из исследования:
• многоплодная беременность;
• наследственные и врожденные заболевания;
• ВИЧ-инфекция у матери;
• инфекционные болезни, специфичные для перинатального периода.
Группа сравнения включала 146 здоровых доношенных новорожденных, гестационный возраст которых был в пределах 37-40 недель.
Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с международными нормами [7]. Проведение исследования разрешено Комитетом по этике БелМАПО.
Материалом для исследования полиморфизмов гена SFTPC послужила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов пуповинной и периферической венозной крови методом фе-нольно-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К [8].
Для выявления полиморфизма rs4715 (c.413 С—*A, p.T138N) гена SFTPC использовали метод ПЦР с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Амплификация фрагмента 4 экзона длиной 189 п. о. проведена с использованием пары олигонуклеотидных праймеров: прямой — 5' - GCC ACT TCA TCC ACA TCC - 3' и обратный — 5' - AAT AGG AGA GGG GCA GTC AG - 3' [9]. Условия ПЦР подобраны экспериментально: 5 мин денатурации при температуре 94 °C, далее 35 циклов при 94 °C 30 с, 59 °C 30 с, 72 °C 60 с, завершающий шаг — 72 °C в течение 5 мин. Полученные фрагменты обрабатывали рестриктазой BfaI при 37 °C в течение ночи. Электрофоретиче-ское разделение продуктов рестрикции проводили в 2,2-процентном агарозном геле. Аллелю А соответствовал фрагмент длиной 189 п. о., а аллелю С — два фрагмента длиной 97 и 92 п. о.
Изучение полиморфизмов rs1124 (с.557 G—A, Ser186Asn) и rs2070687 (с.436-8 C—G) проводили методом прямого секвенирования по Сенгеру. Для амплификации фрагмента 4 интрона и 5 экзона гена SFTPC была использована следующая пара олигонуклеотид-ных праймеров: прямой — 5' - TAC CTG GTG GCT TCT GAC T - 3' и обратный — 5' - CTG TGA AGC AAA GGA ATG TT - 3' [9]. Условия ПЦР подобраны экспериментально: 1 мин денатурации при температуре 94 °C, далее 35 циклов при 94 °C 10 с, 60 °C 30 с, 72 °C 15 с, завершающий шаг — 72 °C в течение 2 мин. Определение нуклеотидной последовательности проводилось методом прямого секвениро-вания на автоматическом анализаторе Applied Biosystems 3500 DNA Analyzer. Полученные последовательности ДНК анализировались в программе SequenceScanner v1.0.
Статистическую обработку данных проводили с использованием прикладной программы GraphPad InStat Version 3.05 и веб-инструмента SNPStats [10]. Тест на соответствие контрольной выборки равновесию Харди-Вайнбер-
га проводили с использованием метода х2 (а = 0,05; df = 1). При сравнении частот встречаемости полиморфных вариантов в группах недоношенных новорожденных и контроля использовался стандартный критерий х2 Пирсона; при условии, когда объем выборки не превышал 5 случаев, использовали критерий X2 с поправкой Йетса и точный тест Фишера. Связь между генотипами, гаплотипами и течением заболевания оценивали по отношению шансов (OR (95% CI)) с использованием кодоминантной модели SNPStats. OR указан с 95-процентным доверительным интервалом (confidence interval — CI) [11].
Результаты и обсуждение
Основная группа (недоношенные новорожденные) была разделена на 2 подгруппы. В подгруппу младенцев с тяжелым СДР включались дети, нуждающиеся в респираторной поддержке более суток, проведении сурфак-тантной терапии и оксигенотерапии после перевода на спонтанное дыхание (подгруппа 1). Структуру новорожденных подгруппы 1 составили 46 (53,5%) мальчиков и 40 (46,5%) девочек. Во вторую подгруппу входили недоношенные новорожденные, у которых диагностирован СДР умеренной степени тяжести (подгруппа 2). Структуру новорожденных подгруппы 2 составили 18 (46,2%) мальчиков и 21 (53,8%) девочка.
Оказание медицинской помощи новорожденным проводилось в полном соответствии с существующей в Республике Беларусь на данный момент нормативной документацией, в частности «Клиническими протоколами диагностики, реанимации и интенсивной терапии в неонатологии», утвержденными приказом Министерства здравоохранения Республики Беларусь № 81 от 28.01.2011 г.
Группу сравнения составили доношенные новорожденные. Состояние всех детей данной группы при рождении и в последующие дни вплоть до выписки из родильного дома оценивалось как удовлетворительное. Лабораторные данные общего анализа крови у детей в первые сутки жизни были в пределах возрастной нормы. Младенцы находились на совместном пребывании с матерями в режиме свободного грудного вскармливания и были выписаны домой на 4-5 сутки жизни.
Результаты генотипирования. Распределение частот генотипов по всем изученным полиморфизмам гена 8ЕТРС в группе сравнения и группе пациентов с СДР соответствовало теоретически ожидаемому равновесному распределению Харди - Вайнберга (для гб4715 р = 0,7 и р = 0,83 соответственно, для гб1124 р = 0,6 и р = 0,7 соответственно, для гб2070687 р = 0,6 и р = 0,78).
Анализ распределения частоты встречаемости полиморфных вариантов изучаемых полиморфизмов гена 8ЕТРС не выявил существенных различий между группой недоношенных новорожденных и группой сравнения (табл. 1). При сравнении этих групп с учетом пола ребенка также не обнаружено достоверной разницы (табл. 1). В нашем исследовании показано, что частоты встречаемости полиморфных вариантов исследуемых полиморфизмов не различались в группах доношенных и недоношенных новорожденных.
На следующем этапе проанализирована связь полиморфных вариантов гб4715, гб1124 и гб2070687 с тяжестью синдрома дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных. Результаты этого анализа представлены в табл. 2. Анализ распределения частот генотипов полиморфных локусов гена 8ЕТРС не выявил статистически значимых различий между подгруппами недоношенных новорожденных. Однако, при учете двух признаков — степени тяжести СДР и пола, показано, что частота встречаемости гетерозиготного генотипа С/А гб4715 в 4 экзоне гена БРТРС у мальчиков с тяжелой формой СДР в 2,8 раза больше, чем у мальчиков с СДР умеренной степени тяжести (47,8% и 16,7% соответственно). При сравнении групп девочек с различной степенью тяжести синдрома дыхательных расстройств выявлено противоположное влияние полиморфизма гб4715: гетерозиготный генотип С/А в группе девочек с тяжелым СДР встречался в 2,4 раза реже, чем среди девочек с умеренным СДР (27,5% и 66,7% соответственно). В группе девочек с тяжелым СДР выявлено 67,5% носительниц гомозиготного варианта С/С, что достоверно больше, чем среди девочек с умеренным СДР — 28,6% (рис. 1). Минорный аллель А достоверно чаще встречается у девочек с умеренным СДР (х2 = 4,46; р = 0,03).
=0.016 р=0>017
Й к
80
70
122
67,5
8 бо
1-н
8 5,
50
У
0
1 40
ее
^30
у
Щ
8 20 о
3 10
р=0,005
66,7
р=0,364 р=0=889
СС
1 мальчики подгруппа 1 Е1 девочки подгруппа 1 0 мальчики подгруппа 2 □ девочки подгруппа 2 Рис. 1. Распределение частоты встречаемости генотипов ге4715 в исследуемых подгруппах с учетом пола
Можно предположить, что в исследуемой выборке гетерозиготный генотип С/А ге4715 $ЕТРС является рисковым в формировании тяжелого течения СДР у недоношенных мальчиков (т = 5,30; 95% С1: 1,30-21,51; р = 0,044) и защитным у недоношенных девочек (т = 0,17; 95% С1: 0,05-0,57; р = 0,007). У недоношенных девочек рисковым фактором развития тяжелого СДР является генотип С/С ^ = 5,19; 95% С1: 1,63-16,48; р = 0,009). Подтверждением этого предположения может служить выявленное различие по частоте встречаемости полиморфных вариантов ге4715 среди мальчиков и девочек как в группе с умеренным СДР, так и в группе с тяжелым СДР (рис. 1). В группе с умеренным СДР 72,2% носителей гомозиготного генотипа С/С были мальчики и 28,6% — девочки, в то время как среди носителей гетерозиготного варианта С/А 66,7% — девочки и только 16,7% — мальчики (х2 с поправкой Йетса = 5,74; р = 0,01 — для генотипа С/С и х2 с поправкой Йетса = 7,92; р = 0,0049 — для генотипа С/А). В группе с тяжелым СДР выявлена противоположная картина: среди носителей генотипа С/С чаще встречались девочки (67%), чем мальчики (39,1%), а 47,8% носителей гетерозиготного
генотипа С/А были мальчики и 27,5% девочки (х2 с поправкой Йетса = 5,81; р = 0,015 — для генотипа С/С и х2 с поправкой Йетса = 2,92; р = 0,09 — для генотипа С/А).
Обеспечение механики дыхания легких является важнейшей функцией легочного сур-фактанта. Значительную роль в этом играют гидрофобные белки сурфактанта, к которым относится SP-C. Сурфактантный протеин С ^Р-С) — небольшой гидрофобный белок, необходимый для снижения поверхностного натяжения путем усиления адсорбции и распространения фосфолипидов в поверхностный монослой легочной ткани [12].
Ген 8ЕТРС локализован на коротком плече 8 хромосомы в положении 8р23.1, охватывает 3,5 тыс. п. о. и состоит из 6 экзонов, только первые пять из которых являются кодирующими. Нуклеотидная последовательность, соответствующая зрелому пептиду, ограничена 2 экзоном. Экспрессия гена 8ЕТРС начинается с 24 недели беременности. Предшественник белка SP-C (рг^Р-С), имеющий молекулярную массу 22 кДа и состоящий из 191 или 197 аминокислотных остатков, подвергается поэтапному протеолизу с образованием зрелого пептида молекулярной массы 3,5 кДа [13].
Таблица 1
Распределение частот полиморфных вариантов ге4715, ге1124 и ге2070687 гена БРТРСу недоношенных новорожденных с СДР и
в группе сравнения с учетом и без учета пола
Генотип Мальчики Девочки
Группа сравнения Основная группа (Ж (95% С1) р* Группа сравнения Основная группа ОЯ (95% С1) р* Группа сравнения Основная группа ОЯ (95% С1) р*
«1 г- е С/С 68 (46,6%) 64 (51,2%) 1,00 0,73 32 (47,1%) 31 (48,4%) 1,00 0,88 28 (47,5%) 33 (54,1%) 1,00 0,74
С/А 65 (44,5%) 50 (40,0%) 0,82 (0,49-1,35) 29 (42,6%) 25 (39,1%) 0,89 (0,43-1,84) 27 (45,8%) 25 (41,0%) 0,79 (0,37-1,65)
А/А 13 (8,9%) 11 (8,8%) 0,9 (0,38-2,15) 7 (10,3%) 8 (12,5%) 1,18 (0,38-3,65) 4 (6,8%) 3 (4,9%) 0,64 (0,13-3,09)
С 201 (68,8%) 178 (71,2%) 0,89 (0,62-1,29) 0,55 93 (68,4%) 87 (68,0%) 1,02 (0,61-1,71) 0,94 83 (70,3%) 91 (74,6%) 0,81 (0,46-1,43) 0,46
А 91 (31,2%) 72 (28,8%) 1,12 (0,77-1,62) 43 (31,6%) 41 (32,0%) 0,98 (0,58-1,65) 35 (29,7%) 31 (25,4%) 1,24 (0,70-2,18)
<М й С/С 60 (41,1%) 53 (42,4%) 1,00 0,97 26 (38,2%) 26 (40,6%) 1,00 0,92 28 (47,5%) 27 (44,3%) 1,00 0,83
А/С 65 (44,5%) 55 (44,0%) 0,96 (0,57-1,60) 30 (44,1%) 26 (40,6%) 0,87 (0,41-1,85) 25 (42,4%) 29 (47,5%) 1,20 (0,57-2,55)
А/А 21 (14,4%) 17 (13,6%) 0,92 (0,44-1,92) 12 (17,6%) 12 (18,8%) 1,00 (0,38-2,63) 6 (10,2%) 5 (8,2%) 0,86 (0,24-3,17)
С 185 (63,4%) 161 (64,4%) 0,96 (0,67-1,36) 0,8 82 (60,3%) 78 (60,9%) 0,97 (0,59-1,60) 0,91 81 (68,6%) 83 (68,0%) 1,03 (0,60-1,77) 0,92
А 107 (36,6%) 89 (35,6%) 1,05 (0,74-1,49) 54 (39,7%) 50 (39,1%) 1,03 (0,63-1,68) 37 (31,4%) 39 (32,0%) 0,97 (0,56-1,68)
ге2070687 С/С 95 (65,1%) 79 (63,2%) 1,00 0,63 47 (69,1%) 37 (57,8%) 1,00 0,4 38 (64,4%) 42 (68,8%) 1,00 0,12
С/С 44 (30,1%) 42 (33,6%) 1,15 (0,68-1,93) 18 (26,5%) 23 (35,9%) 1,62 (0,76-3,44) 17 (28,8%) 19 (31,1%) 1,01 (0,46-2,22)
с/с 7 (4,8%) 4 (3,2%) 0,69 (0,19-2,43) 3 (4,4%) 4 (6,2%) 1,69 (0,36-8,04) 4 (6,8%) 0 (0%) 0,00 (0,00-ЫА)
с 234 (80,1%) 200 (80,0%) 1,01 (0,66-1,54) 0,97 112 (82,4%) 97 (75,8%) 1,49 (0,82-2,71) 0,19 93 (78,8%) 103 (84,4%) 0,69 (0,35-1,33) 0,26
с 58 (19,9%) 50 (20,0%) 0,99 (0,65-1,51) 24 (17,6%) 31 (24,2%) 0,67 (0,37-1,22) 25 (21,2%) 19 (15,6%) 1,46 (0,75-2,82)
Таблица 2
Частота встречаемости генотипов и аллелей полиморфизмов 8РТРС у недоношенных новорожденных с СДР разной степени
тяжести с учетом и без учета пола
Генотип Мальчики Девочки
Подгруппа 1 Подгруппа 2 (Ж (95% С1) р* Подгруппа 1 Подгруппа 2 (Ж (95% С1) р* Подгруппа 1 Подгруппа 2 (Ж (95% С1) р*
«1 г- е С/С 45 (52,3%) 19 (48,7%) 1,00 0,72 18 (39,1%) 13 (72,2%) 1,00 0,044 27 (67,5%) 6 (28,6%) 1,00 0,007
С/А 33 (38,4%) 17 (43,6%) 0,82 (0,37-1,81) 22 (47,8%) 3 (16,7%) 5,30 (1,30-21,51) 11 (27,5%) 14 (66,7%) 0,17 (0,05-0,57)
А/А 8 (9,3%) 3 (7,7%) 1,13 (0,27-4,71) 6 (13,0%) 2 (11,1%) 2,17 (0,38-12,50) 2 (5,0%) 1 (4,8%) 0,44 (0,03-5,74)
С 123 (71,5%) 55 (70,5%) 0,95 (0,53-1,72) 0,87 58 (63,0%) 29 (80,6%) 2,43 (0,96-6,14) 0,089 65 (81,3%) 26 (61,9%) 0,38 (0,16-0,87) 0,03
А 49 (28,5%) 23 (29,5%) 1,05 (0,58-1,89) 34 (37,0%) 7 (19,4%) 0,41 (0,16-1,04) 15 (18,7%) 16 (38,1%) 2,67 (1,15-6,17)
<м й С/С 39 (45,4%) 14 (35,9%) 1,00 0,53 18 (39,1%) 8 (44,4%) 1,00 0,86 21 (52,5%) 6 (28,6%) 1,00 0,17
А/С 35 (40,7%) 20 (51,3%) 0,63 (0,28-1,43) 19 (41,3%) 7 (38,9%) 1,21 (0,36-4,01) 16 (40,0%) 13 (61,9%) 0,35 (0,11-1,13)
А/А 12 (13,9%) 5 (12,8%) 0,86 (0,26-2,89) 9 (19,6%) 3 (16,7%) 1,33 (0,28-6,28) 3 (7,5%) 2 (9,5%) 0,43 (0,06-3,19)
С 113 (65,7%) 48 (61,5%) 0,84 (0,48-1,45) 0,52 55 (59,8%) 23 (63,9%) 1,19 (0,54-2,64) 0,67 58 (72,5%) 25 (59,5%) 0,56 (0,25-1,23) 0,14
А 59 (34,3%) 30 (38,5%) 1,20 (0,69-2,08) 37 (40,2%) 13 (36,1%) 0,84 (0,38-1,87) 22 (27,5%) 17 (40,5%) 1,79 (0,82-3,94)
ге2070687 С/С 51 (59,3%) 28 (71,8%) 1,00 0,14 24 (52,2%) 13 (72,2%) 1,00 0,085 27 (67,5%) 15 (71,4%) 1,00 0,75
С/С 33 (38,4%) 9 (23,1%) 2,01 (0,84-4,80) 20 (43,5%) 3 (16,7%) 3,61 (0,90-14,48) 13 (32,5%) 6 (28,6%) 1,20 (0,38-3,82)
с/с 2 (2,3%) 2 (5,1%) 0,55 (0,07-4,11) 2 (4,3%) 2 (11,1%) 0,54 (0,07-4,31) - - -
с 135 (78,5%) 65 (83,3%) 1,37 (0,68-2,75) 0,38 68 (73,9%) 29 (80,6%) 1,46 (0,57-3,77) 0,43 67 (83,8%) 36 (85,7%) 1,16 (0,41-3,32) 0,78
с 37 (21,5%) 13 (16,7%) 0,73 (0,36-1,47) 24 (26,1%) 7 (19,4%) 0,68 (0,27-1,76) 13 (16,3%) 6 (14,3%) 0,86 (0,3-2,45)
Большая часть известных, в том числе патогенных, полиморфных вариантов расположена в С-концевом BRICHOS-домене (4-5 экзон гена 8РТРС) предшественника зрелого белка, обеспечивающим правильный фолдинг и транспортировку белка по секреторным путям. Предполагается, что все найденные патогенные мутации этого региона приводят к аномальной (неправильно свернутой) форме proSP-C и быстро разрушаются, вызывая тем самым недостаток SP-C, или к формированию внутриклеточных агрегатов, которые токсичны для клетки [14]. Считается, что более половины однонуклеотидных замен в области 4-5 экзона возникает спонтанно и приводят не к отсутствию протеина SP-C, а к формированию дефектного белка либо к уменьшению его количества [15].
В данном исследовании были изучены мис-сенс-замены: полиморфизм ге4715 в 4 экзоне, который приводит к замене аминокислоты треонин на аспарагин (с.413С^Л, р.Т138^ и полиморфизм ге1124 в 5 экзоне, приводящий к замене аминокислоты серин на аспарагин (c.557G^Л, р^186^. Механизм, с помощью которого эти полиморфные варианты могут влиять на риск развития различных заболеваний легкого, до сих пор не ясен. Однако они расположены в соответствующей С-концевой части молекулы proSP-C, которая имеет решающее значение в процессинге proSP-C до зрелого сурфактантного белка С [12]. Кроме того, мы изучали полиморфизм ге2070687 (436-8 С^^), расположенный в 4 интроне в районе альтернативного сайта сплайсинга. Присутствие альтернативного сайта сплайсинга в начале 5 экзона влечет за собой образование двух разных видов мРНК, отличающихся вставкой или делецией 18 нуклеотидов [13].
Можно предположить, что полиморфизмы SFTPС, влияющие на уровень и активность сурфактанта, могут оказывать модифицирующую роль в формировании и течении дыхательных расстройств у недоношенных новорожденных. Литературные данные о влиянии полиморфизмов гена SFTPС на развитие и течения синдрома дыхательных расстройств малочисленны и противоречивы. При исследовании недоношенных новорожденных иранской популяции гестационного возраста до 34 недель было обнаружено, что
генотип А/А полиморфизма ге1124 является предрасполагающим фактором развития РДС у недоношенных девочек, частота встречаемости данного генотипа у новорожденных с умеренным РДС больше, чем у младенцев с тяжелой формой заболевания независимо от пола [12]. Помимо этого, изучение выборки новорожденных из Финляндии показало, что полиморфный вариант 138Asn (ге4715) и 186Asn (ге1124), а также гаплотип 138Asn-186Asn, достоверно более часто встречались в группе недоношенных девочек. В то же время данные закономерности не были выявлены в американской популяции [16]. Разные результаты в исследованиях могут быть связаны с различиями в этнической принадлежности новорожденных и критериях подбора анализируемых выборок.
В нашем исследовании не выявлено значимых различий по полу и частоте встречаемости полиморфных вариантов гена SFTPС в исследуемых группах. Однако показана связь с течением СДР полиморфных вариантов ге4715 с учетом пола недоношенных новорожденных, что согласуется с данными литературы по влиянию гендерных различий на выработку сурфактанта. По литературным данным известно, что легкие мальчиков примерно на 1 неделю более незрелые, чем легкие девочек, за счет действия фетальных андрогенов на фибробласты легких и инги-бирования синтеза фосфатидилглицерола, входящего в состав сурфактанта [3]. Поэтому мальчики имеют большую вероятность появления СДР, чем девочки одного и того же гестационного возраста (в 1,7 раза чаще). Также было показано, что половые гормоны оказывают влияние на развитие легких плода. При этом молекулярный механизм влияния андрогенов и эстрогенов на развитие легких и синтез сурфактанта различен. Андрогены ингибируют активность и синтез сурфактанта путем изменения активности транскрипционных факторов (эпидермального фактора роста и трансформирующего фактора роста Р1). Влияние эстрогеновых рецепторов на уровень сурфактанта осуществляется посредством активации сигнальных путей фактора роста тромбоцитов, что приводит к дефектам альвеолярной структуры и снижению продукции сурфактанта [17].
Заключение
Таким образом, выявлены достоверные различия частоты встречаемости полиморфных вариантов rs4715 в 4 экзоне гена SFTPC между группами недоношенных новорожденных с умеренным и тяжелым СДР с учетом пола новорожденного. У недоношенных мальчиков с тяжелым СДР достоверно чаще встречались носители гетерозиготного генотипа С/А (OR = 5,30; 95% CI: 1,30-21,51; p = 0,044), а у недоношенных девочек с тяжелым СДР достоверно чаще — носители генотипа С/С (OR = 5,19; 95% CI: 1,63-16,48; p = 0,009).
Для подтверждения выявленных ассоциаций необходимы дальнейшие исследования на большей выборке новорожденных.
Научные исследования выполнялись в лаборатории экологической генетики и биотехнологии Института генетики и цитологии НАН Беларуси в рамках государственной программы «Наукоемкие технологии и техника» на 2016-2018 гг., по заданию 17 «Разработать и внедрить метод прогнозирования исходов дыхательных расстройств у новорожденных на основании молекулярно-генетических исследований генов, ассоциированных с данной патологией».
Список использованных источников
1. Avery's neonatology: pathophysiology and management of the newborn / ed.: M.G. MacDonald, M.M.K. Seshia, M.D. Mullett. — 6th ed. — Philadelphia: Lippincott Williams&Wilkins, 2005. — 1748 p.
2. Овсянников, Д.Ю.Врождённыйдефицит белков сурфактанта [Электронный ресурс] / Д.Ю. Овсянников, М.А. Беляшова, А.А. Крушельцкий — Режим доступа: https://cy-berleninka.ru/article/n/vrozhdennyy-defitsit-bel-kov-surfaktanta. — Дата доступа: 20.01.2019.
3. Kendig and Chernick's disorders of the respiratory tract in children / ed.: R. W. Wilm-ott [et al.]. — 8th ed. — Philadelphia: Elsevier, 2012. — 1141 p.
4. Кириллова, Е.Н. Морфологические аспекты пренатальной профилактики респираторного дистресс-синдрома и сурфактантной терапии у новорожденных / Е.Н. Кириллова, И.В. Сахаров, В.А. Романенко // Медицинский журнал. — 2014. — № 2. — C. 60-65.
5. Шабалов, Н.П. Неонатология: Учебн. пособие: В 2 т. / Н.П. Шабалов — М.: МЕДпресс-информ, 2004. — Т. 1. — 608 с.
6. Данилко, К.В. Роль генов белков сурфактанта, цитокиновой сети и ренин-ангиотензивной системы в формировании дыхательных расстройств у новорожденных: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 03.00.15 / К.В. Данилко; Рос. акад. наук, Ин-т биохимии и генетики. — Уфа, — 2007. — 24 с.
7. World medical association declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects / World Medical Association // JAMA. — 2013. — Vol. 310, № 20. — P. 2191-2194.
8. Sambrook, J. Isolation of highmolecular-weight DNA from mammalian cells / J. Sam-brook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // Molecular Cloning: a laboratory manual. — 2nd ed. — Pla-inview, N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. — 1989. — P. 9.14-9.23.
9. Two novel mutations in surfactant protein-C, lung function and obstructive lung disease / M. B^kvad-Hansen [et al.] Respiratory Medicine. — 2010. Vol. 104, № 3. — P. 418-425.
10. SNPStats: your web tool for SNP analysis [Electronic resource]. — Mode of access: https://www.snpstats.net/start.htm?. — Date of access: 08.01.2019.
11. Гланц, С. Медико-биологическая статистика: пер. с англ. / С. Гланц. — М.: Практика, 1998. — 459 с.
12. Association of SP-C gene codon 186 polymorphism (rs1124) and risk of RDS / N. Fatahi [et al.] // The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine. — 2016. — V. 30, № — 21. — P. 2585-2589.
13. Clinical biological and genetic heterogeneity of the inborn errors of pulmonary surfactant metabolism / M. Tredano [et al.] // Clin. Chem. Lab. Med. — 2001. — V. 39, № 2. — P. 90-108.
14. Nogee, L.M. Genetics and physiology of surfactant protein deficiencies / L.M. Nogee // Fetal and Neonatal Physiology. — 2017. — P. 843-854.
15. Jo, H.S. Genetic risk factors associated with respiratory distress syndrome / H.S. Jo // Korean J. Pediatr. — 2014. — V. 57, № 4. — P. 157-163.
16. Lahti, M. Surfactant protein C gene varia-
tion in the Finnish population — association with perinatal respiratory disease / M. Lahti, R. Marttila, M. Hallman // Eur. J. Hum. Genet. — 2004. — Vol. 12, № 3. — P. 12-20.
17. Gender differences in respiratory morbidity and mortality of preterm neonates / C.D. Townsel [et al.] // Frontiers in Pediatrics. — 2017. — Vol. 5. — P. 1-6.
V.M. Malyshava1, A.P. Mikhalenka1, V.F. Ajyieva1, A.P. Sukharava23, M.V. Artsiusheuskaya3, K.A. Gamolka2, A.V. Kilchevsky1, G.A. Shyshko3
POLYMORPHIC VARIANTS RS1124, RS4715, RS2070687 OF THE SFTP GENE IN PRETERM NEWBORNS WITH RESPIRATORY DISTRESS
SYNDROME
institute of Genetics and Cytology of NASB
Minsk, 220072, the Republic of Belarus 2Clinical Maternity Hospital of Minsk Region Minsk, 220114, the Republic of Belarus 3State Educational Establishment "Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education"
Minsk, 220013, the Republic of Belarus
The frequency of occurrence of polymorphic variants rs4715 (c.413C^A, p.T138N), rs1124 (c.557 G^A, Ser186Asn) and rs2070687 (c.436-8 C^G) of the SFTPC gene was investigated in 125 preterm newborns of 28-34 weeks of gestational age with respiratory distress syndrome and in 146 healthy full-term newborns (control group). A statistically significant increase (p = 0.044) in the frequency of occurrence of the heterozygous genotype C/A rs4715 in exon 4 in the group of preterm newborns with severe RDS was found when compared to the group of moderately severe RDS among boys. The homozygous C/C variant was significantly more frequent (p = 0.009) in the group of girls with severe RDS versus the group of girls with moderate RDS.
Key words: gene polymorphism, respiratory distress syndrome, preterm newborns, surfactant protein-C.
Дата поступления статьи: 5 февраля 2019 г.
