CC BY
244. Antioxidant function of ambroxol in mononuclear and polymorphonuclear cells in vitro / A. Gillissen [et al.] // Lung. 1997. Vol. 175. № 4. P. 235-242.
5. Chilvers M. A. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomulti-plier and photodiode methods / M. A. Chilvers, Ch. O'Callaghan // Thorax. 2000. Vol. 55. № 4. P. 314-317.
6. Chilvers M. A. Functional analysis of alia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults / M. A. Chilvers, A. Rutman, Ch. O'Callaghan // Thorax. 2003. Vol. 58. № P. 333-338.
7. Ciliary abnormalities in respiratory disease/ R. M. Buchdahl [et al.] // Arch. Dis. Child. 1988. Vol. 63. № 3. P. 238-243.
8. Ciliary beat frequency of human respiratory tract by different sampling techniques / P. M. Low [et al.] // Am. Rev. Respir. Dis. 1984. Vol. 130. № 3. P. 497-498.
9. de Iongh R. U. Ciliary defects in healthy subjects, bronchiectasis, and primary ciliary dyskinesia / R. U. de Iongh, J. Rutland // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995. Vol. 151. № 5. P. 1559-1567.
10. Effect of mucolytic agent on the bioavailability of antibiotics in patients with chronic respiratory diseases / F. Fraschini [et al.] // Cur. Ther. Res. 1988. Vol. 43. № 4. P. 734-742.
11. Fawcett D. W. A study of the fine structure of ciliated epithelia / D. W. Fawcett, K. R. Porter// J. Morphol. 1954. Vol. 94. № 2. P. 221-281.
12. Hermens W. A. The influence of drugs on nasal ciliary movement / W. A. Hermens, F. W. Merkus // Pharm. Res. 1987. Vol. 4. № 6. P. 445-449.
13. Herzon F. S. Nasal ciliary structural pathology // Laryngoscope. 1983. Vol. 93. № 1. P. 63-67.
14. Jorissen M. Nasal ciliary beatfrequency is age independent/ M. Jorissen, T. Willems, B. van der Schueren // Laryngoscope. 1998. Vol. 108. № 7. P. 1042-1047.
15. Oxidative and anti-oxidative effects of ambroxol on acute hydrochloric acid-induced lung injury in rats / S. P. Zhao [et al.] // Zhong Nan Da Xue Xue Bao YiXue Ban. 2004. Vol. 29. № 5. P. 586588.
16. Regional analysis of sinonasal ciliary beat frequency / J. Shaari [et al.] // Am. J. Rhinol. 2006. Vol. 20. № 2. P. 150-154.
17. Rutland J. Human ciliary beat frequency in epithelium from intratho-racic and extrathoracic airways / J. Rutland, W. M. Griffin, P. J. Cole // Am. Rev. Respir. Dis. 1982. Vol. 125. № 1. P. 100-105.
18. Secondary ciliary dyskinesia in upper respiratory tract/ B. Bertrand [et al.] //Acta. Otorhinolaryngol. Belg. 2000. Vol. 54. № 3. P. 309316.
19. Sisson J. H. Effects of guaifenesin on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency in healthy volunteers / J. H. Sisson, A. J. Yonkers, R. H. Waldman// Chest. 1995. Vol. 107. № 3. P. 747751.
20. Sleigh M. A. Movement and coordination of tracheal cilia and the relation of these to mucus transport // Prog. Clin. Biol. Res. 1982. Vol. 80. P. 19-24.
21. Stetinova V. In vitro and in vivo antioxidant activity of ambroxol / V. Stetinova, V. Herout, J. Kvetina // Clin. Exp. Med. 2004. Vol. 4. № 3. P. 152-158.
22. The effect of dibutyryl-cyclic AMP on the ciliary activity of human respiratory epithelium in vitro / G. di Benedetto [et al.] // Proc. Physiol. Soc. — St. Georges meeting. 1989.
23. The inhibitory effect of ambroxol on hypochlorous acid-induced tissue damage and respiratory burst of phagocytic cells / Y. Cho [et al.] // Eur. J. Pharmacol. 1999. Vol. 383. № 1. P. 83-91.
24. Yager J. Measurement of frequency of ciliary beats of human respiratory epithelium / J. Yager, T. M. Chen, M. J. Dulfano // Chest. 1978. Vol. 73. № 5. P. 627-633. ■
Полиморфизм генов антиоксидантных ферментов и формирование
^ W W
бронхолегочнои дисплазии у недоношенных детей
Е. Б. Павлинова, Н. А. Геппе
Bronchopulmonary Dysplasia in Preterm Infants: Role of Polymorphism in Antioxidant Enzyme Genes
E. B. Pavlinova, N. A. Geppe
Болезни легких занимают важное место в структуре заболеваемости и смертности новорожденных и грудных детей. С неонатальным периодом связана такая патология легких, как бронхолегочная дисплазия (БЛД), формирующаяся преимущественно у недоношенных детей и имеющая хроническое течение. Проблема БЛД является актуальной в педиатрии, и в частности в детской пульмонологии. Это связано с тем, что данная патология является наиболее распространенной формой среди хронических заболеваний легких в раннем возрасте и второй по частоте после бронхиальной астмы в последующие периоды детства [1].
Патогенез БЛД многофакторный. Хорошо известны основные риски ее развития: повреждение легких при ИВЛ, незрелость легочной ткани, недостаточность антиоксидантной защиты, внутриутробная и постнатальная инфекции [5].
В связи с развитием перинатальных технологий и улучшением оказания помощи глубоконедоношенным детям (применение препаратов сурфактанта, современные методики ИВЛ) ятрогенные причины развития БЛД максимально предупреждены, однако количество пациентов, страдающих данным заболеванием, не становится меньше [2]. Поэтому главную роль отводят эндогенным факторам риска, к которым, в частности, относится генетическая предрасположенность [3].
В последнее время был проведен ряд исследований по выявлению генов-кандидатов, вызывающих при БЛД нарушения на уровне антиоксидантной и иммунной систем защиты организма, функционирования сосудистой системы легких и системы продукции белков сурфактанта [10, 18]. Одним из перспективных направлений является определение одно-нуклеотидных замен в генах антиоксидантных ферментов.
Например, такая взаимосвязь с риском формирования БЛД была показана для гена GSTP1 [7]. На наш взгляд, необходимы дальнейшие исследования генетических полиморфизмов ферментов, обеспечивающих защиту от окислительного стресса, таких как супероксиддисмутаза (SOD) и глутаматци-стеин лигаза (GCL), у недоношенных новорожденных.
Фермент SOD представлен тремя изоформами (вариантами): цитозольной — Cu,ZnSOD, митохондриальной — MnSOD и внеклеточной — EC-SOD. Вторая форма фермента — это находящийся в митохондриях тетрамерный белок, содержащий в активном центре марганец [4]. Ген MnSOD (sod 2) расположен в дистальной части хромосомы 6q25.3 и не имеет сколько-нибудь значимой гомологии с Cu,ZnSOD и EC-SOD. М. Bastaki и др. проанализировали активность MnSOD в митохондриях у здоровых некурящих людей и обнаружили, что она на 15% выше у женщин, чем у мужчин, и на 33% — у лиц с СТ- или ТТ-генотипами полиморфизма 47 C/Т, чем у обследованных с CC. Исследователи пришли к выводу, что вариабельность антиоксидантной активности фермента объясняется значительными ассоциациями с тремя известными генетическими полиморфизмами [12]. Кроме того, возможно наличие других вариантов однонуклеотидных замен в гене MnSOD, которые могут влиять на уровень экспрессии, активность протеина или его конформацию.
SOD и каталаза не нуждаются в кофакторах, что делает их работу автономной, не зависящей от функционирования других клеточных структур. В то же время для работы глу-татионзависимых ферментов необходим восстановленный глютатион, который синтезируется посредством реакций, осуществляемых GCL и глютатионсинтетазой. Фермент GCL — это гетеродимер, состоящий из каталитической (GCLC) и регуляторной (GCLM) субъединиц. GCLC обеспечивает каталитическую активность фермента, а GCLM повышает каталитическую эффективность. Они кодируются генами GCLC (в локусе 6р12) и GCLM (в локусе 1p22-p21) соответственно. Мыши, не имеющие гена GCLC, умирают до рождения; те, у которых отсутствует ген GCLM, не имеют фенотипических проявлений заболевания, хотя характеризуются пониженным уровенем глютатиона и обладают повышенной чувствительностью к токсическим поражениям [16]. В исследованиях S. Nacamura и R. Gysin был установлен полиморфизм генов GCLM и GCLC [21, 15]. Их экспрессия локализована преимущественно в эпителиальных клетках дыхательных путей, что, возможно, объясняет высокую антиоксидантную активность жидкости, прилегающей к апикальной части эпителия. D. Postma и др. изучали повреждающее действие, которое оказывает табачный дым на лиц, имеющих полиморфные замены в генах, кодирующих GCL. Авторы установили, что наличие полиморфизма гена GCLC влияет на прогрессивное снижение функции легких: в этой группе отмечались более тяжелые стадии хронической обструктивной болезни легких [17]. Возможный вклад однонуклеотидных замен в генах анти-оксидантных ферментов в патогенез заболевания заключается в изменении баланса прооксидантов и антиоксидантов в организме недоношенного ребенка и усилении патологического воздействия свободных радикалов на незрелую легочную ткань, что может привести к формированию БЛД.
Цель исследования — изучить уровни маркеров окси-дативного стресса у недоношенных новорожденных группы риска развития БЛД в зависимости от наличия полиморфных
вариантов генов MnSOD и GCL для уточнения их вклада в формирование заболевания.
Материал и методы
В фиксированное когортное проспективное контролируемое исследование было включено 60 недоношенных детей, имевших, в соответствии с прогностическими параметрами, определенными по методу А. Вальда, высокий риск развития БЛД (основная группа). Пациенты получали лечение в реанимационном отделении и отделении недоношенных детей Омской областной детской клинической больницы и Городского перинатального центра в 2008-2010 гг. Это новорожденные со сроком гестации 27-35 недель, поступившие из родильных домов на второй этап выхаживания в реанимационное отделение стационара (из них 37 мальчиков и 23 девочки, 2 двойни). Все они имели дыхательные расстройства (респираторный дистресс-синдром), все находились на ИВЛ.
Критериями исключения являлись: наличие врожденных пороков развития легких и сердца (за исключением открытых артериального протока и овального окна), генерализованной внутриутробной инфекции, сепсиса, аспирационного синдрома; проведение ИВЛ по поводу тяжелого гипоксиче-ского поражения ЦНС и пороков развития ЦНС.
Группу контроля составили недоношенные новорожденные без респираторных нарушений, со сроком гестации 33-36 недель, не нуждавшиеся в респираторной поддержке с момента рождения и находившиеся на втором этапе выхаживания в отделении недоношенных детей (30 человек, из них 14 мальчиков, 16 девочек, 1 двойня).
В процессе динамического наблюдения за основной группой сформированы 2 подгруппы: 27 пациентов, у которых развилась БЛД (первая подгруппа), и 33 ребенка без БЛД (вторая подгруппа). Диагноз был поставлен в соответствии с Российской классификацией заболеваний органов дыхания у детей (2009). Степень тяжести БЛД определяли в 36 недель постконцептуального возраста (у детей со сроком гестации менее 32 недель) либо в 56 дней жизни (у детей со сроком гестации 32 недели и более).
У всех пациентов проводили анализ материнского анамнеза, состояния ребенка после рождения, оценивали данные клинического осмотра, инструментальных методов обследования (рентгенографии органов грудной клетки, ЭхоКГ, ЭКГ).
Осуществляли молекулярно-генетическое исследование венозной крови обследуемых, стабилизированной 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 10 : 1. Образцы геномной ДНК выделяли из лейкоцитарной фракции с использованием комплекса реагентов <^Р-экспресс» («Литех», Москва). Изучен аллельный полиморфизм трех генетических маркеров:
• полиморфизм гена MnSOD, в котором тимидин в позиции 58, относящейся к экзону 3, замещен цитозином, что приводит к замене аминокислотного остатка изо-лейцина на треонин и способствует снижению активности фермента [19];
• полиморфизм гена MnSOD, в котором цитозин в позиции 60 в экзоне 3 замещен тимином, что приводит к замене аминокислоты лейцин на фенилаланин и изменению уровня MnSOD [19];
• полиморфизм каталитической субъединицы GCL, который заключается в точечной замене в позиции 129 цитозина на тимин [8].
Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих указанные полиморфизмы, осуществляли на основе технологии ПЦР. Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, выполнили с помощью аллель-специфической ПЦР с использованием наборов компании «Литех» (Москва).
Кроме того, у детей основной и контрольной групп были исследованы общая окислительная способность крови (total oxidant capacity, ТОС) и общая антиоксидантная способность крови (total antioxidant capacity, ТАС), которые определяют баланс между прооксидантами и анти-оксидантами и изменены при заболеваниях, вызываемых повреждением тканей свободными радикалами. Значения ТОС и ТАС были найдены с помощью микропланшетного колориметрического теста. Также было оценено содержание фермента SOD и глютатиона в сыворотке крови как продуктов, уровень которых может изменяться при наличии однонуклеотидных замен в генах соответствующих антиоксидантных ферментов. SOD определяли в сыворотке крови с использованием стандартных реактивов фирмы Randox (Великобритания) на биохимическом анализаторе Screen Master производства фирмы Hospitex (Швейцария). Содержание восстановленного глютатиона в сыворотке крови определяли методом J. Sedlak (1968). Исследование генетических и биохимических маркеров проводили на первой неделе жизни ребенка.
Статистическая обработка результатов выполнена с использованием лицензионных программ MS Excel, Statistica 6.0. Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. При соответствии данных нормальному распределению значения количественных признаков представляли в виде M + 8, где М — среднее значение количе-
* Различие с основной группой статистически значимо: р = 0,009.
ственного признака, 8 — стандартное отклонение среднего. Проверку статистических гипотез осуществляли путем выявления различий между сравниваемыми группами с применением критерия х2, и-критерия Манна — Уитни. При всех статистических расчетах критический уровень ошибки р принимали равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Срок гестации у детей основной группы составил 30,90 ± 2,34 недели, средняя масса при рождении — 1563,40 ± 416,31 г (900,0-2290,0); у пациентов контрольной группы срок гестации был 33,20 ± 1,63 недели, масса при рождении — 1824,17 ± 241,74 г (1640,0-2490,0). Различие новорожденных по массе тела и сроку гестации было связано с критериями формирования групп (табл. 1).
Состояние при рождении у всех детей основной группы оценено как тяжелое или очень тяжелое, что было обусловлено наличием дыхательной недостаточности 2-3-й степени и неврологической симптоматики (синдром угнетения ЦНС) на фоне недоношенности. При физикальном исследовании легких у них отмечались ослабленное неравномерное дыхание, рассеянная крепитация, реже сухие и влажные мелкопузырчатые хрипы.
Результаты анализа полиморфных локусов генов MnSOD и GCL в основной и контрольной группах представлены в таблице 2. У пациентов группы риска развития БЛД и у недоношенных новорожденных без дыхательных расстройств преобладал обычный генотип: 129 СС GCLC (61,6 и 86,7% соответственно, х2 = 0,84, р > 0,05), 58 ТТ sod2 (80,0 и 83,3%, х2 = 0,02, р > 0,05), 60 СС sod2 (81,6 и 93,3%, х2 = 1,42, р > 0,05). Однако в основной группе статистически значимо чаще встречалось гетерозиготное носительство мутантного гена GCLC (36,7% против 13,3%, х2 = 6,73, р < 0,05). Кроме
Таблица 1 Показатели антропометрии и гестационного возраста детей основной и контрольной групп, М ± 8
Показатель Основная группа, n = 60 Контрольная группа, n = 30
Масса тела, г 1563,40 + 416, 31 1824,17 + 241,74*
Длина тела, см 40,77 + 3,69 44,01 + 3,78
Окружность груди, см 27,80 + 2,70 30,57 + 2,98
Окружность головы, см 25,50 + 2,49 27,18 + 2,72*
Срок гестации, недели 30,9 + 2,34 33,20 + 1,63
Таблица 2
Распределение полиморфизмов GCLC и sod2 в основной и контрольной группах, абс. (%)
Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля Генотип ЧВ генотипа
основная группа, n = 60 контрольная группа, n = 30 основная группа, n = 60 контрольная группа, n = 30
GCLC 129 C/T -129C* 96 (80,0) 56 (93,3) 129 СС 37 (61,7) 26 (86,7)
-129T* 24 (20,0) 4 (6,7) 129 ТТ 1 (1,7) 0 (0,0)
129 СТ* 22 (36,7) 4 (13,3)
sod2 58 T/C -58Т 107 (89,2) 55 (91,7) 58 ТТ 48 (80,0) 25 (83,3)
-58С 13 (10,8) 5 (8,3) 58 СС 1 (1,7) 0 (0,0)
58 ТС 11 (18,3) 5 (16,7)
sod2 60 C/T -60C 107 (89,2) 58 (96,7) 60 СС 49 (81,7) 28 (93,3)
-60T* 13 (10,8) 2 (3,3) 60 ТТ 1 (V) 0 (0,0)
60 СТ 10 (16,7) 2 (6,7)
* Различия между группами статистически значимы (критерий х2 с поправкой Йетса). Примечание. ЧВ — частота встречаемости.
того, частота встречаемости стандартных аллелей -129С вас и -60С зоё2 была выше в группе контроля, а у пациентов группы риска развития заболевания статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т вас и -60Т зоё2. Возможно, это привело к более низкой защите от окислительного стресса, что способствовало формированию БЛД у части пациентов основной группы. Генная ассоциация 129 С/Т вас и 58 Т/С $оё2 была найдена у 4 детей, 129 С/Т вас и 60 С/Т зоё2 — у 1 ребенка.
Как отмечалось ранее, пациентов основной группы разделили на две подгруппы, между которыми выявились статистически значимые различия (табл. 3). У 12 (44,4%) детей, имевших БЛД, статистически значимо чаще были диагностированы гетерозиготный генотип 129 СТ вас (х2 = 4,86, р < 0,05), а также носительство 58 ТС зоё2 (х2 = 4,04, р < 0,05), чем у пациентов, не сформировавших заболевание при тех же факторах риска. По одному ребенку из первой подгруппы имели гомозиготные генотипы 129 ТТ вас, 58 СС зоё2, 60 ТТ воё2, однако различия не были статистически значимыми. Частота встречаемости минорных аллелей генов ферментов GCL и MnSOD также была выше в группе детей, страдающих БЛД (-129Т вас, х2 = 4,82, р < 0,05; -58С воё2, х2 = 5,76, р < 0,05). Это позволило сделать предположение, что у новорожденных с полиморфными генотипами GCL и MnSOD чаще формируется БЛД, чем у детей группы риска развития заболевания, не имеющих мутации.
Учитывая, что полиморфизм генов зоё2 и вас может влиять на уровень, активность соответствующих ферментов и их конформацию, нами были определены биохимические параметры, которые, на наш взгляд, наиболее полно характеризуют состояние прооксидантной и антиоксидантной
систем организма наблюдаемых детей. Значения исследуемых биохимических маркеров у пациентов из группы риска развития БЛД и у обследованных, не имеющих дыхательных расстройств, приведены в таблице 4.
Статистически значимых различий при количественном исследовании ТОС, SOD и глютатиона в сыворотке крови у детей основной и контрольной групп выявлено не было. Однако, как видно из таблицы 4, пациенты из группы риска развития БЛД имели более низкие значения вышеперечисленных показателей. Кроме того, ТАС у данных больных была недостаточной (1-1,3 ммоль/л — промежуточная антиок-сидантная способность), а в группе детей без дыхательных расстройств ее значения достигали нормального уровня и были статистически значимо выше. Вероятно, это могло способствовать выраженному оксидативному стрессу у недоношенных новорожденных из основной группы, что предрасполагает к развитию патологического процесса в легочной ткани.
Далее мы проанализировали уровни маркеров окси-дативного стресса у пациентов, имевших факторы риска развития БЛД, в зависимости от наличия полиморфных генов антиоксидантных ферментов. У недоношенных детей с однонуклеотидными заменами в гене sod2 ТАС была низкой (табл. 5, табл. 6), а у пациентов с мутацией GCLC она находилась на промежуточном уровне, учитывая нормативные значения (табл. 7). В литературе имеются единичные публикации, описывающие изменения этих параметров у недоношенных новорожденных. Так, E. A. Dizdar отметил низкие значения ТАС у недоношенных детей с гестацион-ным возрастом менее 28 недель, развивших респираторный дистресс-синдром, тогда как уровень ТОС у них статисти-
Таблица 3
Распределение полиморфизмов GCLC и sod2 у детей, развивших бронхолегочную дисплазию и не сформировавших заболевание, абс. (%)
Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля Генотип ЧВ генотипа
первая подгруппа (БЛД), n = 27 вторая подгруппа (без БЛД), n = 33 первая подгруппа (БЛД), n = 27 вторая подгруппа (без БЛД), n = 33
GCLC 129 C/T -129C* 40 (74,1) 59 (89,4) 129 СС 14 (51,9) 26 (78,8)
-129T* 14 (27,5) 7 (10,6) 129 СТ* 12 (44,4) 7 (21,2)
129 ТТ 1 (3,7) 0 (0,0)
sod2 58 T/C -58Т 44 (81,5) 62 (93,9) 58 ТТ 18 (66,7) 29 (87,9)
-58С* 10 (18,5) 4 (6,1) 58 ТС* 8 (29,6) 4 (12,1)
58 СС 1 (3,7) 0 (0,0)
sod2 60 C/T -60C 46 (85,2) 62 (93,9) 60 СС 20 (74,1) 29 (87,9)
-60T 8 (14,8) 4 (6,1) 60 СТ 6 (22,2) 4 (12,1)
60 ТТ 1 (3,7) 0 (0,0)
* Различия между подгруппами статистически значимы (критерий х2 с поправкой Йетса). Примечание. БЛД — бронхолегочная дисплазия; ЧВ — частота встречаемости.
Таблица 4 Значения биохимических параметров у детей основной и контрольной групп, М ± §
Параметры Основная группа, n = 60 Контрольная группа, n = 30 р*
TOC (ммоль/л) 0,24 ± 0,09 0,27 ± 0,70 0,570
TAC (ммоль/л) 1,23 ± 0,77 2,27 ± 0,97 0,003
SOD (Ед СОД/мл) 0,40 ± 0,04 0,85 ± 0,15 0,050
Глютатион (ммоль/л) 1,18 ± 0,14 1,19 ± 0,14 0,650
* Сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна — Уитни.
Примечание. SOD — супероксиддисмутаза; ТАС — общая антиоксидантная способность крови; ТОС — общая окислительная способность крови.
Таблица 5 Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса у недоношенных детей из группы риска развития бронхолегочной дисплазии с полиморфными вариантами гена 58 Т/С зоЬ2, М ± 8
Параметры Мутация 58 Т/С sod2 р*
есть, n = 12 нет, n = 48
TOC (ммоль/л) 0,26 ± 0,08 0,29 ± 0,09 0,470
TAC (ммоль/л) 0,74 ± 0,42 1,59 ± 0,88 0,001
SOD (Ед СОД/мл) 0,14 ± 0,01 0,24 ± 0,02 0,047
Глютатион (ммоль/л) 1,23 ± 0,23 1,24 ± 0,14 0,86
* Сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна — Уитни.
Примечание. SOD — супероксиддисмутаза; ТАС — общая антиоксидантная способность крови; ТОС — общая окислительная способность крови.
Таблица 6 Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса у недоношенных детей из группы риска развития бронхолегочной дисплазии с полиморфными вариантами гена 60 С/Т зоЬ2, М ± 8
Параметры Мутация 60 С/Т sod2 р*
есть, n = 11 нет, n = 49
TOC (ммоль/л) 0,29 ± 0,09 0,29 ± 0,10 0,720
TAC (ммоль/л) 0,75 ± 0,44 1,57 ± 0,81 0,002
SOD (Ед СОД/мл) 0,08 ± 0,03 0,19 ± 0,09 0,058
Глютатион (ммоль/л) 1,32 ± 0,12 1,20 ± 0,21 0,110
* Cравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна — Уитни.
Примечание. SOD — супероксиддисмутаза; ТАС — общая антиоксидантная способность крови; ТОС — общая окислительная способность крови.
Таблица 7 Показатели, характеризующие тяжесть оксидативного стресса у недоношенных детей из группы риска развития бронхолегочной дисплазии с полиморфными вариантами гена вО.С, М ± 8
Параметры Мутация GCLC р*
есть, n = 23 нет, n = 37
TOC (ммоль/л) 0,31 ± 0,08 0,28 ± 0,10 0,280
TAC (ммоль/л) 1,07 ± 0,62 1,64 ± 0,75 0,025
SOD (Ед СОД/мл) 0,11 ± 0,02 0,20 ± 0,03 0,080
Глютатион (ммоль/л) 1,11 ± 0,23 1,31 ± 0,15 0
* Сравнение двух групп переменных с помощью критерия Манна — Уитни.
Примечание. SOD — супероксиддисмутаза; ТАС — общая антиоксидантная способность крови; ТОС — общая окислительная способность крови.
чески значимо не изменялся. Кроме того, автором выявлена корреляция между снижением ТАС у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом и длительностью респираторной поддержки, а также неблагоприятным исходом заболевания [22].
Количественные значения фермента SOD в плазме крови были низкими как у детей группы риска развития БЛД, так и у пациентов контрольной группы (см. табл. 4). Та же тенденция отмечена в исследовании N. Nassi и др., которые определяли SOD в плазме и эритроцитах доношенных и недоношенных новорожденных и пришли к выводу, что снижение уровня фермента наблюдается в течение 100 дней после рождения [6]. В соответствии с полученными нами результатами, у недоношенных новорожденных с однонуклеотидной заменой 58 Т/С в гене sod2 значения SOD были статистически значимо меньше, чем у детей с генотипом 58 ТТ sod2 (см. табл. 5). Учитывая, что фактически 30,0% детей, развивших впоследствии БЛД, имели полиморфный генотип sod2 и, соответственно, снижение уровня SOD, можно предположить, что этот патогенетический механизм имеет большое значение
в повреждении легочных структур. Вероятно, изменения связаны с тем, что фермент SOD, инактивирующий супероксидный радикал, может предотвращать активацию и индукцию синтеза матриксных металлопротеиназ (ММП). Установлено, что это семейство ферментов, разрушающих белки внеклеточного матрикса, играет важную роль в ряде физиологических и патологических процессов, включая эмбриогенез, заживление ран, воспаление, сердечно-сосудистые болезни, болезни легких и рак [14]. Активность ММП контролируется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ [9]. Другими, не менее важными регуляторами их активности и синтеза, по данным экспериментальных исследований, являются активные формы кислорода, эффекты которых ограничиваются энзимными и неэнзимными антиоксидантами. Оксиданты стимулируют нуклеарные факторы транскрипции (NFkB), которые, в свою очередь, активируют гены, ответственные за синтез IL-1, IL-8, ФНО-а и других про-воспалительных цитокинов, что приводит к привлечению ней-трофилов и эскалации генерации активных форм кислорода. Последние способствуют высвобождению ММП и повышают коллагеназную активность, что ведет к разрушению компо-
нентов экстрацеллюлярного матрикса и развитию фиброза в легочной ткани [20].
Кроме того, учитывая данные о подавлении активации ММП-9 (желатиназы) неферментным антиоксидантом ^ацетилцистеином [11], особое значение в патогенезе окислительного стресса и повреждения легких имеет содержание глютатиона в сыворотке крови. Известно, что оно значительно увеличивается у маловесных детей после рождения [13]. По нашим данным, содержание глютатиона у новорожденных группы риска развития БЛД статистически значимо не отличалось от группы контроля, т. е. имело нормальные значения. Однако в группе детей, у которых диагностирован полиморфный генотип вас, оно было статистически значимо ниже, чем у недоношенных, не имевших данного полиморфизма. В результате нашего исследования почти у половины (44,4%) детей, развивших БЛД, выявлен гетерозиготный генотип 129 СТ вас, против 21,5% случаев у пациентов, не сформировавших заболевание (х2 = 4,86, р < 0,05), что могло привести к усилению оксидативного стресса, потенцированию апоптоза бронхиальных эпителиальных клеток, дальнейшему ремодели-рованию стенок бронхов и формированию заболевания. Таким образом, по нашим данным, дети группы риска развития БЛД с полиморфными вариантами генов вас и 58 Т/С зоё2 обнаруживают недостаточную антиоксидантную защиту, что, возможно, провоцирует более выраженное повреждение ткани легких.
Заключение
У пациентов группы риска развития бронхолегочной дисплазии статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т вас и -60Т воё2, что могло способствовать снижению антиоксидантной защиты и усилению оксидативного стресса.
У 44,4% детей, развивших бронхолегочной дисплазию, выявлен гетерозиготный генотип 129 СТ вас, против 21,5% случаев у пациентов, не сформировавших заболевание (р < 0,05). Полиморфный генотип 58 ТС зоё2 диагностирован у 29,6% недоношенных подгруппы с бронхолегочной диспла-зией (р < 0,05). Этот результат позволил сделать вывод, что новорожденные, имеющие такой аллельный полиморфизм, статистически значимо чаще формировали заболевание.
У недоношенных детей группы риска развития бронхоле-гочной дисплазии с полиморфными вариантами генов вас, 58 Т/С воё2, а также 60 С/Т зоё2 выявлены статистически значимо более низкие значения общей антиоксидантной способности, чем у пациентов с обычным генотипом.
Пациенты основной группы с полиморфными вариантами генов MnSOD и GCL имели более низкий уровень супер-оксиддисмутазы и глютатиона в сыворотке крови, что могло способствовать повышению синтеза активных форм кислорода, инициации активности матриксных металлопротеиназ и формированию фиброза в легочной ткани.
Резюме
Цель исследования — изучить уровни маркеров оксидативного стресса у недоношенных новорожденных группы риска развития бронхолегочной дисплазии (БЛД) в зависимости от наличия полиморфных вариантов генов MnSOD и GCL для уточнения их вклада в формирование заболевания.
Дизайн исследования — фиксированное когортное проспективное контролируемое исследование.
Материал и методы. Основную группу составили 60 недоношенных детей с высоким риском развития БЛД; контрольную — 30 недоношенных детей без респираторных нарушений. Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных точечными нуклеотидными заменами, выполнили с помощью аллель-специфической ПЦР.
Результаты. У пациентов основной группы статистически значимо чаще регистрировались минорные аллели -129Т GCLC и -60Т sod2. Среди детей с развитием БЛД у 44,4% выявлен гетерозиготный генотип 129 СТ GCLC, у 29,6% диагностирован полиморфный генотип 58 ТС sod2. Недоношенные дети с полиморфными вариантами генов MnSOD и GCL имели более низкие уровни общей антиоксидантной способности, супероксиддисмутазы и глютатиона в сыворотке крови по сравнению с детьми с обычным генотипом.
Заключение. Проведенное исследование позволяет предположить, что полиморфизм генов антиоксидантных ферментов имеет патогенетическое значение в формировании БЛД.
Ключевые слова: недоношенные дети, бронхолегочная дисплазия (БЛД), антиоксидантные ферменты, полиморфизм генов.
Summary
Study Objective: To evaluate the association between polymorphism in the MnSOD and GCL genes and the levels of markers of oxidative stress in preterm infants who are at risk for bronchopulmonary dysplasia (BPD). This was done to assess the role of these polymorphic genes in the development of BPD.
Study Design: This was a fixed, cohort, prospective, controlled study.
Materials and Methods: The main group included 60 preterm infants who were at high risk of developing BPD. The control group included 30 preterm infants who did not have any respiratory problems. Allele-specific PCR was used to identify allelic variants possessing single nucleotide substitutions.
Results: The main group showed a significantly higher frequency of minor alleles (GCLC -129T and sod2 -60T). The GCLC 129 C/T heterozygous variant was indentified in 44.4% of infants with BPD, and the sod2 58 T/C polymorphism was found in 29.6% of patients. Preterm infants with polymorphism in the MnSOD and GCL genes had a lower total antioxidant capacity and lower serum levels of superoxide dismutase and glutathione compared to children with the standard genotype.
Conclusion: This study suggests that polymorphism in the antioxidant enzyme genes is a pathogenetic factor in BPD. Keywords: preterm infants, bronchopulmonary dysplasia (BPD), antioxidant enzymes, genetic polymorphism.
Литература
1. Богданова А. В. Система оказания помощи детям с бронхолегочной дисплазией на различных этапах ведения больных / А. В. Богданова, Е. В. Бойцова, С. В. Старевская. СПб., 2004. 16 с.
2. Бронхолегочная дисплазия в стадии хронической болезни у детей грудного и раннего возраста/Д. Ю. Овсянников [и др.]// Педиатрия. 2007. Т. 86. № 4. С. 35-42.
3. Клименко Т. М. Новое в дефиниции патогенеза бронхолегочной дисплазии у новорожденных / Т. М. Клименко, В. С. Агашков // Здоровье ребенка. 2011. № 1. С. 115-120.
4. Кольман Я. Наглядная биохимия/Я. Кольман, К.-Г. Рем. М.: Мир; Бином, 2009. 469 с.
5. Шабалов Н. П. Неонатология: учеб. пособие. М.: МЕДпресс-информ, 2009. Т. 2. 640 с.
6. Anti-oxidant enzymes and related elements in term and preterm newborns / N. Nassi [et al.] // Pediatr. Int. 2009. Vol. 51. № 2. P. 183-187.
7. Association of glutathione-S-transferase-Pl (GST-PI) polymorphisms with bronchopulmonary dysplasia / M. H. Manar [et al.] // J. Pe-rinatol. 2004. Vol. 24. № 1. P. 30-35.
8. Association of polymorphism in glutamate-cysteine ligase catalytic subunit gene with coronary vasomotor dysfunction and myocardial
infarction / S. Koide [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. 2003. Vol. 41. № 4. P. 539-545.
9. Cunningham L. A. Multiple roles for MMPs and TIMPs in cerebral ischemia / L. A. Cunningham, M. Wetzel, G. A. Rosenberg // Glia. 2005. Vol. 50. № 4. P. 329-339.
10. Data mining and multiparameter analysis of lung surfactant protein genes in bronchopulmonary dysplasia / M. Rova [et al.] // Hum. Mol. Genet. 2004. Vol. 13. № 11. P. 1095-1104.
11. Galis Z. S. Matrix metalloproteinases in vascular remodeling and atherogenesis: the good, the bad, and the ugly / Z. S. Galis, J. J. Khatri// Circ. Res. 2002. Vol. 90. P. 251-262.
12. Genotype-activity relationship for Mn-superoxide dismutase, glutathione peroxidase 1 and catalase in humans / M. Bastaki [et al.] // Pharmacogenet. Genomics. 2006. Vol. 16. № 4. P. 279-286.
13. Glutathione synthesis rates in early postnatal life // D. Rook [et al.] // Pediatr. Res. 2010. Vol. 67. № 4. P. 407-411.
14. Greenlee K. J. Matrix metalloproteinases in lung: multiple, multifarious, and multifaceted / K. J. Greenlee, Z. Werb, F. Kherad-mand// Physiol. Rev. 2007. Vol. 87. № 1. P. 69-98.
15. Impaired glutathione synthesis in schizophrenia: convergent genetic and functional evidence / R. Gysin [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. Vol. 104. № 42. P. 16621-16626.
16. Initial characterization of the glutamate-cysteine ligase modifier subunit gclm (-/-) knockout mouse. Novel model
system for a severely compromised oxidative stress response / Y. Yang [et al.]// J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. № 51. P. 4944649452.
17. Lung function loss, smoking, vitamin C intake, and polymorphisms of the glutamate-cysteine ligase genes / M. Siedlinski [et al.] // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008. Vol. 178. № 1. P. 13-19.
18. Matrix metalloproteinase gene polymorphisms and bronchopulmo-nary dysplasia: identification of MMP16 as a new player in lung development/ A. Hadchouel [et al.] // PloS one. 2008. Vol. 3. № 9. P. 3188.
19. Miao L. Regulation of superoxide dismutase genes: implications in diseases / L. Miao, D. K. St. Clair // Free Radic. Biol. Med. 2009. Vol. 47. № 4. P. 344-356.
20. Nelson K. K. Mitochondrial redox control of matrix metalloproteina-ses / K. K. Nelson, J. A. Melendez // Free Radic. Biol. Med. 2004. Vol. 37. № 6. P. 768-784.
21. Polymorphism in glutamate-cysteine ligase modifier subunit gene is associated with impairment of nitric oxide-mediated coronary vasomotor function / S. Nakamura [et al.] // Circulation. 2003. Vol. 108. № 12. P. 1425-1427.
22. Total antioxidant capacity and total oxidant status after surfactant treatment in preterm infants with respiratory distress syndrome / E. A. Dizdar [et al.] // Ann. Clin. Biochem. 2011. Vol. 48. № 5. P. 462-467. ■
Оптимизация комбинированной базисной терапии у детей
W > V V
со среднетяжелой бронхиальной астмой на санаторном этапе
Н. А. Мокина, И. В. Семёнова
How to Optimize Combination Controller Therapy in Children with Moderate to Severe Asthma in Sanatorium Settings
N. A. Mokina, I. V. Semyonova
В большинстве стран мира распространенность бронхиальной астмы (БА) неуклонно растет, особенно среди детей. Данное заболевание наносит значительный социально-экономический ущерб, связанный не только с затратами на лечение, но также с потерей трудоспособности и менее активным участием больных в социальной и семейной жизни. По оценкам международных экспертов, в мире не менее 300 млн больных БА. При этом ее распространенность в разных странах колеблется от 1 до 18%. По результатам эпидемиологических исследований, в России встречаемость БА среди детей составляет от 5,6 до 12,1%. Среднетяжелая и тяжелая формы данной патологии составляют до 80% в общей структуре заболевания и потребляют наибольший объем ресурсов здравоохранения [1, 3].
В сложившейся структуре организации медицинской помощи в РФ лечебно-профилактическими учреждениями, в которых возможно комплексное использование современных методов базисной терапии и медицинской реабилитации детей с БА, являются детские специализированные санатории. При этом ключевым остается вопрос оптимальной базисной терапии в комплексной программе медицинской
реабилитации с учетом наиболее длительного сохранения максимально полной ремиссии заболевания, поскольку полученные результаты напрямую влияют на здоровье будущего трудоспособного поколения [2].
Фиксированная, так же как и свободная, комбинация ингаляционных ГКС (иГКС) и Р2-агонистов длительного действия (Р2-АГДД) обладает способностью обеспечивать более адекватный (в сравнении с монотерапией иГКС) контроль БА у взрослых [7]. Применение средних и высоких доз иГКС совместно с Р2-АГДД приводит к аддитивному эффекту, т. е. позволяет достичь лучшего контроля БА у большего числа пациентов без повышения дозы иГКС. Показатели ФВД, контроль БА (дни без симптомов заболевания, частота применения препарата неотложной помощи — Р2-агониста короткого действия (Р2-АГКД), число обострений БА) оказываются статистически значимо лучше при применении комбинированной терапии иГКС и Р2-АГДД (будесонид/формотерол или флутиказон/сальметерол), чем при монотерапии иГКС [6-9, 11-13].
В то же время вопрос о сравнительной оценке эффективности комбинированной терапии иГКС и Р2-АГДД, назнача-
