CC BY
123
Ключевые слова: пароксетин, флувоксамин, сер-
тралин, флуоксетин, прегабалин
В химико-токсикологическом и судебно-химическом исследовании наиболее часто применяется метод хроматографии в тонких слоях сорбентов, в особенности в качестве предварительного метода. Тонкослойная хроматография является базовым методом благодаря своей доступности, простоте выполнения, достаточной чувствительности и избирательности и используется в скрининге отдельных групп токсикологически значимых веществ.
Разделение веществ методом хроматографии в тонких слоях сорбентов происходит быстрее, чем методом хроматографии на бумаге. Метод тонкослойной хроматографии более чувствителен, тонкий слой сорбента устойчив к агрессивным средам.
Для достижения максимальной эффективности разделения исследуемых лекарственных веществ от соэкстр-активных веществ методом ТСХ наибольшее значение имеет правильный выбор сорбента и подвижной фазы. Большинство неподвижных фаз являются адсорбентами и разделение достигается благодаря взаимодействию между лекарственным средством и поверхностью неподвижной фазы.
Нами в качестве хроматографических пластинок были использованы пластины отечественного производства с закрепленным слоем силикагеля - «Сорбфил» ПТСХ-11-А-УФ.
Поиск оптимальных условий идентификации исследуемых веществ проводили изучением его хроматографи-ческой подвижности в растворителях с различной полярностью.
На линию старта хроматографической пластины наносили 1 мкл 1 % спиртовых раствора пароксетина, флувок-самина, сертралина, флуоксетина и прегабалина (10 мкг). Хроматографирование проводили в стеклянных камерах внутренним объемом около 255 см3 (Ь = 13 см, d = 5 см). После насыщения камеры парами системы растворителей в течение 30 минут в нее помещали хроматографиче-ские пластины с нанесенной пробой и камеру закрывали крышкой герметически.
Полученные данные по хроматографической подвижности исследуемых лекарственных веществ в используемых растворителях (бутанол, аммиак, ацетон, этанол, этилацетат, бензол, толуол, хлороформ). Для пароксетина значение К/ в данных растворителях составили - 0,09; 0,05; 0,09; 0,12; 0; 0; 0; 0 соответственно, для флувоксамина -0,08; 0,88; 0,82; 0,27; 0,05; 0; 0; 0,04, для сертралина - 0,12; 0,94; 0,65; 0,29; 0,04; 0; 0; 0,08, для флуоксетина - 0,08; 0; 0,14; 0,11; 0,04; 0; 0; 0,02, для прегабалина - 0,06; 0,90; 0,04; 0,16; 0; 0; 0; 0,06.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что для получения оптимального состава подвижной фазы необходима смесь растворителей различной полярности в определённых соотношениях.
Растворители также были подобраны исходя из их дешевизны, они должны быть стабильны на воздухе, легко удаляться с пластины после хроматографии, должны быть нетоксичными и не должны реагировать с веществами, которые должны быть разделены. Для получения оптимального состава подвижной фазы мы готовили смеси растворителей с различной полярностью в определенных соотношениях - толуол-ацетон-этанол-25 % аммиак, соотношение 45:45:7:3 (8^; изопропанол-ацетон-25 % аммиак-вода, соотношение 22:25:4:7 (82); ацетон-25 % аммиак, соотношение 9:1 (83); толуол-ацетон-25 % аммиак, соотношение 50:50:4 (84). Хроматографическая подвижность исследуемых лекарственных веществ в системах раство-
рителей была следующая для пароксетина, флувоксамина, сертралина, флуоксетина и прегабалина: Б1-0,77; 0,91; 0,94; 0,84; 0,80 соответственно; 82-0,87; 0,93; 0,92; 0,86; 0,51; 83-0; 0,86; 0; 0,82; 0,10; 84-0,67; 0,91; 0,93; 0,78; 0,27.
Из исследованных нами подвижных фаз, только в системе ацетон-25 % аммиак (9:1) невозможно разделить исследуемые вещества между собой, в остальных 3 системах разделение достаточно для идентификации данные лекарственных веществ. Однако флувоксамин и сертралин в них со схожими значениями Ш, поэтому систему аце-тон-25 % аммиак (9:1) можно использовать для разделения между исследуемых лекарственных веществ между собой.
ВЫВОДЫ
Подобраны три оптимальные системы растворителей, позволяющие разделить пароксетин, флувоксамин, сер-тралин, флуоксетин, прегабалин между собой в случае совместного приема данных препаратов.
ВАРФАРИН И ЕГО АНАЛОГИ - АНТИКОАГУЛЯНТЫ КУМАРИНОВОГО РЯДА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
Г. В. Захарова, Р. Н. Пашовкина, Р. Р. Краснова
ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», Москва Изучены методы обнаружения и количественного определения варфарина и его аналогов антикоагулянтов 4-гидроксикумаринового ряда: бродифакума, бромадиолона, куматетралила в крови. Комбинация жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием и жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием дает возможность обнаруживать не только натив-ные вещества, но и их метаболиты в крови, моче и в тканях человека и животных. Ключевые слова: антикоагулянты кумаринового ряда, родентициды, жидкостная хроматография, химико-токсикологический анализ Варфарин используются в медицине для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушением системы свертывания крови. При приеме внутрь препарат полностью всасывается в желудочно-кишечном тракте. Период полувыведения варфарина составляет от 20 до 60 часов, подвергается биотрансформации в печени, выводится почками (92 %), только 1 % - в неизменном виде с мочой. Проникает через плаценту, но не секретируется с грудным молоком. Варфарин метаболизируется ферментной системой СУР2С9 в печени с образованием неактивных и слабоактивных метаболитов 6-гидроксиварфарина и 7-гидр-оксиварфарина, которые реабсорбируются из желчи. Дозирование варфарина осложняется тем, что он взаимодействует со многими широко используемыми лекарствами и даже химическими веществами, которые могут присутствовать в некоторых продуктах питания. Эти взаимодействия могут усиливать или ослабить ан-тикоагулянтный эффект варфарина. Варфарин проявляет кислые свойства (рКа варфарина составляет 5,1), поэтому максимально изолируется по методике жидкость - жидкостной экстракции веществ нейтрального и кислого характера.
Антикоагулянты 4-гидроксикумаринового ряда - бро-дифакум, бромадиолон, куматетралил используются в качестве родентицидов для уничтожения грызунов. В состав средств для борьбы с грызунами, выпускаемых под торговым названием «Щелкунчик», «Крысиная смерть 1», «Гремучая смесь», которые используются в Московской области, входит бродифакум в концентрации 0,005 %
в питательном субстрате. В связи с применением препаратов в сельском хозяйстве, в быту, в учреждениях возможны случаи отравления.
Кровь является наилучшим объектом для обнаружения антикоагулянтов в связи с длительным периодом полувыведения и из-за интенсивной биотрансформации этой группы веществ в организме. Для проведения исследования крови методом жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором (ДМД) использовали стандартный, систематический ход исследования для веществ кислого и нейтрального характера: кровь (0,5 мл) экстрагировали этилацетатом с добавлением 250 мкл насыщенного раствора хлористого аммония (рН 4,6-4,8).
Экстракты после испарения растворяли в подвижной фазе (100 мкл) и анализировали на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent Technologies 1200 с ДМД. Колонка ZORBAX Edipse XDB -C18 4,6x250 мм, 5 мкм. Предколонка Zorbax Edipse XDB - C18, 4,6x12,5 мм, 5 мкм. Температура термостата колонки 400С. Элюент «А»: кислота серная 2,5 моль/л в воде; элюент «В»: кислота серная 2,5 моль/л в ацетони-триле. Градиентный режим: до 3 минуты (98:2), с 3 минуты до 23 минуты (2:98), кондиционирование колонки после анализа пробы 8 мин (98 % элюента «А» - 2 % элю-ента «В»). Скорость потока: 1,0 мл/мин; Длина волны: 220 нм. Объем вводимой пробы 40 мкл.
Предел обнаружения варфарина в крови - 0,2 мг/л. Предел определения - 0,5 мг/л. Линейность - в диапазоне концентраций 0,5-2,0 мг/л крови.
При целенаправленном исследовании на антикоагулянты - производные 4-гидроксикумаринового ряда для получения более чистых экстрактов использовали также пробоподготовку с предварительным осаждением белков ацетонитрилом, перед экстракцией этилацетатом.
ВЫВОДЫ
В связи с широким применением антикоагулянтов в медицинской практике, в быту, в сельском хозяйстве (находятся в открытой доступности) и наличием случаев непреднамеренного отравления людей, чаще детей, а также животных (кошек и собак), возникла необходимость изучения возможностей метода жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектированием не только для обнаружения варфарина и его аналогов, но и для их количественного определения в крови. Метод селективен для изученных веществ.
Для качественного и количественного определения варфарина и его аналогов в крови использовали стандартный систематический метод для скрининга веществ кислого и нейтрального характера методом жидкостной хроматографии, включающий при пробоподготовке прямую экстракцию этилацетатом с добавлением насыщенного раствора хлорида аммония (рН 4,6-4,8).
Для того, чтобы снизить влияние соэкстрактивных веществ крови при целенаправленном исследовании, мы применили модификацию - осаждение белков ацетони-трилом перед экстракцией.
Представленный метод позволяет в пробе малой размерности (0,5 мл крови) одновременно идентифицировать и количественно определять варфарин и его аналоги. Количественное определение дает возможность дифференцировать терапевтические, токсические и летальные концентрации, что имеет большое значение как для своевременной детоксикационной терапии, введение антидота - витамина К, так и для установления причины смерти, обусловленной кровотечением.
Особый интерес представляет методика для исследования крови и тканей животных на антикоагулянты -
действующие вещества средств от грызунов в ветеринарной практике при подозрении на отравление домашних животных.
Анализ результатов судебно-химических и химико-токсикологических исследований за последние 2 года (2017-2018 гг.) показал, что варфарин в терапевтической концентрации был обнаружен у живых лиц в 7 случаях, а в аутопсийном материале - в 15 случаях. Варфарин был обнаружен как отдельно, так и в комбинации с лекарственными веществами и наркотическими средствами.
МЕТОД ПОДГОТОВКИ ТРУПНЫХ ТКАНЕЙ ДЛЯ ГХ-МС И ВЭЖХ-МС/МС АНАЛИЗА. ПРИМЕР ИЗ ПРАКТИКИ: ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАРФЕНТАНИЛА В ТРУПНЫХ ТКАНЯХ, ИЗМЕНЕННЫХ ГНИЕНИЕМ В БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЯХ - ПРОДУКТАХ ЛИЗИСА_
А. Л. Печников1, С. А. Савчук2,3 1Интернет-портал Sudmed_MS https://sudmed-ms.my1.ru 2ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва 3ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России, Москва В докладе представлен случай определения карфен-танила в трупных тканях, измененных гниением в биологических жидкостях. Ключевые слова: карфентанил, трупные ткани, лизис
Трупы троих мужчин (Ф., 26 лет, О., 28 лет, и П., 31 год) без видимых повреждений были найдены в квартире (Москва). Состояние трупов - выраженные гнилостные изменения. Рядом с трупами был найден пакет с белым порошком. По результатам экспертизы порошок содержал 0,04 г карфентанила.
От трупов были отобраны ткани печени (25 г) и почки (18 г) кровь (6 мл). Первое исследование показало отсутствие карфентанила во всех биологических объектах. Образцы были направлены на повторное исследование.
Методы: извлечение биологических жидкостей (продуктов лизиса) из образцов тканей. Образцы замораживали при -20°С в стеклянных чашках, закрытых крышками, выдерживали в течение ночи, после чего размораживали. Образующуюся в результате лизиса межклеточную и внутриклеточную жидкость со следами капиллярной крови (8-15 мл) собирали и анализировали.
Жидкость /жидкостная экстракция. К 5 мл биологических жидкостей (кровь, моча, продукты лизиса тканей) добавляли 10 мл дистиллированной воды, 0,5 мл насыщенного раствора NaOH, перемешивали, выдерживали 15 мин при комнатной температуре и экстрагировали 10 мл гексана. Полученный экстракт упаривали, добавляли 150 мкл ацетонитрила и анализировали методами ГХ-МС и ВЭЖХ-МС/МС. Карфенанил был обнаружен во всех исследуемых образцах.
SPE экстракция. Для сравнения биологические жидкости (кровь, моча, продукты лизиса тканей) готовили для анализа методом SPE на патронах Bond Elute Certify. Карфентанил был обнаружен во всех исследуемых образцах всеми методами диапазон содержаний 50-70 нг/мл. Для сравнения исследовали гомогенаты тканей. Навеску 5 г разбавляли водой, добавляли NaOH и экстрагировали гексаном, как описано для биологических жидкостей. При упаривании получали 300-400 мкл жира, который экстрагировали 3 мл 0.1Н HCL. В кислом извлечении устанавливали рН 8-9 и экстрагировали гексаном. Для сравнения гомогенаты готовили для анализа методом SPE
