CC BY
104
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 615.222.322.074:[547.94:582.675.1]
Г. И. Миназова (к.фарм.н., ст. лаб.)
Валидация методики количественного определения препарата аллапинина
Башкирский государственный медицинский университет, кафедра общей химии 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3; тел. (347) 2720222
G. I. Minazova
Validation of techniques of the quantitative definitions of Preparation allapanin
Bashkir State Medical University 5, Lenina Str, Ufa, 450000, Russia; ph. (347) 2720222
Разработан метод количественного определения препарата аллапинина. Рассмотрены валидаци-онные параметры методики. Установлено, что метод обладает хорошей воспроизводимостью. Приведены показатели (степень разделения пи-ков,стандартное отклонение площади пиков линейная зависимость).
Ключевые слова: алапинин; валидация; ВЭЖХ; стандартный образец.
The method of quantitative definition of preparation allapanin is developed. Parametres of the technique are considered. It is established that the method possesses good reproducibility. Indicators (degree of division of peaks, a standard deviation of the area of peaks, linear dependence) are resulted.
Key words: allapinin; validation; HELCh; standard sample.
В The United States Pharmacopeiu ХХ1Х (USP) (2005) для количественного определения отдается предпочтение методу ВЭЖХ, в этом случае обязательно использование стандартных образцов (в USP описано около 1400 стандартных образцов, в РФ — около 200) 1-3.
Важнейшим критерием оценки любой аналитической методики служит доказательство ее валидности, включающей взаимосвязанную систему характеристик — специфичность, пригодность хроматографической системы, линейность, правильность и воспроизводимость препарата 4'5.
Целью работы является изучение комплекса валидационных характеристик разработанной методики определения аллапинина.
Экспериментальная часть
Суть анализируемой методики определения препарата аллапинина состоит в следующем: определение лаппаконитина гидробромида в препарате аллапинин проводят методом нормально-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в изократическом режиме при комнатной температуре на приборе
Дата поступления 25.01.11
Shimadzu LC-20, оснащенном УФ-детектором с переменной длиной волны, установленной на 254 нм, на аналитической колонке, заполненной модифицированным силикагелем с привитыми аминными группами.
В качестве элюента используют смесь гек-сана с изопропиловым спиртом в соотношении 80:20. Количественный расчет проводят методом абсолютной калибровки, снимая последовательно хроматограммы рабочих и стандартных растворов. В качестве параметра хрома-тографического пика используют высоту пика. Определению действующего вещества не мешает присутствие в препарате примесей. Продолжительность анализа 20 мин.
Подготовка прибора и идентификация лаппаконитина. За 1 ч до анализа включают хроматограф, колонку перед началом работы промывают 200 мл смеси гексан—изопропило-вый спирт (50:50), а затем подвижной фазой (А). Устанавливают изократический режим элюирования примерно 20 мин. В хроматограф вводят 50 мкл стандартного раствора №1. Рассчитывают асимметрию (Т) основного пика на высоте 5% от основания по следующей формуле:
2а
где а — расстояние от фронта пика до его высоты, измеренное на высоте 5% от основания;
— ширина пика на высоте 5%.
Эффективность колонки определяют путем расчета числа теоретических тарелок по формуле
м — 5,54 • (О2
где Ь] — время удерживания;
0.5 — ширина пика на половине высоты (данные представлены в табл.1).
Относительное стандартное отклонение площади основного пика, рассчитанное из 5 определений, не должно превышать 0.5%.
В хроматограф вводят 10 мкл раствора стандартного образца (ГСО) №1. Хромато-грамма должна иметь один основной пик, время удерживания — 5,7 мин.
Определение содержания лаппаконитина.
В хроматограф последовательно вводят по 50 мкл раствора стандарта №1 и исследуемого раствора №2 не менее пяти раз и регистрируют хроматограммы. Измеряют высоты пиков лаппаконитина и вычисляют среднеарифметическое значение параллельных определений (табл. 2).
Содержание лаппаконитина в анализиуе-мом образце:
Г 1 Т Т
X % — ст х ст
С • к -V '
х ст х
где Сст, Сх — концентрации стандартного раствора № 1 и исследуемого №2, соответственно, мкг/мл;
Ьст — высота пика стандартного раствора №1 и исследуемого раствора №2, мм;
Уст — объем вводимого в инжектор стандартного раствора №1 и исследуемого раствора №2, соответственно, мкл.
Приготовление растворов модельных смесей.
1. Приготовление элюирующего раствора А. Элюент готовят из свежеперегнанного гек-сана и изопропилового спирта, смешивая в мерной колбе емкостью 1л 800 мл гексана и 200 мл изопропилового спирта. Раствор отфильтровывают через стеклянный фильтр. Элюирующий раствор перед употреблением дегазируют током гелия. Срок годности раствора 1 месяц.
2. Приготовление рабочего стандартного раствора лаппаконитина (стандарт №1). Около 0,0100 г лаппаконитина переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора элюирующим раствором до метки, до растворения навески.
3. Приготовление исследуемого раствора (раствор №2). Для приготовления основного исследуемого раствора аллапинина 0.0125 г
Таблица 1
Оценка пригодности хроматографической системы по лаппаконитину
Опыт Эффективность хроматографической колонки Лаппаконитин. Относительное стандартное отклонение площади пика, % Коэффициент асиметрии пика Степень разделения пиков
1 3879.2 2.60 1.40
2 3803.8 0.5 2.57 1.38
3 3890.1 2.55 1.41
4 3877.6 2.58 1.37
5 3866.8 2.58 1.42
Таблица 2
Оценка воспроизводимости методики
Значение концентрации, Х, % Выборка, п Х ср Стандартное отклонение, в Средняя выборки, Ах ср Табличное значение критерия Стьюдента, Р, f Доверительный интервал, Х ср + АХ ср Относительная погрешность, Е ср
94.5
93.8
94.1 5 94.10 0.25 0.22 2.01 94.10 + 0.22 0.6%
94.0
94.1
препарата помещают в мерную колбу емкостью 25 мл и добавляют до метки бидистиллирован-ную воду. Закрывают мерную колбу пробкой и встряхивают в течение 5—10 мин до полного растворения навески. Пипеткой на 2 мл отбирают 2 мл основного исследуемого раствора аллапинина и переносят в пробирку емкостью 10 мл. В ту же пробирку добавляют по 2 мл метилтретбутилового эфира и 0.1 N раствора КОН, и центрифугируют в течение 2 мин при вращении 5000 об/мин. После этого отбирают пипеткой 1.5 мл верхнего эфирного слоя, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и разбавляют до метки раствором А.
Срок годности рабочего исследуемого раствора №2 10 сут.
Метрологические характеристики рассчитывали по данным, полученным при анализе 5 образцов для уровня вероятности р=0.95, в соответствии с методикой, рекомендованной ГФ XI 4. Валидация проводилась в соответствии с характеристиками, рекомендованными в проекте ОФС «Валидация фармакопейных мето-
1
дов» 1.
Методика характеризуется хорошей разрешающей способностью (степень разделения пиков лаппаконитина не ниже 1) и воспроизводимостью — относительное стандартное отклонение площади пика ниже 0.65 (табл.2)
Линейная зависимость метода характеризуется способностью получения аналитических сигналов, прямо пропорциональных содержанию анализируемых веществ в испытуемом образце. Линейность исследовалась на модельных смесях (0.4—0.01 мг/мл) в виде зависимости площади пика от содержания анализируемых веществ в модельных смесях на хрома-тограмме испытуемого образца.
Линейная зависимость характеризуется коэффициентом корреляции r и уравнением регрессии
у=ах ,
где а - тангенс угла наклона;
х - значение по оси абцисс.
Коэффициент корреляции линейного регрессионного графика r для лаппаконитина составляет 0.99999 при у=0.000216х в уравнении регрессии. На основании полученных результатов можно утверждать, что соблюдается линейная зависимость между величиной площади пика и концентрацией субстанции в элюи-рующем растворе в интервале 0.48—0.0048 мг/мл.
По представленным параметрам, характеризующим воспроизводимость (величины стандартного отклонения, доверительный интервал), можно сделать заключение о хорошей воспроизводимости данного метода анализа.
Литература
1. Арзамасцев А. П., Садчикова Н. П., Харитонов Ю. Я. Валидация фармакопейных методов. // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств МЗ РФ, 2001.- №1.- С 28.
2. European Pharmacopeia 4 nied (2002).- London.
3. The United States Pharmacopeia XXIX (USP) (2005).
4. Государственная фармвкопея XI изд.- М.: Медицина.- №1.- 1988.- 336 с.
5. Шатц В. Д., Сахартова О. В. Высокоэффективная жидкостная хроматография.- Знание.-Рига.- 1998.- 380 с.
