CC BY
66
2. Meshcheryakova S.A., Kataev V.A., Fattakhova I.Ya. [et al.] Synthesis and antibacterial activity of acetanilides and acetylhydrazones of thietanylpyrimidine-2,4(1H,3H)dione series. Pharmaceutical Chemistry Journal, 2015, Vol. 49, №9, P. 28-31. (In Russ)
3. Fattakhova I. Ya., Meshcheryakova S.A., Kataev V.A. Synthesis of new N-phenylacetamide derivatives of thiethanylpyrimidine-2,4-(1H,3H)-dione. Bashkir chemical journal, 2014, Vol. 21, №>3, P. 33-36. (In Russ)
4. Mironov A.N., Bunatjan N.D. et al. Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv (Guidelines for preclinical trials of drugs). Vol. 1. Moscow, Grif i K, 2012, 944 p. (In Russ)
5. Meshcheryakova S.A., Kataev V.A. Synthesis of new thietanylpyrimidine and thietanylimidazole derivatives. Russian journal of Organic Chemistry, 2013, Vol. 49, №9, P. 1358-1360. (In Russ)
УДК 615.214.22: 543.544.5
© С.К. Ордабаева, К.К. Атырханова, А.О. Сопбекова, 2018
С.К. Ордабаева, К.К. Атырханова, А.О. Сопбекова УНИФИЦИРОВАННАЯ МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИРАЦЕТАМА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Южно-Казахстанская медицинская академия, г. Шымкент
В настоящее время в медицине широко применяется субстанция пирацетама и его лекарственные формы. Но унифицированной методики количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах на сегодняшний день нет.
Целью исследования явилась разработка унифицированной методики количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Учитывая свойства исследуемого препарата, неподвижной фазы и элюента, для количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах экспериментально подобрана подвижная фаза из метанола и воды (2:8). Валидирование результатов исследования показало специфичность, высокую воспроизводимость и точность разработанной методики при относительной ошибке ±1,53% для капсул пирацетама и ±0,98 % для иньекционного раствора пирацетама.
Таким образом, разработана достоверная унифицированная методика количественного определения пирацетама в лекарственных формах методом ВЭЖХ.
Ключевые слова: пирацетам, субстанция, лекарственная форма, высокоэффективная жидкостная хроматография, унифицирование, валидация.
S.K. Ordabayeva, K.K. Atyrkhanova, A.O. Sopbekova THE UNIFIED METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF PYRACETAM IN MEDICINAL FORMS BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
Currently pyracetam substance and its medicinal forms are widely used in medicine. But there is no unified method of quantitative determination of pyracetam in the substance and medicinal forms.
The aim of the research is to develop the unified method of quantitative determination of pyracetam in substance and dosage forms by high performance liquid chromatography (HPLC).
Taking into account the properties of the studied preparation, the stationary phase and the eluent, a mobile phase from methanol and water (2:8) was experimentally selected for the quantitative determination of pyracetam in the substance and dosage forms. Validation of the results of the study showed specificity, high reproducibility and accuracy of the developed procedure with a relative error of ±1.53% for capsules of pyracetam and ±0.98% for the injectable solution of pyracetam.
Thus, a reliable unified procedure for the quantitative determination of pyracetam in dosage forms by the HPLC method was developed.
Kew words: pyracetam, drug substance, dosage form, high performance liquid chromatography, unification, validation.
Негативное влияние экологического и психоэмоционального стрессов на большинство населения нашей планеты, особенно жителей больших городов, является актуальной проблемой современного общества. Доказано, что стресс не безвреден для организма человека, он является фактором риска многих сердечно-сосудистых заболеваний, а также оказывает негативное воздействие на нервную систему, в результате чего человек становится раздражительным, у него снижается работоспособность, ухудшается память и процессы мышления. В связи с этим ученые непрерывно занимаются поиском путей профилактики и коррекции отрицательного воздействия стресса на нервную систему.
Более 50 лет назад возникла концепция ноотропных средств, был синтезирован и испытан лекарственный препарат Пирацетам. Это дало мощный толчок к поиску и созданию иных веществ с подобным принципом действия, эти исследования продолжаются и по сей день [1-6].
В медицине широко применяется субстанция пирацетама и его лекарственные формы (пирацетама раствор для инъекции 20% 5 мл; капсулы пирацетам 0,4 г; таблетки луцетам (пирацетам) 400 мг).
На сегодняшний день отсутствует единая, унифицированная методика количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах.
В нормативных документах для количественного анализа пирацетама и его лекарственных форм рекомендуются метод Кьель-даля, методы безводной нейтрализации, гравиметрии, жидкостной хроматографии [7-12].
Вышеназванные методы имеют некоторые недостатки. Например, метод Кьельдаля очень трудоемкий, для выполнения которого затрачивается 3-4 часа времени. К тому же метод многостадийный, поэтому при выполнении могут быть потери, что сказывается на результатах анализа. Для проведения безводной нейтрализации нужен опытный аналитик. Кроме этого, в этом методе используются ядовитые, летучие вещества, такие как ледяная уксусная и хлорная кислоты, для работы необходимо специальное оборудование. Учитывая недостатки этих методов, разработка доступных, эффективных и экономически выгодных унифицированных методик для исследования данной группы препаратов является актуальной задачей.
Унификация аналитических методик приводит к совершенствованию и упрощению методов стандартизации лекарственных препаратов, формируется единый подход к анализу лекарств, уменьшается время анализа и количество используемых реактивов. Таким образом, унифицированные методики анализа способствуют повышению эффективности и качества лекарств.
Наиболее воспроизводимым и селективным, позволяющим определить количественное содержание активного компонента в лекарственных формах пирацетама является метод высокоэффективной жидкостной хро-матографий (ВЭЖХ).
Цель исследования - разработка унифицированной методики количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах методом ВЭЖХ.
Материал и методы
В работе были использованы: субстанция пирацетама (ФС-150430042, КНР); пира-цетам, капсулы 0,4 г (АНД РК 42-6002-13); пирацетам, раствор для иньекций 20% 5 мл. (АНД РК 42-6007-13). Вспомогательные вещества: кальция стеарат (ГФ РК т. 2, с. 243), магния карбонат основной (ГФ РК т. 2, с. 296). Реактивы и растворители: натрия ацетат тригидрат (ГФ РК т. 2, с. 336), кислота уксусная разведенная (ГФ РК т.1, с. 422), вода для инъекций (ГФ РК т. 2, с. 469), метанол («Merck», Германия). Реактивы и растворители квалификации «ч.д.а».
Хроматографические условия. Исследования проводились на жидкостном хромато-
графе Shimadzu LC Prominence (Япония); насос LC 20AD; дегазатор DGU-20A5r; термостат СТО 20А; УФ-детектор SPD-20A, измерения проводились при длине волны 210 нм; в работе использовалась колонка, заполненная обращенно-фазным сорбентом Eurospher 100-5 C18. 250^4,6 mm. Скорость подачи элюента: 1мл/мин; температура колонки: 25°C; обьем инъекции образца: 20 мкл.
Приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) пирацетама. Около 50 мг (точная навеска) РСО субстанции пираце-тама помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 20 мл подвижной фазы, встряхивают до растворения, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (раствор А).
3,0 мл полученного раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора подвижной фазой до метки, перемешивают и фильтруют (раствор Б). Раствор используют свежеприготовленным.
Методика анализа капсулы пирацетама 0,4 г. Около 25 мг (точная навеска) содержимого капсул переносят в мерную колбу емкостью 25 мл, добавляют 15 мл подвижной фазы и перемешивают до растворения образца. Раствор доводят до метки подвижной фазой, тщательно перемешивают и фильруют через нейлоновый фильтр (А).
3,0 мл раствора А отбирают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят подвижной фазой до метки, тщательно перемешивают (Б).
Полученный исследуемый раствор (Б) и раствор РСО пирацетама хроматографируют в указанных выше условиях и получают не менее 5 хроматограмм.
Методика анализа пирацетама, раствора для иньекций 20% 5 мл. Около 1 мл (точная навеска) иньекционного раствора пирацетама переносят в мерную колбу емкостью 200 мл, доводят подвижной фазой до метки и тщательно перемешивают (А).
3,0 мл раствора А отбирают в мерную колбу емкостью 100 мл и доводят подвижной фазой до метки, тщательно перемешивают (Б).
Полученный исследуемый раствор (Б) и раствор РСО пирацетама хроматографируют в указанных выше условиях, получая не менее 5 хроматограмм.
Анализ модельной смеси (пирацетам, капсулы 0,4 г) и раствора плацебо проводят аналогично капсулированному препарату. Конечная концентрация раствора составляет 30 мкг/мл.
Анализ модельной смеси (пирацетам, раствор для иньекции 20% 5 мл) и раствора
плацебо проводят аналогично инъекционному препарату. Конечная концентрация раствора составляет 30 мкг/мл.
Валидацию разработанной методики определения пирацетама проводили на основании ОФС ГФ РК «Валидация аналитических методик и испытаний», руководства по вали-дации биоаналитических методик Food and Drug Administration (FDA), а также «Руководства по экспертизе лекарственных средств» European Medicines Agency (EMA) [13,14].
Метрологические характеристики рассчитывали при анализе образцов субстанции пирацетама и его лекарственных форм (капсулы, инъекционные растворы) для уровня вероятности р=0,95 по следующим критериям: точность, воспроизводимость, специфичность, линейность, правильность и прецизионность.
Результаты и обсуждение Структурные свойства молекулы анализируемого вещества определяют характеристику ее удерживания на стационарной фазе. Анализируемое вещество с большой гидрофобной
частью (С-Н, С-С и неполярные атомные связи) удерживается дольше, потому что оно не взаимодействует с водной поверхностью. С другой стороны, анализируемые вещества с большими полярными частями в своей структуре (имеющие полярные группы - -ОН, -NH2, -COO или NH3) удерживаются меньше, так как они лучше связываются с водой.
Вышеназванные свойства анализируемого вещества учитывались при подборе подвижной фазы (элюента). В результате исследования влияния элюента различного состава на селективность методики нами для количественного определения пирацетама в субстанции и лекарственных формах экспериментально подобрана подвижная фаза, состоящая из метанола и воды в соотношениях 2:8 (по объему).
При скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин время удерживания (tR) стандартного раствора пирацетама составило 3,02±0,01 мин. На рис. 1 представлена хроматограмма субстанции пирацетама при выбранных условиях проведения хроматографического анализа.
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75
Рис. 1. Хроматограмма раствора РСО пирацетама ( C=30 мкг/мл)
Специфичность разработанной методики подтверждалась совпадением времени удерживания хроматографических пиков пирацетама в субстанции и ее лекарственных формах (3,02±0,01 мин). Для определения специфичности проводили анализ 5 образцов стандартного раствора пирацетама в диапазоне концентраций 15-45 мкг/мл. На хроматограммах стандартных образцов посторонних пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания пирацетама, не наблюдалось.
Линейность методики оценивалась по графику зависимости хроматографической площади от концентраций пирацетама в пробе: 10, 20, 30, 40, 50 мкг/мл. При статистической обработке линейной зависимости по уравнению у=Ьх+а коэффициент корреляции линейного регрессионного графика г для пи-
рацетама составляет 0,9998. На основании полученных результатов можно утверждать о соблюдении линейности (рис. 2, табл. 1 ).
хроматографических пиков от концентрации пирацетама
Таблица 1
Оценка линейной зависимости площадей хроматографических пиков от концентрации пирацетама
Исследуемое вещество С, мкг/мл Площадь хроматографического пика Метрологические характеристики (ГФ РК, т. 1, с. 100)
10.000 304832 SD= 6,052±0,007
20.000 622969 RSD=1,832
30.000 897478 Sq,, %= 1,78
40.000 1193290 r = 0,9998
50.000 1500531
Правильность и прецизионность. Проводили анализ 3-х образцов с прибавлением стандартного раствора пирацетама до получения концентраций: 15 мкг/мл, 30 мкг/мл, 45 мкг/мл. Каждый раствор хроматографировали 6 раз. Исследование проводили в течение 1-го
Как видно из табл. 2 и 3, относительное стандартное отклонение анализа составляет соответсвенно для последовательности № 1 от 1,1813 до 1,6697%, а для последовательности № 2 от 1,4370 до 1,8397% и не превышает допустимого стандартного отклонения, что под-
(intra-day) и 2-го дней (inter-day). Для полученных значений концентраций были рассчитаны величины стандартного отклонения (SD), относительного стандартного отклонения (RSD, %) и относительной погрешности (s, %), приведенные в табл. 2 и 3.
Таблица 2
Таблица 3
тверждает прецизионность и правильность разработанной методики.
Полученные величины относительного стандартного отклонения (прецизионность) и относительной погрешности (правильность), находящихся в пределах 1,24-1,73% для после
Правильность и прецизионность методики (intra-day). Последовательность № 1
Введено вещества, мкг/мл S(h) хр.пика Найдено вещества, мкг/мл SD,(n=6) RSD, % (n=6) s, %
(n=6) Z
455619 15,23
454423 15,19
15 447542 14,96 15,05 0,1778 1,1813 1,24
444251 14,85
444849 14,87
455021 15,21
860083 30,75
927693 31,01
30 935471 31,27 30,72 0,5071 0,5320 1,73
904956 30,25
866963 29,98
929787 31,08
134591 44,99
136057 45,48
45 135519 45,30 45,46 0,5692 1,2520 1,32
133903 44,76
137643 46,01
138331 46,24
П
завильность и прецизионность методики (inter-day). Последовательность № 2
Введено, мкг/мл S(h) хр.пика Найдено, мкг/мл SD,(n=6) RSD, % s, %
(n=6) Z (n=6)
445747 14,90
458611 15,33
15 441858 14,77 14,94 0,2540 1,7004 1,78
443354 14,82
457115 14,68
459508 15,18
877135 29,32
874442 29,23
30 928291 30,03 29,42 0,2217 0,5698 1,94
901367 30,13
865168 28,92
863672 28,87
133963 44,78
134113 44,83
45 136925 45,77 45,42 0,6527 1,4370 1,51
134352 44,91
138182 46,19
137762 46,05
довательности 1 и 1,51-1,94% для последовательности 2, соответствуют нормам (не более 2,00%).
Стабильность. Исследована стабильность стандартных растворов пирацетама на уровнях концентраций 15-45 мкг/мл, приготовленных для хроматографического анализа. Кратковременная стабильность была исследована для приготовленных проб в течение 24 ч при анализе на следующий день. Долговременная стабильность изучена при хромато-графировании исследуемых растворов в течение 14 дней при температуре 2 - 8 °С. Площадь хроматографического пика при повторных анализах не менялась более чем на 10%.
Были также проанализированы растворы плацебо лекарственных форм. Вспомогательные вещества, входящие в состав капсул и инъекционного раствора, не имеют хроматографи-ческих пиков в условиях хроматографирования.
Таким образом, валидирование результатов исследования показало специфичность,
При проведении многократных индивидуальных определений концентраций анализируемого препарата и его лекарственных форм наблюдалось достоверное совпадение результатов, что характеризует воспроизводимость аналитической методики. При этом относительная ошибка среднего результата по капсулам пирацетама составляет±1,53%, по раствору пирацетама для иньекций±0,98%, что позволяет рекомендовать разработанную унифицированную методику для количественного анализа препарата в лекарственных формах (табл. 4).
Таблица 4
высокую воспроизводимость и точность разработанной методики ВЭЖХ.
Выводы
Разработана достоверная унифицированная методика количественного определения пирацетама в лекарственных формах методом ВЭЖХ.
Оценка воспроизводимости разработанной методики
Найденное количество пирацетама Мет рологические характеристики(ГФ РК т.1, с.100)
n хср S Дхср Rf Хср±Дхср еср.,%
В капсулах, мг: 360.8, 370.9, 370.9, 400.9, 390.8, 420.9, 410.9, 430.8, 380.8 9 400,07 1,85 0,61 2,36 27,83±0,06 1,53
В иньекционном растворе, мг/мл: 190.8, 210.0, 200.8, 200.9, 200.7, 200.8, 200.7, 200.1, 200.8 9 200,62 0,40 1,96 2,36 30,80±0,08 0,98
Сведения об авторах статьи: Ордабаева Сауле Кутымовна - д.фарм.наук, профессор, заведующая кафедрой фармацевтической и токсикологической химии Южно-Казахстанской медицинской академии. Адрес: Казахстан, 160021, г. Шымкент, площадь Аль-Фараби, 1. Email: [email protected].
Атырханова Карлыгаш Касымхановна - магистрант кафедры фармацевтической и токсикологической химии ЮжноКазахстанской медицинской академии. Адрес: Казахстан, 160021, г. Шымкент, площадь Аль-Фараби, 1. Email: [email protected].
Сопбекова Анаркуль Онлабековна - к.фарм.наук, и.о.профессора кафедры фармацевтической и токсикологической химии Южно-Казахстанской медицинской академии. Адрес: Казахстан, 160021, г. Шымкент, площадь Аль-Фараби, 1. Email: [email protected].
ЛИТЕРАТУРА
1. Flicker, L. Piracetam for dementia or cognitive impairment / Flicker, L; Grimley Evans, G. // The Cochrane database of systematic reviews. - 2001 (2): CD001011. doi:10.1002/14651858.CD001011. PMID 11405971
2. Müller, WE. Piracetam: novelty in a unique mode of action / Müller, WE; Eckert, GP; Eckert, A // Pharmacopsychiatry. - 2014. - Vol. 32 Suppl 1. - P. 2-9. doi:10.1055/s-2007-979230. PMID 10338102
3. Nootropil // NetDoctor.co.uk. 8 July 2004. Retrieved 21 September 2009.
4. Nootropil® // Arzneimittel-Kompendium der Schweiz. 2013-09-12. Retrieved 2013-10-27.
5. Piracetam [online]. Available from URL: http://www.piracetam.com
6. Tacconi, MT. Piracetam: physiological disposition and mechanism of action / Tacconi, MT; Wurtman, RJ // Advances in neurology. -
2012. - Vol. 43: 675-85. PMID 3946121
7. Государственная фармакопея Республики Казахстан. - Алматы: Издательский дом «Жибек жолы». - 2008. - Т. 1. - 592 с.
8. Государственная фармакопея Республики Казахстан. - Алматы: Издательский дом «Жибек жолы». - 2009. - Т. 2. - С.423-424.
9. The European Pharmacopeia, 7.0, Vol. 1, Strasbourg: Council Of Europe: EDQM. - 2008. - Р.2697-2698.
10. The British Pharmacopoeia (BP 2016). - London The Stationery Office. - 2016. - Р. 4776-4783.
11. АНД РК 42-6002-13. - Пирацетам, капсулы 0,4 г. - ОАО «Борисовский завод медицских препаратов», Республика Беларусь. -
2013. - 9 с.
12. АНД РК 42-6007-13 Пирацетам, раствор для иньекций 20% 5 мл - ОАО «Борисовский завод медицских препаратов», Республика Беларусь. - 2013 г. -13 с.
13. Аладышева Ж.И. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик / Ж.И. Аладышева, В.В. Беляев, В.В. Беляев, В.В. Береговых // Фармация. - 2008. - № 7. - С. 9-14.
14. Государственная фармакопея Республики Казахстан. - Алматы: Издательский дом «Жибек жолы». - 2008. - Т. 1. - 592 с.
15. Эпштейн, Н.А. Оценка пригодности (вадидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т. 1, № 4. - С.40-55.
16. Эпштейн, Н.А. Оценка пригодности (вадидация) ВЭЖХ методик в фармацевтическом анализе (обзор) / Н.А. Эпштейн // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. - Т. 2, № 9. - С.82-86.
REFERENCES
1. Flicker, L; Grimley Evans, G (2001). Piracetam for dementia or cognitive impairment. The Cochrane database of systematic reviews (2): CD001011. doi:10.1002/14651858.CD001011. PMID 11405971 (in English)
2. Müller, WE; Eckert, GP; Eckert, A (2014). Piracetam: novelty in a unique mode of action. Pharmacopsychiatry. 32 Suppl 1: 2-9. doi:10.1055/s-2007-979230. PMID 10338102(in English)
3. Nootropil. NetDoctor.co.uk. 8 July 2004. Retrieved 21 September 2009. (in English)
4. Nootropil. Arzneimittel-Kompendium der Schweiz. 2013-09-12. Retrieved 2013-10-27. (in Germany)
5. Piracetam [online]. Available from URL: http://www.piracetam.com (in English)
6. Tacconi, MT; Wurtman, RJ (2012). Piracetam: physiological disposition and mechanism of action. Advances in neurology. 43: 675-85. PMID 3946121
7. Gosudarstvennaya farmakopeya Respubliki Kazakhstan (State Pharmacopoeia of the Republic of Kazakhstan). Almaty, Izdatel'skij dom «Zhibek zholy», 2008, vol. 1, 592 s.
8. Gosudarstvennaya farmakopeya Respubliki Kazakhstan (State Pharmacopoeia of the Republic of Kazakhstan). Almaty, Izdatel'skij dom «Zhibek zholy», 2008, vol. 2, p. 423-424.
9. The European Pharmacopeia, 7.0, Vol. 1, Strasbourg: Council Of Europe: EDQM, 2008, P.2697-2698.
10. The British Pharmacopoeia (BP 2016). London The Stationery Office, 2016, P. 4776-4783.
11. AND RK 42-6002-13. - Piratsetam, kapsuly 0,4 g. OAO «Borisovskij zavod meditsskikh preparatov», Respublika Belarus', 2013, 9 p.
12. AND RK 42-6007-13 Piratsetam, rastvor dlya in'ektsij 20% 5 ml .OAO «Borisovskij zavod meditsskikh preparatov», Respublika Belarus'. 2013, 13 s.
13. Aladysheva Zh.I., Belyaev V.V., Beregovykh V.V. Practical aspects of operations to validate analytical procedures. Pharmacy, 2008, № 7, p. 9-14.
14. Epstein, N. Ah. Assessment of suitability (validation) of HPLC techniques in pharmaceutical analysis. Chemical-pharmaceutical journal, 2004, Vol. 1, №> 4, p. 40-55.
