CC BY
17Journal of Siberian Federal University. Chemistry 3 (2012 5) 331-340 УДК 615.543.544.5:547.562.4
Разработка и валидация методики количественного определения медиборола в масляном растворе
В.А. Шелеховаа, Е.А. Краснов*3, А.В. Пустовойтов6, Н.М. Мордвинова6, О.В. Старкова8
а Сибирский государственный медицинский университет
Минздравсоцразвития РФ Россия 634050, Томск, ул. Московский тракт, 2 б ООО «Сибтест» Национального исследовательского Томского политехнического университета Россия 634004, Томск, пр. Ленина, 43а1
Received 10.09.2012, received in revised form 17.09.2012, accepted 24.09.2012
В настоящей статье предложена методика определения содержания медиборола в масляном растворе с использованием ВЭЖХ. Предлагаемая методика характеризуется высокой эффективностью, хорошей разрешающей способностью и специфичностью. Правильность находится в пределах от 98,44 до 102,05 %. Методика показала линейный характер зависимости истинного от найденного значения содержания медиборола в диапазоне концентраций 16,00 - 24,00 мг/мл (R2=0,99964). Относительная погрешность определения медиборола составляет от 0,81 до 0,94 %. Параметры системы практически не подвержены влиянию небольших изменений в хроматографических условиях, кроме времени удерживания и коэффициента емкости пика медиборола.
Ключевые слова: медиборол, масляный раствор, ВЭЖХ, валидация.
Введение
Нарушение функций головного мозга продолжает оставаться острой медико-социальной проблемой современного общества. В основе значительного числа церебральных заболеваний лежат факторы сосудистого генеза, а сами заболевания сопровождаются утратой работоспособности, инвалидизацией и летальным исходом. Медленно прогрессирующая недостаточность мозгового кровообращения с развитием локальных изменений ткани мозга приводит
* Corresponding author E-mail address: [email protected]
1 © Siberian Federal University. All rights reserved
к нарушениям соотношения между кровоснабжением и потребностями мозга в кислороде и энергетическому некрозу нервных клеток. При лечении больных с нарушениями мозгового кровообращения, кроме традиционного способа коррекции вазоактивными веществами в комплексе с фибринолитическими и антиагрегантными средствами, целесообразно использовать нейропротекторные средства, обеспечивающие метаболическую защиту головного мозга [1, 2]. К числу последних относится инновационное фармакологически активное вещество - 4-метил-2,6-диизоборнилфенол (медиборол) [3]. Данное соединение обладает липофильными свойствами [4], что обусловливает целесообразность создания наряду с таблетированной лекарственной формой медиборола также инъекционного лекарственного средства на основе растительного масла и разработку параметров стандартизации.
Метод прямой спектрофотометрии по максимуму поглощения основного вещества не позволяет определять медиборол в присутствии компонентов масла, так как поглощения данных веществ в ультрафиолетовой области спектра существенным образом перекрываются. Выделение медиборола из масляного раствора - сложный и трудоемкий процесс. Тогда как хроматография, объединяющая в одном эксперименте разделение и анализ, лишена указанного недостатка. Поэтому цель данного исследования - разработка и валидация методики количественного определения медиборола в масляном растворе с использованием метода ВЭЖХ.
Материалы и методы
Для получения масляного раствора медиборола применяли рафинированные масла персиковое (ТПК «Ароматы жизни», Россия) и оливковое («Trasimeno» S.p.A, Италия). Плотность 2 %-го масляного раствора медиборола, определенная с помощью пикнометра [5], составляет 0,917 и 0,920 г/см3 для растворов в оливковом и персиковом маслах соответственно. В работе использовали также образцы примесей п-крезола (Fluka, Германия) и 2-изоборнил-4-метилфенола, рабочий стандартный образец медиборола, синтезированные в Институте химии Коми НЦ УрО РАН.
Определение медиборола в масляном растворе проводили методом обращенно-фазной ВЭЖХ, при этом использовали высокоэффективный жидкостной хроматограф Милихром А-02 (Россия), снабженный УФ-детектором и колонкой ProntoSIL-120-5-C-18 AQ DB-2003 (размер 2^7,5 мм, 5 мкм). Температура термостата колонки - 40 °С, скорость потока 100 мкл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл. УФ-детектирование осуществляли при аналитической длине волны 282 нм, которая соответствует максимуму поглощения медиборола в подвижной фазе. Подвижная фаза: изопропиловый спирт и вода. Растворители, использованные в работе, были ОСЧ-чистоты.
Приготовление исследуемого раствора: около 0,05 г (точная навеска) масляного раствора медиборола помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл изопропилового спирта, перемешивают до полного растворения, добавляют 2,5 мл воды дистиллированной, доводят изопропиловым спиртом до метки и перемешивают.
Приготовление раствора РСО медиборола: около 0,05 г (точная навеска) медиборола помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл изопропилового спирта, перемешивают до полного растворения и доводят изопропиловым спиртом до метки (раствор А).
1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл изопропилового спирта и 2,5 мл воды дистилнированной, доводят изопропиловым спиртом до метки и перемешивают.
Содержание медиборола (Х) в мг в 1 мл масляного раствора вычисляли по формуле
„ _ 5-ао-1-25-р-1000 _ 5-а0-р-20
л — --------------- — ---------,
5о*я*50*25 5о'^
где . - площада пика медиборола в исследуемом растворе; ^ - площадь пика медиборола в растворе РСО; а - масса навески масляного раствора медиборола, г; а0 - масса навески РСО медиборола, г; р - плотность 2 % масляного раствора медиборола, г/мл.
Валидацию методики проводили согласно официальным рекомендациям [6-8]. Для подтверждения специфичности готовили растворы медиборола, возможных примесей медиборола (п-крезола и О-изоборнил-4 -метилфенола) и растворы-плацебо масла персикового и оливкового. Расчет параметров хроматографической системы проводили для пиков медиборола, полученных при анализе 2 %-го масляного раствора медиборола. Определение линейности и правильности методики выпосияли на пяти ур овнях сонцентраций от аеоретического значе ния содержания медиборола в масляном растворе. Иссеедуемые растаоры готовили по выше описанной методике из модельных масляных растворов медиборола, имеющих следующие концентрации основного вещества (%): 1,6, 1,8, 2,0, 2,2 и 2,4. Повторяемость и промежуточная прецизионность устанавливсли на 2 %-ном масляном рестворе медиборола по шеети определениям на одном и том же приборе в разные дни. Робастность исследовали путем анализа колебаний в хроматографических условиях (скорость потока и температура).
Результаты и их обсуждение
При разработке методики необходимо было подобрать оптимальные хроматографические условия для эффективного разделения веществ и полного выхода из колонки компонентов масла. При выборе состава подвижной фазы были исследованы смеси различных растворителей (изопропиловый спирт, метанол, ацетонитрил) с водой в различных соотношениях и при разном режиме элюирования. Наилучшие результаты были достигнуты при использовании в качестве подвижной фазы (ПФ) воды (А %) и изопропилового спирта (Б %) в различных соотношениях и хроматографическом режиме, представленном в табл. 1.
Валидацию разработанной методики осуществляли по следующим параметрам: специфичность, линейность, правильность, внутренняя (повторяемость) и промежуточная прецизионность, пригодность хроматографической системы и робастность.
Таблица 1. Хроматографический режим
Время, мин ПФ А, % ПФ Б, % Режим
0-10 60^50 40^50 Градиентный
10-20 0 Т 5 75^90 Градиентный
20-30 0 100 Изократический
Рис. 1. ВЭЖХ-хроматограмма 2 %-го раствора медиборола на персиковом масле
■Шщч—,-,—,-,—,—,--,—,—,—,—,--,—,—,—.—,--,—,—,—,----,—,—,—,—,—.—,—.—
1 : 1-1 ‘ С Т 9 Р 10 11 11 и 14 1* 16 и 1В 1» Я Ц И И И Я Ы 37 В щи_
Рис. 2. ВЭЖХ-хроматограмма масла персикового
Специфичность методики представляет собой способность определять анализируемое вещество в присутствии других компонентов лекарственной формы и возможных примесей. Для подтверждения специфичности получены хроматограммы следующих растворов: медиборола, возможных примесей медиборола (п-крезола и 2-изоборнил-4-метилфенола), масла персикового и оливкового. Время удерживания пика медиборола составило 18,39 мин, п-крезола и 2-изоборнил-4-метилфенола - 3,19 и 14,48 мин соответственно, что свидетельствует о высокой специфичности методики. На хроматограммах масел персикового и оливкового отсутствуют пики, мешающие определению медиборола (рис. 1-3), что позволяет использовать данную
- 334 -
______________________________________________~А_
:і:ии і------------------------,-,-,---------,-,-,-,-,-,-,-,-,-
і : і і It f і о to її і: и и і* it ґ і* it a> :i к м 5* У > !* 5*
Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограмма масла оливкового
Таблица 2. Пригодность хроматографической системы
Параметр хроматографической системы Полученное среднее значение параметра Рекомендации FDA «Validation of Chromatographic Methods» [6]
Коэффициент емкости (к’) 10,15 ± 0,01 k’>2
Коэффициент асимметрии (Т) 0,80 ± 0,03 T<2
Критерий разделения 4,47 ± 0,29 Rs>2
Эффективность хроматографической колонки (^ 20429 ± 1446 N>2000
Относительное стандартное отклонение найденного значения содержания медиборола в 1 мл масляного раствора (RSD) 0,37 % RSD<1 %
методику для определения медиборола в растворах не только на персиковом масле, но и на оливковом. Остальные параметры валидации были рассмотрены на растворе медиборола на персиковом масле.
Пригодность системы характеризует надежность анализа в заданных условиях его проведения. Хроматографические параметры (табл. 2) находятся в пределах, рекомендуемых в [6]. Это указывает на то, что полученные результаты высоконадёжны.
Линейность методики характеризует наличие линейной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Из формулы, приведенной выше, видно, что содержание медиборола (Х) в масляном растворе прямо пропорционально величине сигнала. Поэтому под линейностью можно понимать возможность методики давать расчетные значения концентрации, прямо пропорциональные истинной концентрации анализируемого вещества. Такое определение линейности, которое используется в настоящей работе, полностью соответствует официальным рекомендациям [6-8].
ш -----------1-----1-----1-----'-----1-----1----1-----1-----1-----'
а 16 1В 20 22 24
Истинное значение содержания медиборола в 1 мл масляного раствора, мг
Рис. 4. Зависимость найденного от истинного значения концентрации медиборола в растворе персикового масла
Коэффициент корреляции равен 0,99964, что соответствует требованиям [6]. Уравнение зависимости истинного от найденного значения концентрации медиборола в растворе имеет вид у=1,0065*х-0,094. Поэтому интервал 1,6 - 2,4 % можно определить как аналитическую область методики. Линейность методики количественного определения содержания медиборола в масляных растворах представлена на рис. 4.
Повторяемость (внутренняя прецизионность) указывает на сходимость полученных значений концентраций анализируемого вещества. Как видно из табл. 3, результаты статистически эквивалентны.
Промежуточная прецизионность отражает внутрилабораторную изменчивость. Полученные результаты показывают, что методика воспроизводима, так как относительная погрешность определения медиборола в первый и второй дни анализа находится в диапазоне от 0,81 до 0,94 % (табл. 3).
Правильность характеризует близость получаемых с помощью данной методики результатов к истинному значению на всем диапазоне аналитической области методики. Критерием приемлемой правильности является процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100 %, и его средняя величина должна находиться в пределах от 95 до 100 %. Как видно из табл. 4, данный параметр находится в области от 98,44 до 102,05 %.
Оценку устойчивости аналитической системы (робастности) проводили при небольшом изменении температуры и скорости потока (табл. 5). Влияние параметров оценивали с помощью следующих характеристик: время удерживания, разрешение, фактор асимметрии, коэффициент емкости, число теоретических тарелок, площадь пика и полученное значение содержания основного вещества в масляном растворе. Снижение температуры незначительно
№ 1 -й день определения (03.11.2011) 2-й день определения (18.01.2012)
Масс а навескз 2 % масляног о р а ство р а медиборола, г Содержание медиборола в 1 мл масляного раствор мг Масса навески 2 % масляного раств ора медиборола, г Содержание медиборола в 1 мл 1масляного раствора, мг
1 0,0533 19,99 0,0502 20,17
2 0,0472 20,1Р 0,0499 20,25
3 0,0406 1 9,86 0,0478 19,89
4 0,34И9 19,73 0,0481 19,78
5 0,0470 20,00 0,0512 20,01
6 0,0483 20,13 0,0497 20,13
Метрологическая характеристика Метрологическая характеристика
X = 19,97 XI2 = 0,023817 S = 0,154326 Sx = 0,063004 Р = 0,95 Т(Р,0 = 2,57 ДХ = 0,16 X ± ДХ = 19,97±0,16 X = 0,81 % X = 20,04 X2 =0,032016667 Б = 0,178932017 Sx = 0,073048(59 Р = 0,95 Т(Р,0 = 2,57 ДХ = 0,1 9 X ± ДХ = 20,04±0,19 X = 0,94 %
Таблица 4. Оценка правильноети методики определения содержания медиборола в масляном растворе
Ожидаемое содержание медиборола в 1 мл масляного раствора, мг Полученное содержание медиборола в 1 мл масляного раствора, мг Процент восстановления, % Средний процент восстановления, % (п=3) Относительное стандартное отклонение, % (RSD)
16,16 101,00
16,00 15,75 98,44 99,58 0,76
15,89 99,31
18,22 101,22
18,00 18,00 100,00 100,61 0,35
18,11 100,61
19,89 99,45
20,00 20,01 100,05 100,12 0,41
20,17 100,85
22,45 102,05
22,00 22,00 100,00 100,62 0,71
21,96 99,82
23,70 98,75
24,00 24,17 100,71 99,90 0,59
24,06 100,25
Средний процент
восстановления
(п=15) = 100,17 %
Условия хроматогра- фирования Время удерживания, мин Коэффициент емкости Коэффициент асимметрии Разрешение пиков Площадь пиков Содержание медиборола в 1 мл масляного раствора, мг Среднее значение содержания медиборола в 1 мл масляного раствора, мг
Предлагаемый метод 18,39 10,15 0,83 4,40 5,601 19,89 20,02
18,40 10,15 0,77 4,40 6,035 20,01
18,36 10,13 0,77 4,32 5,963 20,17
Температура колонки 35 °С, скорость потока 100 мкл/мин 18,47 10,20 0,73 4,80 5,996 20,16 20,06
18,51 10,22 0,74 4,97 5,775 20,07
18,52 10,23 0,69 4,73 5,709 19,95
Температура колонки 40 °С, скорость потока 90 мкл/мин 17,51 9,62 0,85 5,68 5,718 19,64 20,12
17,51 9,62 0,90 4,95 6,227 19,79
17,53 9,63 0,85 4,96 5,832 20,93
повысило время удерживания и коэффициент емкости пика медиборола, тогда как снижение скорости потока уменьшает эти параметры примерно на одну единицу. Остальные критерии практически не подвержены влиянию небольших изменений в хроматографических условиях.
Таким образом, предложенная методика позволяет определить содержание медиборола в масляных растворах с малой погрешностью (0,810,94 %). Другими достоинствами методики являются простота и возможность определения медиборола без предварительного отделения компонентов масла.
Выводы
1. Разработана методика количественного определения медиборола в масляном растворе с использованием ВЭЖХ.
2. Установлены основные параметры валидации для разработанной методики. Предлагаемая методика характеризуется высокой эффективностью, хорошей разрешающей способностью и специфичностью. Правильность находится в пределах от 98,44 до 102,05 %. Методика показала линейный характер зависимости истинного от найденного значения содержания медибо-рола в диапазоне концентраций 16,00 - 24,00 мг/мл (R2=0,99964). Относительная погрешность определения медиборола составляет от 0,81 до 0,94 % в разные дни измерения. Параметры системы практически не подвержены влиянию небольших изменений в хроматографических условиях, кроме времени удерживания и коэффициента емкости пика медиборола.
Список литературы
1. Воробьев А.Н. Разработка и фармакотехнологические исследования таблеток цинна-ризина с кислотой янтарной: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Курск, 2009. 23 с.
2. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М.: Медицина, 2001. 328 с.
3. Иванов И.С. Нейропротекторная и антитромбогенная активность 4-метил-2,6-диизоборнилфенола: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Томск, 2009. 23 с.
4. Назмутдинова Е.Е. Физико-химические свойства нового пространственнозатрудненного фенола и разработка параметров стандартизации его таблетированной формы: автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Самара, 2011. 23 с.
5. Государственная фармакопея Российской Федерации. Часть 1. 12-е изд. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2007. 704 с.
6. FDA (1994) Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer Guidance: Validation of Chromatographic Methods, Rockville, MD [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www. fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM134409. pdf - Загл. с экрана.
7. ICH (1995) International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline for Industry. Text on Validation of Analytical Procedures (Q2A) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM073381.pdf /. - Загл. с экрана.
8. ICH (1996) International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Guideline for Industry. Validation of Analytical Procedures: Methodology (Q2B) [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.fda.gov/
downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM073384.pdf /. - Загл. с экрана.
Development and Validation of Method of Quantifying Mediborol in Oil Solution
Vera A. Shelekhovaa, Efim A. Krasnova, Andrew V. Pustovoitovb, Nina M. Mordvinovab and Oksana V. Starkovaa
a Sibirian State Medical University 2 Moscowski Trakt Str., Tomsk, Russia 634050 b LLC «Sibtest» of National Research Tomsk Polytechnic University
43a Lenin, Tomsk, 634004 Russia
The present study suggests the method for determining the content of mediborol in oil solution using HPLC. The proposed method is characterized by high efficiency, good resolution and specificity. The accuracy is in the range of 98,44 to 102,05 %. The method showed that the dependence of real content from observed content of mediborol in the concentration range16,00 - 24,00 mg/ml is linear with correlation coefficients of R2 = 0,99964. The relative error of mediborol ranges from 0,81 to 0,94 %. The parameters of the system were practically subjected to the influence of small changes in chromatographic conditions, except for the retention time and capacity factor of mediborol’s peak.
Keywords: mediborol, oil solution, HPLC, validation.
