CC BY
293
УДК 615.322.014.2.073:543.544.5
Г. И. Миназова (к.фарм.н., ст. лаб.)
Высокоэффективная жидкостная хроматография в анализе природного сырья
Башкирский государственный медицинский университет, кафедра общей химии 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 5; тел. (347) 2720222
G. I. Minazova
Highly effective liquid chromatography in the analysis of natural raw materials
Bashkir State Medical University 5, Lenina str, Ufa, 450000, Russia; ph. (347)2720222
Рассмотрен метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в анализе природного сырья и лекарственных форм, полученных из него. Приведен набор экспериментальных данных, необходимых для задания режима ВЭЖХ-анализа. Исследована пробоподготовка при проведении ВЭЖХ-анализа. Приведены примеры ВЭЖХ-анализа лекарственных препаратов из природного сырья.
Ключевые слова: анализ; валидация; ВЭЖХ; проба; элюент.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) предполагает разделение компонентов анализируемых образцов в потоке подвижной фазы (элюента, характеристиками которого являются состав, ионная сила, рН и другие показатели) за счет неодинаковых взаимодействий с сорбентами (обычно поверхностно-модифицированные силикагели).
Набор экспериментальных параметров, необходимых для задания режима ВЭЖХ-ана-лиза, включает:
— размеры хроматографической колонки и тип используемого в ней сорбента (гидрофильный или гидрофобный, что определяет так называемые прямо- или обращенно-фаз-ный режимы разделения). Указание размера частиц сорбента и фирмы-изготовителя считается обязательным;
— состав элюента;
— характер элюирования (изократическое или градиентное);
— тип детектора. В ВЭЖХ не существует столь же универсальных по отношению к ве-
Дата поступления 19.10.10
Method HELCh in the analysis of natural raw materials and received from it the medicinal forms is considered. The set of the experimental data necessary for the HELCh analysis is resulted. Tests preparation at the HELCh analysis is investigated. The HELCh analysis of medicinal preparation from natural raw materials is resulted.
Kew words: HELCh analysis; eluent; test.
ществам любой химической природы детекторов, как в газовой промышленности, но чаще всего используемыми являются различные модификации спектрофотометров с рабочими диапазонами длин волн от 1190 до 700—900 нм.
Уф-спектрометр, в отличие от наиболее распространенных газохроматографических детекторов (потоковые, деструктивные), относится к типу концентрационных недеструктивных детекторов. Это означает, что площади пиков определяемых соединений зависят не только от количества вещества в пробе и природы хромофоров в молекуле, но и от скорости потока элюента (увеличиваются при уменьшении распада). Такая особенность предъявляет повышенные требования к качеству и надежности оборудования.
Формы предоставления параметров удерживания в ВЭЖХ не отличаются от используемых в газовой хроматографии. Относительно часто встречаются их выражения в виде коэффициентов емкости К (capacity coefficients) или их логарифмов (Lg K):
K=tk'|t0=(tk-t0)|t0=(tk|t0)-1.
Индексы удерживания (ИУ) в обращенно-фазовой ВЭЖХ относятся к параметрам, обладающим наибольшей межлабораторной воспроизводимостью. Соответствующие значения ИУ определены для многих компонентов
эфирных масел и экстрактивных веществ рас" 7
тений .
Начато формирование баз данных по ИУ флавонойдов, кумаринов 7.
При описании методики хроматографи-ческого анализа лекарственного препарата рекомендовано указывать тесты для оценки пригодности хроматографической системы, которые включают следующие параметры: разрешение пиков (ИБ), эффективность колонки (К), факторы симметрии (АБ), относительное стандартное отклонение (КБВ,%) для повторных вводов пробы в хроматограф, количество повторных вводов должно быть не менее 3; требование к воспроизводимости ИБЭ — не более 2%.
Кроме того, должна быть проведена вали-дация (оценка пригодности) метода по следующим показателем: точность, специфичность, предел обнаружения, прецизионность, предел
количественного определения линейности, ди-12
апазон применения .
Метод ВЭЖХ широко применяется в анализе лекарственного растительного сырья и биологически активных веществ, выделенных
1_5 7 О 11
из него .
Особую роль при анализе методом ВЭЖХ играет подготовка проб. Многие эликсиры и бальзамы содержат в своем составе мед, сахар и сахарный колер. Это ограничивает возможности прямого дозирования таких препаратов в хроматограф, так как присутствие, например, сахаров и компонентов воска (из меда) при анализе методом ВЭЖХ приводит к быстрому выходу из строя предколонки и колонки. Дозирование препаратов, содержащих сахарный колер, не только ускоряет старение колонки, но и нередко делает невозможной интерпретацию результатов в анализе при УФ-детектировании. Это обусловлено УФ-спект-ральными свойствами компонентов сахарного колера, которые могут маскировать целевые компоненты образцов. По этим причинам традиционно используют методы подготовки проб жидких спиртосодержащих фитопрепаратов, направленных на устранение мешающих примесей 9. При этом часто одновременно решают и другую важную задачу, а именно превращение всех флавоноидных гликозидов в аглико-ны при кислотном гидролизе препарата, что значительно упрощает интерпретацию резуль-
татов анализа. Так, при стандартизации эликсиров «Алтайский» 5 и «Эвалар» 8 для того, чтобы исключить маскирующее влияние сахарного колера, анализируемые образцы подвергали кислотному гидролизу с помощью хлористоводородной кислоты с последующей экстракцией полученного гидролизата диэтиловым эфиром. Схема подготовки проб в этом случае включала в себя кислотный гидролиз препарата, исчерпывающую эфирную экстракцию, промывку эфирного экстракта водой для удаления кислоты и компонентов колера, удаление из эфирного экстракта остатков воды с помощью сульфата натрия, полную отгонку эфира и растворение сухого остатка в этиловом спирте. Было показано 4, что после кислотного гидролиза соединения флавоноидной природы (кемпферол, кверцетин, апегинин) могут быть количественно переведены в эфирный раствор при 4-кратной экстракции эфиром. Это было подтверждено данными ВЭЖХ по результатам анализа эликсиров после кислотного гидролиза и их эфирных экстрактов. На основе этих данных были разработаны способы подготовки проб, используемые в аналитических методах контроля подлинности и качества препаратов. включенных в ВФС 42-2598-95 и ВФС 42-3164-98.
При разработке проекта ФС «Эликсир Алтайский» методика подготовки пробы для определения флавоноидов была усовершенствована, так как в результате предварительного исследования было установлено, что в процессе гидролиза эликсиров и последующей эфирной экстракции не удается полностью избавиться от мешающего влияния компонентов сахарного колера и меда. Поэтому в раздел «Количественное определение» проект ФС была введена модифицированная методика подготовки проб, включающая полную отгонку спирта из образцов эликсира, что практически исключает переход компонентов колера из водного слоя в эфирный на стадии экстракции 3. Стадия промывки эфирного экстракта водой в этом случае отсутствует. Удаление кислоты происходит на стадии, предшествующей экстракции эфиром, нейтрализацией с помощью раствора гидроксида калия. Таким образом, предложенная схема подготовки проб состоит из последовательных операции, включающих полную отгонку спирта из эликсира, кислотный гидролиз, нейтрализации до рН=6.0 и последующую эфирную экстракцию.
Метод ВЭЖХ рекомендован в тестах на подлинность эликсира «Алтайский» ВЭЖХ флавоноидов, бальзам «Первопрестольный»
ВЭЖХ флавоноидов, эликсир «Кедровит» ВЭЖХ танина, эликсир «Эвалар» ВЭЖХ циа-нидина и флавоноидов.
Методом ВЭЖХ количественно определяют в бальзаме «Московия» содержание кверце-тина после твердофазной экстракции, в эликсире «Алтайском» суммарное содержание фла-воноидов после гидролиза и экстракции, в эликсире «Кедровит» содержание танина после твердофазной экстракции, в эликсире «Эва-лар» суммарное содержание флавоноидов пос-
7
ле гидролиза и экстракции .
Методом ВЭЖХ в ходе проведенных экспериментальных исследований осуществлена стандартизация и нормирование основных показателей качества субстанции бетулинола 1 .
Методом ВЭЖХ количественно определяют содержание фенольных соединений в ле-
2
карственном сырье тысячелистника .
Для количественного определения и установления примесей в стандартном образце лап-паконитина использован метод ВЭЖХ. Содержание основного действующего вещества (лаппаконитина) составляет 97% 6 11. Изучен комплекс валидационных характеристик разработанной методики определения лаппако-нитина 10.
Литература
1. Абышеев А. 3, Журкович А. В., Ачаев Э. М. // Хим. фарм. ж.- 2006.- Т. 40, №1.- С.49.
2. Бенетис Р., Радуменс И., Якштас В. и др. // Хим. фарм. ж. - 2008.- Т. 42, №3.- С.51.
3. Зенкевич И. Г., Пименов А. И., Макаров В. Г., Северцева О. В. Количественные определения содержания флавоноидов в комплексных жидких спиртосодержащих препаратах // Материалы VII Российского национального конгресса «Человек и лекарство».- М., 2000.- С.610
4. Краснов К. А., Тюкавкина Н. А., Пименов А. И. Аналитические методы исследования и стандартиза-
ции эликсиров / Эликсиры.— СПб., 1999.— С.58.
5. Макаров В. Г., Тюкавкина Н. А., Краснов К. А., Андреев А. С. / Тез.докл. 2-го научного конгресса «Традиционная медицина: теоретические и практические аспекты».— Чебоксары.— 1996.— С.174.
6. Максимкина Е. А. , Миназова Г. И., Чукреева Н. В. Стандартизация и обеспечение качества лекарственных средств.— М.: Медицина, 2008.— 256 с.
7. Настойки, экстракты, эликсиры и их стандартизация / Под ред. Проф. В. А. Багировой, проф. В. А. Северцева.— СПб.: Спец. Лит., 2001.— 223 с.
8. Пименов А. И., Макаров В. Г., Краснов К. А. и др. Опыт применения высокоэффективной жидкостной хроматографии в стандартизации комплексного препарата «Эликсир Эвалар»// Материалы II Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения».— СПб.: Валаам, 1998.- С.110.
9. Тюкавкина Н. А., Руленко И. А., Колесник Ю. А. // Вопросы питания.- 1996.- №2.- С.33.
10. Файзрахманова И. М., Цырлина Е. М., Юну-сов М. С., Муринов Ю. И., Миназова Г. И. // Хим. фарм. ж.- 2008.- Т.42, №12.- С.50.
11. Файзрахманова И. М., Цырлина Е. М., Юну-сов М. С., Муринов Ю. И., Миназова Г. И. // Фармация.- 2008.- № 3.- С.23.
12. Эпштейн Н. А. // Хим. фарм. ж.- 2004.- Т. 38, №4.- С.40.
13. Barnes J., Anderson J. A and Phillpson J.D. Herbal Medicines u guide for healthcare professionals.-London, Chicago: Pharmaceutrcal Press, 2002.-Pp. 489-491.
14. Blumenthal M, Golgberg A. and Bunekmann J Herbal Medicines, Expandledlommnession. E. Monographs, Jntegralive Medicine Commutations, Newton, 2000.- Pp. 419-423.
15. British Pharmacopeia CD 1998 V20, Sustem Simulation Ltd 1998.
16. British Pharmacopeia, 2004.- Vol. II, Appenden III.
17. // Europian Pharmacopeia.- 2004.- 4.
18. // United States Pharmacopeia.- 24th Ed., Rockvill.- 1999.
19. // United States Pharmacopeia.- 2004.- USP 27.-NF 22.
