CC BY
13В.М. Ершик, А.И. Жебентяев, В.И. Фадеев, О.А. Ершик
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТОПРОЛОЛА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Витебский государственный медицинский университет
Предложена методика определения метопролола в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением флуориметрического детектора. В процессе пробоподготовки метопролол с внутренним стандартом (би-сопролол) экстрагируют смесью гептан — хлористый метилен — дихлорэтан — пропанол-2 (24:10:2:1). Исследуемые вещества элюируют смесью ацетонитрил: 0,1% раствор трифторуксусной кислоты в градиентном режиме. Расход подвижной фазы составляет 1,0 мл/мин. Детектирование осуществляют при длине волны возбуждения/эмиссии 225/310 нм. Нижняя граница определяемых содержаний составляет 0,6 нг/мл. Концентрацию метопролола рассчитывают по двум градуировочным графикам, линейным в диапазонах 0,6 — 20,2 нг/мл и 10,1 — 323 нг/мл.
Ключевые слова: метопролол, ВЭЖХ, плазма крови.
ВВЕДЕНИЕ
Метопролол (1-[4-(2-Метоксиэтил) фе-нокси]-3-[(1-метилэтил)амино]-2-пропа-нол) применяется при артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, нарушениях сердечного ритма, гипертиреозе, для профилактики приступов мигрени. Метопролола тартрат выпускается в виде таблеток, покрытых пленочной оболочкой 25, 50 и 100 мг [1]. На территории Республики Беларусь зарегистрированы лекарственные средства метопролола известных производителей: Эгилок (EGIS PLC, Венгрия), Беталок ЗОК (AstraZeneca AB, Швеция), Корвитол (Berlin-Chemie AG (Menarini Group), Германия), Метопролола тартрат (Apotecnia S.A., Испания). Объем рынка метопролола на территории Республики Беларусь достаточно велик, поэтому экономически целесообразны выпуск генерического лекарственного средства метопролола и проведение испытаний биоэквивалентности с оригинальным лекарственным средством.
В литературе описывается ряд методик
определения метопролола в плазме крови. В работе [2] очистку аналита от компонентов матрицы осуществляли высаливанием белков ацетонитрилом и экстракцией липо-фильных веществ смесью дихлорметан-изо-пропиловый эфир (1:1). Внутренний стандарт при этом не использовали. В работах [3, 4] пробоподготовку осуществляли жид-кость-жидкостной экстракцией из щелочной среды с использованием дихлорметана и смеси этилацетат-диэтиловый эфир (2:1), соответственно. После упаривания органической фазы досуха сухой остаток растворяли и хроматографировали. В качестве внутреннего стандарта использовали пиндолол и атенолол, соответственно. Авторы работ [5] и [6] после экстракции дихлорметаном и этилацетатом, соответственно, предложили проводить дополнительную очистку путем экстракции липофильных примесей гексаном, либо путем реэкстракции метопроло-ла из органической фазы раствором серной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовали дилтиазем и бисопролол. В работе [7] пробоподготовку осуществляли
методом твердофазной экстракции с использованием сорбента С2.
При пробоподготовке методом высаливания белков нам не удалось получить удовлетворительной сходимости результатов, что связано с сорбцией аналита на поверхности осаждаемых белков. Кроме того, отсутствие внутреннего стандарта также негативно влияет на сходимость результатов. При использовании в качестве экстрагента сложных эфиров и их смесей аналит сильно загрязнен компонентами матрицы, что увеличивает пределы определения и время, необходимое для полного разделения пиков метопролола и компонентов матрицы. Содержащаяся в экстракте вода также ухудшает метрологические характеристики методики. Применение дополнительных процедур очистки (реэкстракция, экстракция гексаном) приводит к значительному усложнению пробоподго-товки, что в сочетании с большим количеством анализируемых образцов приводит к значительным затратам времени.
Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики количественного определения метопролола в плазме крови, воспроизводимой в условиях аналитической базы биоэквивалентных испытаний и пригодной для анализа большого количества образцов.
МА ТЕРИАЛЫ И МЕ ТОДЫ
В работе использовали фармакопейный стандартный образец метопролола тартрата и рабочий стандартный образец бисопроло-ла (внутренний стандарт).
Реактивы: ацетонитрил для хроматографии; натрия гидроксид, ч.д.а.; кислота трифторуксусная; кислота уксусная ледяная, о.с.ч.; гептан ч.д.а.; пропанол-2 ч.д.а.; хлористый метилен, ч.д.а.; 1,2-дихлорэтан, ч.д.а.
Исследования проводили на жидкостном хроматографе Waters, оснащенном флуори-метрическим детектором. Хроматографическая колонка - Zorbax Eclipse XDB С-18 4,6^150 мм, зернение 5 мкм, температура колонки 30оС. Разделение проводили в градиентном режиме (таблица 1). Подвижная фаза А представляла собой 0,1% раствор трифто-руксусной кислоты в воде; подвижная фаза
В - ацетонитрил для хроматографии. Расход элюента 1,0 мл/мин. Длина волны возбуждения/эмиссии 225/310 нм. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.
Методика пробоподготовки (жид-кость-жидкостная экстракция)
В экстракционные пробирки помещают по 1,0 мл размороженной плазмы крови 1 мл 0,05М раствора натрия гидроксида, 0,200 мл рабочего раствора внутреннего стандарта (раствор бисопролола в воде, 400 нг/мл) и 3 мл экстракционной смеси (гептан - хлористый метилен - дихлорэтан - пропанол-2 (24:10:2:1).
Содержимое пробирок перемешивают на шейкере 7 минут и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 минут. Органическую фазу (верхний слой) переносят в полипропиленовые пробирки и упаривают досуха в токе воздуха при температуре 35-40°С.
Содержимое пробирок растворяют в 0,100 мл подвижной фазы и 20 мкл полученного раствора хроматографируют на хроматографе, оснащенном флуориметрическим детектором.
РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ
Терапевтические концентрации при приеме 100 мг метопролола составляют от
0,03 мкг/мл до 0,28 мкг/мл. Период полувы-ведения - 3-4 часа (быстрые метаболизеры). Метопролол на 11% связан с белками [8].
При проведении биоэквивалентных испытаний осуществляют слежение за концентрацией лекарственного вещества в плазме крови в течение четырех периодов полувыве-дения. Теоретическая минимальная концентрация метопролола в плазме крови через 4 периода полувыведения должна составлять 17,50 - 1,88 нг/мл (С = C /24). Пред-
5 5 ^ 4 теор тах г
полагаемый диапазон концентраций мето-пролола должен составлять 300 - 1,88 нг/мл.
Удельный коэффициент поглощения ме-топролола не высок (при 274 нм в кислой среде составляет 52 [8]), в то же время ме-топролол способен флуоресцировать. Поэтому в большинстве работ при исследовании фармакокинетики метопролола используют метод ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
Таблица 1 - Режим г радиентного элюирования
Время, мин А, % (об.) В, % (об.) Режим
0-6,0 77,0 ^ 63,0 23,0 ^ 37,0 Градиентный
6,0-7,0 63,0 37,0 Изократический
7,0-8,0 63,0 ^ 77,0 37,0 ^ 23,0 Градиентный
8,0-9,0 77,0 23,0 Изократический
В ходе предварительных исследований установлено, что наилучшая сходимость результатов наблюдается при использовании в качестве экстрагента хлористого метилена и смеси гептан - хлористый метилен -дихлорэтан - пропанол-2 (24:10:2:1) (копия системы растворителей пробирок Agilent Toxi-tubes А). В качестве оптимального экстрагента была выбрана последняя смесь, так как в отличие от хлористого метилена у нее плотность меньше плотности воды, что облегчает отбор органического слоя из экстракционных пробирок. В качестве внутреннего стандарта нами были испытаны бисопролол, атенолол и пиндолол. Атенолол практически не экстрагируется предложенной нами системой растворителей. При использовании бисопролола и пиндолола наблюдаются сопоставимые по сходимости результаты. В качестве внутреннего стандарта нами был выбран бисопролол.
В ходе выполнения биоэквивалентных испытаний оказалось, что концентрация аналита в плазме крови некоторых добровольцев, отобранной через 4 периода полу-выведения, значительно ниже теоретически рассчитанной. Поэтому в процессе работы было приготовлено два дополнительных градуировочных раствора с концентрацией метопролола 1,2 и 0,6 нг/мл.
При валидации разработанной методики по параметру правильность было обнаружено, что результаты количественного определения метопролола отягощены систематической погрешностью ^ > ^риТ (р=0,95; n=9)) при использ°-
вании градуировочного графика в диапазоне концентраций 0,6 - 323 нг/мл. Для примера в таблице 2 представлены результаты расчета концентрации метопролола в плазме крови по одному градуировочному графику, в котором концентрация аналита в нижней и верхней
точках отличается более чем в 500 раз.
Поэтому при расчетах использовали два градуировочных графика: градуировочный график 1, построенный для концентраций 10,1 - 322,5 нг/мл; градуировочный график 2
- для концентраций 0,6 - 20,2 нг/мл. При анализе данных, полученных при исследовании плазмы добровольцев, концентрацию метопролола рассчитывали по градуировочному графику 1, а если она оказывалась менее 20,2 нг/мл, то расчеты проводили по градуировочному графику 2.
Результаты количественного определения метопролола в плазме крови по методу «введено-найдено» (в разные дни) представлены в таблице 3.
Правильность (Я., %) и воспроизводимость (RSD, %) результатов находились в пределах критериев приемлемости (85,0-115,0% и 0-15,0%, соответственно). Относительная погрешность определения (5, %) не превышала 15,0% (в области нижней концентрации - 20,0%). Не наблюдалось статистически значимых отклонений от истинного значения
определяемой величины (1эКСп%. е=8, р=0,95) ).
Диапазон определяемых концентраций метопролола по предложенной методике составил 0,6 - 323 нг/мл, нижняя граница определяемых содержаний метопролола - не более 0,6 нг/мл.
Расчет концентрации метопролола осуществляли по двум градуировочным графикам, которые частично перекрываются в области концентраций 10,1 и 20,2 нг/мл. Поэтому нами проводилась дополнительная процедура валидации, чтобы убедиться, что результаты, рассчитанные по обоим градуировочным графикам в области перекрывания, отличаются статистически незначимо
(1< ^р (±=16, р=0,95)). Результаты представлены
в таблице 4.
Таблица 2 - Результаты расчета концентрации метопролола в плазме крови
(P=0,95; n=9) по одному градуировочному графику
Введено, нг/мл Найдено, мкг/мл х±ьх RSD, % R, % 5, % t эксп
323 323±5 2,4 100,2 1,59 0,25
161 160±3 2,8 99,4 1,84 0,62
80,6 79,9±2,5 4,7 99,1 3,10 0,57
40,3 40,1±0,7 2,5 99,6 1,63 0,49
20,2 20,2±0,5 3,9 100,2 2,53 0,18
10,1 10,2±0,4 6,1 101,1 4,01 0,55
5,0 5,1±0,2 5,6 100,8 3,67 0,43
2,5 3,0±0,2 7,8 117,2 5,10 5,64
1,3 1,5±0,1 7,7 122,7 5,05 7,17
0,6 0,9±0,1 9,5 139,1 6,18 8,92
Таблица 3 - Результаты количественного определения метопролола в плазме крови
(P=0,95; n=9)
Введено, нг/мл Найдено, мкг/мл RSD, % R, % 5, % t эксп
Градуировочный график 1
10,1 10,5±0,4 6,0 104,2 6,2 2,0
161 160±3 2,8 99,5 2,8 0,6
323 323±5 2,4 100,2 2,4 0,2
Градуировочный график 2
0,6 0,6±0,1 12,9 103,4 15,8 0,8
10,1 10,1±0,4 6,3 99,9 6,4 0,1
20,2 20,2±0,5 3,9 100,2 3,9 0,1
Таблица 4 - Сравнение результатов расчета содержания метопролола в плазме крови по двум градуировочным графикам в области их перекрывания
Введено, нг/мл Найдено по градуировочному графику 1 (Сср 1, нг/мл) Найдено по градуировочному графику 2 (Сср 2, нг/мл) Отношение, % t эксп
10,1 10,5 10,1 104,3 1,90
20,2 20,5 20,2 101,5 1,08
Методика обладает удовлетворительной специфичностью: на хроматограммах образцов плацебо не обнаружено хроматографических пиков со временами удерживания, соответствующими метопрололу и бисопро-лолу (внутренний стандарт).
Замороженные образцы плазмы выдерживают два цикла заморозки/разморозки, после размораживания устойчивы не менее 1 часа. После пробоподготовки образцы устойчивы не менее 18 часов при хранении в автосамплере хроматографа. При долговременном хранении образцы плазмы добро-
вольцев устойчивы не менее 36 дней. Исходный стандартный раствор внутреннего стандарта (400 мкг/мл бисопролола в метаноле) устойчив в течение 36 дней при стабилизации его с помощью добавки ледяной уксусной кислоты. Рабочий стандартный раствор внутреннего стандарта (400 нг/мл бисопро-лола в воде) устойчив в течение 24 часов.
Типичная хроматограмма метопролола в плазме крови представлена на рисунке 1.
Методика обладает удовлетворительной робастностью: открываемость в течение всего периода исследования находилась в пре-
Рисунок 1 - Типичная хроматограмма образца плазмы, содержащей метопролол
делах 85-115% (в области нижней границы определяемых содержаний - в пределах 80120%). Результаты представлены в таблице 5. Относительное стандартное отклонение угловых коэффициентов градуировочных графиков 1 и 2, полученных в различные дни, составляло 2,4 и 2,7%, соответственно. Время удерживания хроматографических пиков метопролола и бисопролола на хроматограммах, полученных в течение всего периода исследований, составляло 3,92 и 5,78, соответственно, при относительном стандартном отклонении - 0,88 и 0,78, соответственно.
Разработанная методика успешно апро-
V.M. Yorshyk, A.I. Zhebentyaev,
V.I. Fadeev, O.A. Yorshyk VALIDATION OF METHOD FOR QUANTATIVE DETERMINATION OF METOPROLOL IN BLOOD PLASMA Reverse phase liquid chromatographic method was developed and validated for the estimation of Metoprolol in blood plasma. Meto-prolol was extracted using an internal standard (Bisoprolol) and mixture of Heptane: Methylene chloride: Ethylene dichloride: Propyl alcohol-2 V/V (24:10:2:1).
Chromatographic analysis was performed on a Zorbax Eclipse XDB C-18 4,6* 150mm column ID (5 micron particle size) at 30°C temperature in gradient mode, with mobile phase containing acetonitrile: 1% trifluoroacetic acid and fluorimetric detection with an excitation wavelength of 225 nm, and emission wavelength of 310 nm. The flow rate was 1.0 ml/min The lower limit of quantification of Metopro-lole is 0,6 ng/ml. The linearity of the method was in two ranges 0,6 - 20 ng/ml and 10,1 - 323 ng/ml. Keywords: metoprolol, HPLC, blood plasma.
бирована при проведении биоэквивалент-ных испытаний лекарственного средства Кардилок, производства ООО «Фармтехно-логия», в сравнении с лекарственным средством Эгилок, производства «Эгис А.О.», Венгрия.
ВЫВОДЫ
Предложена методика определения ме-топролола в плазме крови методом ВЭЖХ. Все рекомендованные валидационные критерии [9] находились в пределах критериев приемлемости.
1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник / М.: АстраФармСервис - 2006 г. - 1536 с.
2. Enantioselective determination of metoprolol acidic metabolite in plasma and urine using liquid chromatography chiral columns: applications to pharmacokinetics / P.M. Cerqueira [et al.] // Journal of Chromatography B. - 2003.
- Vol. 783. - P. 433-441.
3. Roivas, K.L. Receptor binding assays in analysing the bioavailability and pharmacodynamic bioequivalence of active drug moieties / K.L. Roivas, P. J. Neuvonen // Eur. J. Clin. Pharmacol. - 1994. - Vol. 46. - P. 237-242.
4. Yilmaz, B. Determination of metoprolol in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection / B. Yilmaz, A. Asci, S. Arslan // J. Sep. Sci.
- 2010. - Vol. 33. - P. 1904-1908.
5. Al-Saidana, S.M. Pharmacokinetic evaluation of guar gum-based three-layer matrix tablets for oral controlled delivery of highly soluble metoprolol tartrate as a model drug /
S.M. Al-Saidana [et al.] // European Journal of
Таблица 5 - Открываемость метопролола в различные дни
№ образца Введено метопролола, нг/мл
0,6 161 323
Найдено, нг/мл R, % Найдено, нг/мл R, % Найдено, нг/мл R, %
1 0,7 114,5 158 97,9 328 101,7
2 0,5 86,3 156 96,6 312 96,7
3 0,7 117,7 167 103,6 321 99,6
4 0,8 119,4 160 99,0 324 100,4
5 0,5 84,7 156 96,7 313 96,9
6 0,6 99,5 167 103,6 321 99,4
7 0,6 94,7 157 97,4 324 100,4
8 0,7 112,9 159 98,7 328 101,7
9 0,6 100,7 164 101,7 337 104,5
Среднее значение 0,7 103,4 160 99,5 323 100,2
SUMMARY ЛИТЕРАТУРА
Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2004. -Vol. 58. - P. 697-703.
6. Qin, Li. Simultaneous analysis of tramadol, metoprolol and their metabolites in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography / Li Qin, Wang Rui // Chinese Medical Journal. - 2006. - Vol. 119. - I. 23. - P. 2013-2021.
7. Mistry, B. A sensitive assay of metopro-lol and its major metabolite a-hydroxy meto-prolol in human plasma and determination of dextromethorphan and its metabolite dextror-phan in urine with high-performance liquid chromatography and fluorometric detection / B. Mistry, J. Leslie // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 1998. - Vol. 16. - P. 1041-1049.
8. Moffat, A.C. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals / A.C. Moffat. - Second Edition. - London: The pharmaceutical press, 1986. - 1684 p.
9. Guidance for Industry. Bioanalytical Methods Validation. 2001. - 21 p.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,
Витебский государственный медицинский университет, кафедра токсикологической и аналитической химии, тел. раб. : 8 (0212) 37-00-06.
Ершик В.М.
Поступила 12.09.2011 г.
