CC BY
20ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Д.В. Моисеев, В.М. Ершик, В.И. Фадеев, М.Л. Пивовар, А.Д. Кочуев,
А.И. Жебентяев, Н.Д. Яранцева
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТРИМЕТАЗИДИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭЖХ СО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
Витебский государственный медицинский университет
Разработана простая методика определения триметазидина в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением УФ- детектора. Триметазидин и внутренний стандарт (новокаин) экстрагировали из пробы плазмы толуолом. После упаривания толуола органический остаток растворяли в подвижной фазе и вводили в хроматографическую колонку. Исследуемые вещества элюировали смесью ацетонитрил: фосфатный буфер (рН=2,5) в градиентном режиме. Расход подвижной фазы составляет 1,0 мл/мин. Детектирование осуществлялось при длине волны 210 нм. Предел обнаружения составляет 1,0 нг/мл (при соотношении сигнал/шум=3:1), предел количественного определения составляет
3,5 нг/мл. Степень экстракции составляет 56 %. Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 3,5 —
139,8 нг/мл.
Ключевые слова: триметазидин, высокоэффективная жидкостная хроматография, УФ- детектор.
ВВЕДЕНИЕ
Триметазидин (1-(2,3,4-триметокси-бензил)-пиперазин) (рис. 1) применяется как антиангинальное, антигипоксическое, цитопротективное и метаболическое лекарственное средство (ЛС). Выпускается в виде таблеток, покрытых оболочкой, по 20 и 35 мг [1]. Оригинальное лекарственное средство Предуктал МВ (Франция). Кроме
данного ЛС, на фармацевтическом рынке стран СНГ присутствуют и генерики (Три-метазид, Медарум). В Республике Беларусь, в соответствии с государственной программой импортозамещения ЛС, планируется производство генерических лекарственных средств триметазидина. Одним из условий для регистрации и успешного производства ЛС является проведение биоэквивалентных испытаний. Поэтому актуальной задачей является разработка и валидация методики определения триме-тазидина в плазме крови.
ОСН.
N
N14
Рис. 1. Структурная формула триметазидина После приема внутрь триметазидин быстро и практически полностью абсорбируется из ЖКТ. Биодоступность составляет около 90 %. После однократного приема внутрь в дозе 20 мг Стах достигается через 2 ч и составляет около 55 нг/мл. Выводится почками, около 60 % - в неизмененном виде. Т1/2 - 4,5-5 ч [2].
Контроль за концентрацией лекарственного вещества в плазме крови осуществляется в течение 4-х периодов Т1/2 (24 часа). Поэтому необходимо, чтобы градуировочный график определения три-метазидина в плазме крови был линеен при концентрациях от 5 до 130 нг/мл.
Согласно литературным данным определение триметазидина в плазме крови проводят методом ВЭЖХ на обращен-нофазовых колонках С18. Авторы работ [36] предлагают использовать в качестве внутренних стандартов лидокаин, буфло-медил, псевдоэфедрин или 1-(2,4,5-
триметоксибензил)-пиперазин. Регистрация аналитического сигнала осуществляется масс-спектрометрическим детектором.
В работе [7] предложена методика определения триметазидина после прове-
дения предколоночной дериватизации с использованием флуориметрического детектора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали стандартные образцы триметазидина и новокаина (внутренний стандарт).
Реактивы: ацетонитрил («Крио-
хром», 0 сорт); натрия дигидрофосфат (ч.д.а.); кислота фосфорная (ч.д.а.); три-этиламин для хроматографии «Fluka»; вода деионизированная (Millipore); толуол
(ч.д.а.); натрия фторид (ч.д.а); раствор аммиака 25 % (х.ч.); кислота уксусная ледяная (х.ч.).
Исследования проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 - четырехградиентный насос, термостат колонок, автосэмплер, фотодиодноматричный де-
тектор. Хроматографическая колонка -Zorbax Eclipse XDB С-18 4,6*150 мм, зернение 5 мкм, температура колонки 30°С. Разделение проводили в градиентном режиме. При приготовлении подвижной фазы А 0,05 М водный раствор натрия дигидрофосфата доводили ортофосфорной кислотой до значения pH=2,5 и прибавляли 0,5 % триэтиламина; подвижная фаза В - ацетонитрил. Расход элюента
1,0 мл/мин. Детектирование осуществляли при длине волны Х=210 нм (аналитическая длина волны выбиралась с учетом максимумов поглощения триметазидина и внутреннего стандарта), объем инжектируемой пробы 50 мкл. Режим элюирования представлен в таблице 1.
Таблица 1 - Режим градиентного элюирования триметазидина
Время, мин Подвижная фаза А Подвижная фаза В Режим
0-10,0 90->85 10—>15 градиентный
10,0-10,1 85->90 15—>10 градиентный
10,1-15,0 90 10 изократический
МЕТОДИКА ПРОБОПОДГОТОВКИ (ЖИДКОСТЬ - ЖИДКОСТНАЯ ЭКСТРАКЦИЯ)
Экстракцию проводили толуолом, поскольку при использовании данного растворителя удается достигнуть достаточной степени извлечения триметазидина при минимальной экстракции компонентов матрицы. 1,0 мл плазмы крови помещали в экстракционную пробирку, прибавляли
0,25 мл воды, 0,25 мл раствора натрия фторида (30 г/л), 0,5 мл 10 М раствора аммиака со значением pH 11,5 и перемешивали на вортекс-шейкере в течение 15 секунд. Прибавляли 100 мкл раствора новокаина (10,12 мкг/мл) в ацетонитриле,
2,0 мл толуола и перемешивали на шейке-ре 5 минут.
После проведения экстракции экстракционные пробирки центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин. Органическую фазу отбирали, упаривали при 40°С в токе воздуха досуха. Сухой остаток растворяли
в 0,2 мл подвижной фазы и хроматографировали.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Описанные в литературе методики количественного определения триметази-дина требуют наличия труднодоступного оборудования (жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором). Нами разработана методика определения триметазидина в плазме крови на жидкостном хроматографе со спектрофотометрическим детектором. Значения показателей констант ионизации основных центров пиперазинового кольца триметазидина составляют 4,54 и 9,14 [8]. Существование ионизированных форм триметазидина в широком диапазоне значений pH обусловливает наличие ион-ионного и гидрофобного механизма удерживания сорбата. Поэтому при хроматографировании пики триметазидина получаются асимметричными и размытыми. Введение в состав подвижной фазы триэтиламина приводит к
улучшению формы хроматографического пика вследствие конкурентного снижения вклада ион-ионного механизма в удерживание триметазидина. Это позволяет проводить определение более низких концен-
траций аналита с использованием спектрофотометрического детектирования.
Результаты количественного определения триметазидина в плазме крови по методу «введено-найдено» (в разные дни) представлены в таблице 2.
Таблица 2 - Результаты количественного определения триметазидина в плазме крови
Введено, нг/мл Найдено, мкг/мл X ±АХ Sr R, % б, %
3,5 4,1±0,7 0,32 118 20,0
7,0 7,7±1,0 0,22 111 12,б
24,5 24,2±1,3 0,08 99 5,3
34,9 35,1±2,2 0,10 100 б,0
б2,9 б2,0±4,3 0,11 99 б,7
90,8 90,1±5,5 0,09 100 5,7
111,8 109,4±3,б 0,05 98 3,1
125,8 129,1±3,8 0,05 103 2,8
139,8 139,8±4,2 0,05 100 2,8
Линейный диапазон определяемых концентраций триметазидина по предложенной методике составляет 3,5 -
139,8 нг/мл, нижняя граница определяемых содержаний триметазидина -
3,5 нг/мл, предел обнаружения (при соотношении сигнал/шум=3) - 1,0 нг/мл.
Степень извлечения триметазидина из плазмы крови составила 5б % (для концентраций от 3,5 до 139,8 нг/мл).
Эффективность колонки по пику триметазидина составила 12000 - 17000 теоретических тарелок. Так как режим хроматографирования был градиентным, влияние состава подвижной фазы (содержание органического модификатора), от-
mAU ■
40-
личающиеся на ±2% от указанных в методике хроматографического анализа, не исследовали. Изменения значения рН подвижной фазы (±0,3) не оказывало влияния на времена удерживания и площади пиков триметазидина и внутреннего стандарта (относительное стандартное отклонение
0,8 %). Разрешение пиков триметазидина и внутреннего стандарта при этом остается достаточным для проведения количественного определения (значение Rs составляет более 15,0), разрешение с соседними пиками более 2,0. Хроматограмма тримета-зидина в плазме крови представлена на рисунке 2.
т-
10
I
12
I
14
min
Рис. 2. Хроматограмма триметазидина (время удерживания 9,4 мин) и внутреннего стандарта (время удерживания 4,8 мин). Спектральная чистота пиков более 99,7 %.
Разработанная методика применяется при выполнении аналитического этапа биоэквивалентных исследований на базе Лаборатории стандартизации и контроля качества лекарственных средств УО «ВГМУ».
ВЫВОДЫ
Разработана методика определения триметазидина в плазме крови методом ВЭЖХ. Линейный диапазон определяемых концентраций триметазидина составляет
3,5 - 139,8 нг/мл. По параметрам правильность и воспроизводимость методика удовлетворяет требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методикам [9].
Методика используется при проведении биоэквивалентных исследований лекарственного средства Триметазидин (таблетки, покрытые оболочкой, по 20 мг), производства РУП «Белмедпрепараты» в сравнении с лекарственным средством Предуктал (таблетки, покрытые оболочкой, по 20 мг), производства фирмы «LES LABORATORIES SERVIER» (Франция), на 18 добровольцах.
SUMMARY
D.V. Moiseev, V.M. Yorshyk, V.I. Fadeev, M.L. P^var, A.D. Ko^uev,
A.I. Zhebentyaev, N.D. Yarantseva DETERMINATION OF TRIMETAZIDINE IN BLOOD PLASMA BY HPLC WITH UV DETECTION A simple high-performance liquid chromatographic method using ultraviolet detection was developed for the determination of trimetazidine in human plasma. Trimetazidine and the internal standard (procaine) were extracted from plasma sample using toluene. After evaporation of the toluene, the residue is dissolved in mobile phase and injected into a chromatographic C18 column. The drugs are eluted with a binary-solvent gradient system (acetonitrile/phosphate buffer pH 2,5). Analysis was run at a flow-rate of 1,0 ml/min with the de-
tector operated at a wavelength of 210 nm. The method was specific and sensitive with a detection limit of approximately 1,0 ng/ml at a signal to noise ratio of 3:1, while the limit of quantification was 3,5 ng/ml. Mean recovery value of the extraction procedure was about 56 %. The calibration curve was linear over a concentration range of 3,5-139,8 ng/ml.
Key words: trimetazidine, high-
performance liquid chromatographic, ultraviolet detection.
ЛИТЕРАТУРА
1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник / М.: Ас-траФармСервис - 2006 г. - 1536 с.
2. Moffat, A.C. Clarke’s isolation and identification of drugs in pharmaceuticals / A.C. Moffat. - Second Edition. - London: The pharmaceutical press, 1986. - 1684 p.
3. Jiao, Y. LC/ESI-MS method for the determination of trimetazidine in human plasma: application to a bioequivalence study on Chinese volunteers / Y. Jiao, M. Su, M. Chen, W. Jia, Y. Chou, Z. Huang, N. Yang, W. Tong. // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2007. - Vol. 43, № 5. - P. 1804-1807.
4. Sensitive and rapid LC-ESI-MS method for the determination of trimetazidine in human plasma / L. Ding [et all] // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2007. - Vol. 44, № 2. - P. 526-531.
5. Quantification of trimetazidine in human plasma by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and its application to a bioequivalence study / Z.B. Wang [et all] // Pharmazie. - 2007. -Vol. 62, № 1. - P. 27-30.
6. Non-extractive procedure followed by LC/APCI MS/MS analysis of trimetazidine in plasma samples for assessing bioequivalence of immediate/modified release formulations / A. Medvedovici [et all] // Biomed. Chroma-togr. - 2005. - Vol 19, № 7. - P. 549-555.
7. Khedr, A. Sensitive determination of trimetazidine in spiked human plasma by
HPLC with fluorescence detection after precolumn derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate / A. Khedr, M.M. Sheha,
I.A. Darwish // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2007. -Vol. 856, № 1-2. -P. 337-342.
8. The pH-partition profile of the anti-ischemic drug trimetazidine may explain its reduction of intracellular acidosis / F. Rey-mond, G. Steyaert, P.A. Carrupt [et all] // Pharm. Research. -1999. - Vol. 16, № 5. -P. 616-624.
9. Guidance for Industry. Bioanalytical Methods Validation. 2001. 21 p.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра фармацевтической химии с курсом ФПК и ПК, тел. раб. : 8 (0212) 37-00-06,
Моисеев Д. В.
Поступила 14.07.2009 г.
