CC BY
33ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
О.А. Ёршик, В.М. Ёршик, М.Л. Пивовар,
Д.В. Моисеев, В.И. Фадеев, А.И. Жебентяев ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИМЕСУЛИДА И 4-ГИДРОКСИНИМЕСУЛИДА
В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет
Предложена методика определения нимесулида и его активного метаболита 4-гидроксинимесулида в плазме крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением спектрофотометрического детектора. В процессе пробоподготовки нимесулид и 4-гидроксинимесулид с внутренним стандартом (индометацин) дважды экстрагируют смесью толуол-хлористый метилен (1:1). Исследуемые вещества элюируют смесью 0,05М фосфатного буферного раствора pH 3, 0 и ацетонитрила (55:45 об/об). Расход подвижной фазы составляет
1,0 мл/мин. Детектирование осуществляют при длине волны 320 нм. Концентрацию нимесулида и 4-гидроксинимесулида рассчитывают по градуировочным графикам, линейным в диапазонах концентраций 0,049 — 6,29 мкг/мл и 0,018 — 2,38 мкг/мл, соответственно.
Ключевые слова: нимесулид, 4-гидроксинимесулид, ВЭЖХ, плазма крови.
ВВЕДЕНИЕ
Нимесулид (№(4-нитро-2-фенокси-
фенил) метансульфонамид) применяется при внесуставных ревматических заболеваниях, болях и воспалительных процессах после оперативного вмешательства, боли и лихорадке при острых воспалительных процессах в верхних дыхательных путях, боли, связанной с дисменореей. Принимается по 100-200 мг 2 раза в сутки [1]. На территории Республики Беларусь зарегистрированы лекарственные средства ни-месулида известных производителей: Нимесулид (Holden Medical B.V., Нидерланды), Нимесулид Максфарма (Maxpharma Baltija UAB, Литовская Республика), Ни-месил (Laboratori Guidotti S.p.A., (Menarini Group), Италия), Нимесубел (РУП «Бел-медпрепараты», Республика Беларусь) и др.) [2]. В УО «ВГМУ» планируется проведение испытаний биоэквивалентности лекарственного средства Нимесулид-Рн, поэтому актуальна разработка и валидация методики количественного определения нимесулида в плазме крови, пригодной для выполнения испытаний в условиях лаборатории стандартизации и контроля качества лекарственных средств.
В результате метаболизма нимесулида образуется пять различных активных метаболитов [3]. При приеме лекарственного
средства только один метаболит - 4-ги-дроксинимесулид - образуется в значительных количествах. Поэтому при проведении биоэквивалентных испытаний необходимо проводить количественное определение в плазме крови и нимесулида, и 4-гидроксинимесулида.
В литературе описано значительное количество методик определения нимесу-лида и метаболитов в плазме крови. Большинство авторов предлагают определение нимесулида и 4-гидроксинимесулида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в сочетании со спектрофотометрическим детектированием. Авторы работы [4] предлагают проводить экстракцию диэтиловым эфиром из подкисленной хлористоводородной кислотой плазмы крови. В качестве внутреннего стандарта используют индометацин. В некоторых работах проводят пробоподготовку путем высаливания белков метанолом [5] или ацетонитрилом [6,7]. В работе [8] пробоподготовку осуществляют путем проведения двукратной экстракции толуолом при pH 1,0. В качестве внутреннего стандарта используют толбутамид. В работе [9] проводят экстракцию хлористым метиленом без использования внутреннего стандарта.
Целью настоящего исследования является разработка и валидация методики количественного определения нимесулида
и 4-гидроксинимесулида в плазме крови, воспроизводимой в условиях аналитической базы биоэквивалентных испытаний и пригодной для анализа большого количества образцов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали рабочие стандартные образцы нимесулида (серия NMS/18100397, 99,8%, Aarti Drugs Limited), гидроксинимесулида (серия 1048-015А1, 99,1%, TLC PharmaChem) и индометацина (серия T10-236, 99,38%, Taicang Pharm. Factory).
Реактивы: ацетонитрил для хроматографии; натрия гидроксид, ч.д.а.; кислота лимонная, х.ч.; толуол ч.д.а.; хлористый метилен, ч.д.а.
Исследования проводили на жидкостном хроматографе Agilent HP 1100, оснащенном диодноматричным детектором. Хроматографическая колонка - Zorbax Eclipse XDB С-18 4,6^150 мм, зернение 5 мкм, температура колонки 30°С. В качестве подвижной фазы использовали 0,05М фосфатный буферный раствор pH 3,0 -ацетонитрил (55:45 об/об). Расход элюен-та 1,0 мл/мин. Аналитическая длина волны составляла 320 нм. Объем вводимой пробы составлял 20 мкл.
Методика пробоподготовки (жид-кость-жидкостная экстракция)
В экстракционные пробирки помещают по 1,0 мл размороженной плазмы крови, 0,100 мл раствора внутреннего стандарта (метанольный раствор индоме-тацина 8 мкг/мл), 1,0 мл 0,05 М раствора цитратного буферного раствора (pH = 3,0),
3,0 мл экстракционной смеси толуол-хло-ристый метилен (1:1) и экстрагируют с помощью шейкера в течение 5 минут. Для разделения фаз образцы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут и отбирают в силанизированные пробирки 2,0 мл органической фазы. В экстракционные пробирки вновь добавляют 3,0 мл экстракционной смеси и экстрагируют 5 минут. Пробы центрифугируют и после разделения фаз отбирают 3,0 мл экстракционной смеси в силанизированные пробирки.
Объединенный экстракт упаривают в токе воздуха при температуре не выше 40°С. Сухой остаток растворяют в 0,100 мл подвижной фазы и хроматографируют.
Содержание нимесулида и его мета-
болита рассчитывают по градуировочным графикам.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве метода пробоподготовки нами выбрана жидкость-жидкостная экстракция. Этот метод позволяет проводить пробоподготовку одновременно множества проб. Недостаток селективности экстракции компенсируется большой концентрацией нимесулида и его метаболита в плазме крови (до нескольких мкг/мл) и достаточно большой аналитической длиной волны (320 нм), при которой трудноразрешимые компоненты матрицы не детектируются.
Согласно литературным данным [4,5,10], в качестве экстрагента используют хлористый метилен, диэтиловый эфир, толуол. Использование в качестве экстрагента диэтилового эфира нежелательно, т.к. образующиеся экстракты содержат большое количество воды, что неудобно на стадии упаривания экстракта досуха. При проведении экстракции с помощью хлористого метилена получаются хроматограммы, содержащие большое количество хроматографических пиков матрицы. Степень извлечения аналита толуолом невелика (менее 50%), что может негативно сказаться на метрологических характеристиках методики. На наш взгляд, оптимальным экстрагентом является смесь хлористый метилен и толуол в соотношении 1:1. При проведении двукратной экстракции этой смесью удается добиться высокой степени извлечения аналита (более 80%) при незначительной экстракции компонентов матрицы.
В качестве внутреннего стандарта нами выбран индометацин [4], т.к. его использование позволяет разработать методику с удовлетворительными метрологическими характеристиками, а его растворы стабильны в течение 1 месяца.
Оптимальное значение pH экстракции составляет около 3,0. Снижение значения pH экстракции менее 2,0 приводит к получению загрязненных экстрактов, а увеличение значения pH более 4,0 приводит к снижению степени извлечения внутреннего стандарта. На рисунке 1 представлена зависимость степени извлечения нимесулида, гидроксинимесулида и индо-метацина от значения pH водной фазы. Зависимость носит ориентировочный характер, т.к. нами проводились однократные
Рисунок 1 - Зависимость степени извлечения нимесулида (Н), гидроксинимесулида (М1) и индометацина (Инд) от значения pH водной фазы при проведении однократной экстракции смесью хлористый метилен-толуол (1:1)
измерения оптической плотности водной фазы после установления равновесия экстракции, при этом не учитывалось влияние растворенных органических растворителей в водной фазе на значение оптической плотности и погрешность при вычитании.
В различных литературных источниках используют аналитическую длину волны от 290 до 404 нм. Это связано с особенностями спектра поглощения нимесулида. В кислой среде он имеет плечо с высоким удельным коэффициентом поглощения в области 190250 нм [10], поэтому авторы работ [8,9,11] выбрали коротковолновую область регистрации сигнала для увеличения чувствительности определения. Недостатком проведения измерений в этой области является значительное влияние компонентов матрицы. Поэтому авторы работ [4,6,7] предлагают проводить измерение сигнала в области максимума поглощения при 290-310 нм. В этой области длин волн влияние компонентов матрицы значительно ниже, а уменьшение чувствительности определения не критично из-за больших принимаемых доз нимесулида и высоких концентраций ана-лита в плазме крови. Авторы работы [5] предложили использовать аналитическую длину волны 404 нм и подвижную фазу со значением pH около 7,3. Это связано с тем, что в щелочной среде у нимесулида возникает максимум в области 380-410 нм [10].
При использовании предложенной нами подвижной фазы максимум поглощения у нимесулида и 4-гидроксинимесу-
лида наблюдается при 310 нм. Нами выбрана аналитическая длина волны 320 нм, т.к. при этой длине волны в уравнениях градуировочных графиков величина свободного члена меньше.
Состав подвижной фазы подбирали таким образом, чтобы обеспечить хорошее разрешение хроматографических пиков аналита с компонентами матрицы за минимальное время.
Разработанная методика была валиди-рована в соответствии с требованиями [12].
Методика обладает удовлетворительной специфичностью: на хроматограммах различных образцов плазмы, не содержащих аналита, не обнаружено хроматографических пиков со временами удерживания, соответствующими временам удерживания хроматографических пиков нимесулида и 4-гидроксинимесулида (с соотношением сигнал/шум более 3).
Пример хроматограммы плазмы крови представлен на рисунке 2. Ориентировочные времена удерживания 4-гидроксини-месулида, нимесулида и внутреннего стандарта составляют около 4,1; 10,3 и 16,1 минут, соответственно.
Для проверки правильности и воспроизводимости в различные дни анализировали модельные растворы плазмы, содержащие различные концентрации нимесулида и 4-гидроксинимесулида из предполагаемого диапазона определяемых содержаний. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Рисунок 2 - Хроматограмма плазмы крови, содержащей нимесулид и 4-гидроксинимесулид
Таблица 1 - Результаты определения нимесулида
Введено нимесулида, С, мкг/мл Найдено нимесулида, Открываемость, 5, И8Б, 1 эксп
С, мкг/мл И, % % %
0,049 0,049±0,004 98,5 8,7 12,6 0,5
3,14 3,14±0,04 98,4 1,2 1,8 0,3
6,29 6,29±0,08 100,4 1,2 1,7 0,1
Таблица 2 - Результаты определения 4-гидроксинимесулида
в модельных образцах плазмы в разные дни (п=8; Р=0,95)
Введено 4-гидроксинимесулида, Найдено 4-гидрокси Открываемость, 5, И8Б, 1 эксп
С, мкг/мл нимесулида, С, мкг/мл И, % % %
0,019 0,019±0,002 104,3 7,6 10,9 1,1
1,19 1,17±0,02 98,7 1,4 2,0 1,9
2,38 2,39±0,02 100,4 0,7 1,1 1,2
Правильность (И, %) и воспроизводимость (RSD, %) результатов находились в пределах критериев приемлемости (85,0115,0% и 0-15,0%, соответственно). Относительная погрешность определения (5, %) не превышла 15,0%. Не наблюдалось статистически значимых отклонений от истинного значения определяемой величины (1 < _ р . „,).
4 эксп кр. (f=8, Р=0.95)у
Относительное стандартное отклонение угловых коэффициентов градуировочных графиков для расчета содержания ни-месулида и 4-гидроксинимесулида, полученных в различные дни, составляло 0,95 и 1,6 %, соответственно.
Методика валидировалась на предполагаемый согласно литературным данным диапазон определяемых содержаний ни-
месулида 0,049 - 6,29 мкг/мл; 4-гидрокси-нимесулида - 0,018 - 2,38 мкг/мл.
Исследуемые образцы плазмы выдерживают три цикла заморозки-разморозки. После пробоподготовки растворы устойчивы не менее 24 часов при хранении проб в автосамплере. После разморозки образцы плазмы стабильны не менее 1 часа. При хранении в жидком азоте образцы плазмы устойчивы не менее 1 месяца.
Разработанная методика использована при проведении биоэквивалентных испытаний лекарственного средства «Нимесулид-Рн», таблетки 100 мг производства ООО «Рубикон», Республика Беларусь в сравнении с лекарственным средством «Найз», таблетки 100 мг производства «Д-р Редди’с Лабораторис Лтд», Индия.
Вестник фармации №4 (58) 2012 ВЫВОДЫ
Предложена методика определения нимесулида и 4-гидроксинимесулида в плазме крови методом ВЭЖХ. Все вали-дационные критерии, рекомендованные руководством [12], находились в пределах критериев приемлемости.
Разработанная методика позволяет провести испытания биоэквивалентности нимесулида и обеспечить надежное количественное определение лекарственного вещества и его активного метаболита в плазме крови человека.
SUMMARY
O.A. Yorshyk, V.M. Yorshyk,
M.L. Pivavar, D.V. Moiseev, V.I. Fadeev, A.I. Zhebentyaev DETERMINATION OF NIMESULIDE AND 4-HYDROXYNIMESULIDE IN BLOOD PLASMA
A procedure for the quantification of nime-sulide and its active metabolite 4-hydroxyn-imesulide in plasma by high-performance liquid chromatography with UV detector has been developed. Nimesulide, 4-hydroxynimesulide and internal standard (indometacin) were extracted twice with mixture toluene-methylene chloride (1:1). The drugs are eluted with a mobile phase, contained 0,05 M phosphate buffer (pH = 3,0) and acetonitrile (55:45 v/v;
1,0 ml/min) and detection at 320 nm. The calibration curve was linear over a concentration range of 0,049 - 6,29 |ig/ml from the nimesulide and 0,018 - 2,38 |ig/ml from the 4-hy-droxynimesulide.
Keywords: nimesulide, 4-hydroxynimesulide, HPLC, blood plasma.
ЛИТЕРАТУРА
1. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник / М.: АстраФармСервис - 2006 г. - 1536 с.
2. Реестр лекарственных средств Республики Беларусь [Электронный ресурс] / УП «Центр экспертиз и испытаний в здравоохранении». Республика Беларусь. - Минск, 2012. - Режим доступа: http://www.rceth.by/ Refbank. - Дата доступа: 10.11.2012.
3. Rajeshwari, A.P. Dubey Nimesulide. Drug therapy / A.P. Rajeshwari. - Indian pediatrics, 1997. - 34 p.
4. Carrasco-Portugal, Mdel C. Compari-
son of suspension composition on the pharmacokinetics of nimesulide in rats/ Mdel C. Carrasco-Portugal, F.J. Flores-Murrieta // Proc West Pharmacol Soc. - 2008. - № 51. - Р. 58-59.
5. Ptacek, P. Rapid and simple high-performance liquid chromatographic determination of nimesulide in human plasma / P. Ptacek, J. Macek, J. KHma // Journal of Chromatography B. - 2001. - Vol. 758. - P. 183-188.
6. A pharmacokinetic comparison of three pharmaceutical formulations of nimesulide in healthy volunteers / D. Jovanovic [et all.] // Vojnosanit Pregl. - 2005. - Vol. 62, I. 12. - P. 887-893.
7. Determination of nimesulide and its active metabolite in plasma samples based on solvent deproteinization and hplc-dad analysis / Iulia Sora [et all.] // Revue Roumaine de Chimie. - 2007. - Vol. 52, I. 5. - P. 499-507.
8. Giachetti, C. Determination of Nime-sulide and Hydroxynimesulide in Human Plasma by High-Performance Liquid Chromatography / C Giachetti, A Tenconi // Biomedical chromatography. - 1998. - Vol. 12. - P. 50-56.
9. Khaksa, G. Rapid and sensitive method for determination of nimesulide in human plasma by high-performance liquid chromatography / G. Khaksa, N. Udupa // Journal of Chromatography B. - 1999. - Vol. 727. - P. 241-244.
10. Singh, S. Spectrophotometric determination of pKa of nimesulide / S. Singh, N. Shardaa, L. Mahajana // International Journal of Pharmaceutics. - 1999. - V. 176, I 2. -P. 261-264.
11. Ferrario, P. Simultaneous determination of nimesulide and hydroxynimesulide in rat plasma, cerebrospinal fluid and brain by liquid chromatography using solid-phase extraction / P. Ferrario, M. Bianchi // Journal of Chromatography B. - 2003. - Vol. - 785. - P. 227-236.
12. Guidance for Industry. Bioanalytical Methods Validation. - 2001. - 21 p.
Адрес для корреспонденции:
210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра токсикологической и аналитической химии, тел. раб. 8(0212) 37-00-06,
Ёршик В.М.
Поступила 09.11.2012 г.
