CC BY
84
УДК 615.1; 543.257.063
С. Ю. Гармонов, З. Ч. Нгуен, Л. М. Юсупова,
Р. Н. Исмаилова, В. Ф. Сопин
УСТАНОВЛЕНИЕ ФЕНОТИПА АЦЕТИЛИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАДИМЕТОКСИНА В МОЧЕ
Ключевые слова: сульфадиметоксин, спектрофотометрическое определение, фенотип ацетилирования, моча.
Установлены условия спектрофотометрического определения cульфадиметоксина в моче при использовании 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана как аналитического реагента. Оптимальные результаты определений достигаются при длине волны 490 нм и pH 6-8. Предел обнаружения cульфадиметоксина составляет 0,68 мкг/мл. Показана возможность использования разработанной методики для оценки индивидуальных фенотипов метаболизма процессов ацетилирования cульфадиметоксина у человека.
Keywords: sulphadmethoxine, spectrophotometric determination, acetylation phenotype, urine.
Established conditions for the spectrophotometric determination sulphadimethoxine in urine by using 7-chloro-4,6-dinitrobenzofuroxane as an analytical reagent. Optimal results of experiments are achieved at a wavelength of 490 nm and pH 6-8. The detection limit of mesalazine is 0.63 mkg/ml. The possibility of using the developed technique for assessing sulphadmethoxine acetylation of individual phenotypes in metabolic processes in humans is shown.
Одним из путей метаболизма лекарственных средств (ЛС) являются генетически детерминированные процессы ацетилирования при участии фермента N-ацетилтрансферазы печени [1]. Путем N-ацетилирования происходит биотрансформация ЛС, содержащих аминные функциональные группы и у человека при этом сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма [2]. Сульфаниламиды являются аналогами парааминобензойной кислоты (ПАБК), которая ингибирует синтез фолиевой кислоты в восприимчивых к ней микроорганизмах. Они используются для лечения животных и людей, поскольку быстро всасываются, создают терапевтические диапазоны 30-150 мкг/мл в плазме крови и 500-1000 мкг/мл в моче [3,4].
Сульфадиметоксин (4-(4-аминобензолсульфамидо)-(2,6-диметоксипиримидин))
представляет собой сульфаниламидный препарат длительного действия. Эффективен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий: действует на пневмококки, стрептококки, стафилококки, кишечную палочку, палочку клебсиеллы (палочку Фридлендера), возбудителей дизентерии; менее активен в отношении протея; активен в отношении вируса трахомы (инфекционного заболевания глаз, которое может привести к слепоте); не действует на штаммы бактерий, устойчивых к другим сульфаниламидным препаратам [5].
Сульфадиметоксин метаболизируется слудующими путями с участием ферментов I фазы - O-деметилирования и II фазы - ^-ацетилирования и Ni-глюкуронирования. Исследования показывают, что в организме человека, происходят только Ni-глюкуронирование и ^-ацетилирование и не происходит О-деметилирования (рис. 1).
Фармакокинетика сульфадиметоксина изучена у человека и многих видов животных (собаки, кошки, куры, львы, свиньи и жвачные животные). У человека и обезьяны основным метаболитом сульфадиметоксина в моче является ^-глюкуронид. Сульфадиметоксин подвергается ацетилированию в положении N4, исходный препарат и его ^-ацетил коньюгаты состовляют 10-15% от введенной дозы и 80% для других метаболических путей, причем период полувыведения сульфадиметоксина составляет 30-40 часов [6].
- O z=/OH
H2N—О _|т!Г~іД
/=\ o /=£
OH 2,6-Ди0H-C
OH
H2
2-OH-C
OCH3
H2N \ /
I Фаза
-1—1^4
^>0"Н-ХбЧ
/0CH3
0CH3
6-OH-C
OH
H
Сульфадиметоксин 0CH3
0
/0CH3
CH-^N^Q-|^Nb-(]^
N4-ацетил -C"4- 0CH3
II Фаза
/OCH3
\
O
HO
OCH3
OCH3
Глюкуронид Nl-Глюкуронид-О
\
OCH3 Глюкуронид
N4-ацетил-N1-Глюкуpонид-О
Рис. 1 - Схема метаболизма сульфадиметоксина в организме человека [5]
Спектрофотометрическое определение лежит в основе наиболее распространенных методик для анализа сульфаниламидов в фармацевтических формах и биологических жидкостях. Методы основаны на реакции сульфаниламидов 1,2-нафтахинон-4-сульфонатом, 7,7,8,8-тетрацианхинодиметаном, N-нафтилэтилендиамином (реактив Браттона-Маршалла), фенотиазином и N-бромсукцинимидом, п-диметиламинобензальдегидом, хлоранилом или фторанилом или 2,5-дихлор-п-бензохиноном и хинолин-8-олом [7].
В связи с этим цель работы состояла в изучении возможности оценки фенотипа ацетилирования при выведении сульфадиметоксина с мочой человека спектрофотометрическим методом анализа при использовании 7-хлор-4,6-
динитробензофуроксана как реагента.
Экспериментальная часть
Спектрофотометрические измерения были проведены на спектрофотометре СФ-26, оптическую плотность исследуемых растворов в видимой области измеряли в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Синтез 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана проведен по описанной ранее методике [8]. Использованы субстанция сульфадиметоксина (Sigma-Aldrich, 99% чистоты) и его лекарственная форма - таблетки сульфадиметоксина по 500 мг.
Методика определения. При определении фенотипа ацетилирования лекарственный препарат однократно перорально принимался здоровыми добровольцами в дозе 0,5 г (1 таблетка сульфадиметоксина). Перед приемом тест-препарата у каждого здорового добровольца отбирали мочу, не содержащую сульфадиметоксина. Мочу собирали каждые четыре часа в течение 24 часов после приема биомаркера.
Для определения концентрации сульфадиметоксина отбирается 0,5 мл мочи, добавляется 0,25 мл 10 %-го раствора трихлоруксусной кислоты, 2 мл фосфатного буферного раствора (рН 6,86; концентрация 0,2 М), далее добавляется 0,15 мл 2-10-2 М раствора реагента 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана, доводится до метки дистиллированной водой и перемешивается. В качестве
растворов сравнения используют раствор, не содержащий сульфадиметоксин, но содержащий реагент и все другие компоненты. Через 5 мин после приготовления растворов измеряется их оптическая плотность на спектрофотометре при длине волны 490 нм и толщине кюветы 1см. Количество выведенного сульфадиметоксина определяется по градуировочному графику.
Результаты и их обсуждение
Взаимодействие сульфадиметоксина с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном в полярных средах приводит к образованию интенсивно окрашенного в красный цвет устойчивого продукта реакции:
СН30\ < /
_, 0 ^ О
О-гЮ-.....-/_х
СН30
0
-яш + сі—л /.—N°
°2ы
уу
->2
СН30
СН30
30\_
о-
■0/
-НС1
0
/°х.
-я-
Н
0
\=/
°2ы
-уу
N°
2
На рис. 2 представлены спектры поглощения растворов 7-хлор-4,6-
динитробензофуроксана, смеси 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с мочой и продукта реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с сульфадиметоксином.
Рис. 2 - Спектры поглощения: 1 - 7-хлор-4,6-динитробензофураксана (1,5*10-4 М) в ацетонитриле, 2 - в производных компонентов мочи и 7-хлор-4,6-динитробензофураксана (1,5*10-4М), 3 - 4,6-динитробензофуроксанового производного сульфадиметоксина
(3*10-5 М) в воде, рН=6,8. /=1 см
Из представленных спектрально-аналитических данных видно, что в условиях анализа при ^=490 нм, влияние реагента и мочи на полосы поглощения продукта аналитической реакции весьма незначительно. Как показали проведенные эксперименты, его можно полностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при спектрофотометрическом детектировании.
Установлены условия спектрофотометрического определения сульфадиметоксина в моче при использовании 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (БФО) как аналитического реагента. Оптимальные результаты определений достигаются при длине волны 490 нм и
pH 6-8 (рис. 3), производное остается стабильным в течение 3 часов, в качестве растворителя была выбрана вода (рис. 4).
Рис. 3 - Зависимость оптической плотности от рН при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4М) и сульфадиметоксина (3*10"5 М) в воде, ^=490 нм, /=1 см
Рис. 4 - Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых производных
сульфадиметоксина (4^10-5 М): 1 - в смеси этанол:вода (50:50, об.%); 2 - в смеси этанол-вода (30:70, об. %); 3 - в смеси ацетонитрил-вода (30:70, об.%); 4 - в смеси диметилсульфоксид-вода (5:95, об.%); 5 - в смеси этанол:вода (5:95, об.%); 6 - в воде рН=6,8, 1=1 см
При этом хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации сульфадиметоксина линейны и подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера для области концентраций 0,624 -9,36 мкг/мл:
А = 0,0566Сх (мкг/мл) - 0,0456 (Н2 = 0,994; п=6).
Предел обнаружения сульфадиметоксина, уустановленный по 3Э критерию при указанных условиях фотоколориметрического определения, достигает 0,63 мкг/мл, что ниже интервала фармакокинетических концентраций ЛВ.
Правильность определения сульфадиметоксина в моче была оценена методом введено -найдено. Полученные данные свидетельствовали, что при выбранных условиях
детектирования 4,6-динитробензофуроксанового производного сульфадиметоксина компоненты мочи не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения аналита.
Избирательное спектрофотометрическое определение сульфадиметоксина в моче было положено в основу метода изучения фармакокинетики генетически де-терминированных процессов его биотрансформации в организме человека. Как показали экспериментальные данные, определение степени ацетилирования суль-фадимезина в моче является технически простой и информативной операцией, позволяющей судить о фенотипе ацетилирования пациентов. Кинетические кривые экскреции сульфадиметоксина с мочой приведены на рис. 5.
Рис. 5 - Фармакокинетические кривые выведения свободного сульфадиметоксина с мочой после перорального приема 0,5 г препарата: 1 - быстрый фенотип
ацетилирования; 2 - медленыйо фенотип ацетилирования
Выводы
1. Установлены условия спектрофотометрического определения сульфадиметоксина в моче при использовании 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана как аналитического реагента. Оптимальные результаты определений достигаются при длине волны 490 нм и pH 6-8, продукт реакции остается стабильным в течение 3 часов, в качестве растворителя была выбрана вода. Предел обнаружения сульфадиметоксина составляет 0,63 мкг/мл.
2. Разработан способ косвенного определения активности N-ацетилтрансферазы путем изучения метаболизма сульфадиметоксина в моче организма человека при применении спектрофотометрического детектирования.
Литература
1. Кукес В.Г., Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины. - М. : ГЭОТАР-Медиа. 2008.298c.
2. Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И., Зыкова И.Е. Аналитические методы исследования генетического полиморфизма организма человека, в кн. «Проблемы аналитической химии. Т.11. Химический анализ в медицинской диагностике». - М. : Наука. 2010. С. 21-65.
3. Evanthia P.T., Victoria F.S., Ioannis N.P. An Overview of Chromatographic Analysis of Sulfonamides in Pharmaceutical Preparations and Biological Fluids. Current Pharmaceutical Analysis. 2010. - Vol.6. № 3. P.198-212.
4. Metwally M.E.Primaquine Phosphate as a Promising Substitute for N-(1-Naphthyl) ethylenediamine; II. Analysis of Sulfa Drugs in Pharmaceutical Dosage Forms and Biological samples. Analytical sciences. 1999.-Vol.15.P.979-984.
5. Vree T.B., Kolmer E.W., Martea M., Bosch R., Shimoda M. High-performance liquid chromatography of sulphadimethoxine and its Ni-glucuronide, N4-acetyl and N4-acetyl-Ni-glucuronide metabolites in human plasma and urine. J Chromatogr. 1990.-Vol.26.№ .1.P.119-128.
6. Bridges JW., Kibby MR., Walker SR., Williams RT. Species differences in the metabolism of sulphadimethoxine. Biochem J.1968.Vol.109.№.5.P.851-856.
7. Klimowicz A. The comparison of some pharmacokinetic parameters of sulphadimethoxine estimated by high performance liquid chromatography and three spectrophotometric methods. Eur J Drug Metab Pharmacokinet.1989.Vol.14.№.3.P.181-186.
8. Bailey A.S., Case J.R., Tetrahedron. 1958.Vol.3.P.113-131.
© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ, [email protected]; З. Ч. Нгуен - аспирант той же кафедры; Л. М. Юсупова - д-р хим. наук, проф. каф. химии и технологии органических соединений азота КНИТУ; Р. Н. Исмаилова - канд. хим. наук, доцент каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ; В. Ф. Сопин - д-р хим. наук, проф., зав. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КНИТУ.
