CC BY
77
М. И. Евгеньев, С. Ю. Гармонов, Л. А. Зайнутдинов
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФАДИМЕЗИНА В СЛЮНЕ КАК ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ФЕНОТИПА АЦЕТИЛИРОВАНИЯ
Разработана методика спектрофотометрического определения сульфадимезина в слюне человека (1=490 нм, аналитический реагент 7-хлор-4,6-динитробензофуроксан). Методика использована для фенотипирования обследуемых по типу ацетилирования, а также показана возможность её применения для обеспечения экологической защиты.
Организм человека представляет собой биохимическую индивидуальность, которая обусловливает различия в действии ксенобиотиков при фармакотерапии различных заболеваний и воздействии токсикантов на химическом производстве. Наиболее изучены процессы на уровне метаболизма экотоксикантов - биохимические полиформизмы. Именно они во многом определяют генетически детерминированную химическую чувствительность организма человека. Популяционные исследования определения биохимических фенотипов могли бы в значительной степени повысить эффективность мероприятий экологической защиты при работе с экотоксикантами, а также сократить число побочных эффектов при фармакотерапии. Доказано, что в различных популяциях имеется строго определенное соотношение биохимических фенотипов [1]. В связи с этим паспортизация лиц, работающих на производстве, по этим признакам необходима с точки зрения обеспечения экологической безопасности и эффективности санитарногигиенических профилактических мероприятий.
Процессы ацетилирования занимают центральное место в обмене веществ. В настоящее время ацетилирование рассматривается как генетически детерминированная способность организма метаболизировать соединения, содержащие в своей молекуле аминогруппы [2]. Лица с медленным типом ацетилирования (медленные ацетиляторы) являются гомозиготами (гг) для аутосомного рецессивного гена (г), а быстрые ацетиляторы - гомозиготами или гетерозиготами (Кг) для доминантного гена. В
зависимости от скорости ацетилирования в человеческой популяции выделяются две группы. К одной из них относятся лица, метаболизирующие тест-препараты с высокой скоростью (быстрое ацетилирование), другую отличает низкая скорость процесса (медленное ацетилирование) [3,4].
В последние годы предметом интенсивных исследований является изучение роли системы ацетилирования в предрасположенности к канцерогенезу и мутагенезу [5]. Фенотипу медленного ацетилирования соответствует более высокий риск (соотношение 16.7/1) заболеваний рака мочевыводящих путей для работников производств красителей [6]. Это связано с тем, что низкая скорость N-ацетилирования приводит к меньшей скорости детоксикации ариламинов в печени, способствующей возрастанию концентрации реакционноспособных промежуточных продуктов в организме. Например, за период производства и применения генотокичного и мутагенного 1,1-диметилгидразина, метаболизм которого находится под контролем ацетилтрансферазы, риск развития злокачественных новообразований у лиц, работающих в этой системе, возрос в шесть раз,
а влияние этих заболеваний на общую смертность и трудоспособность увеличилось в 21 раз [7].
Весьма интересна с экологической точки зрения и защиты организма от экотоксикантов выявленная взаимосвязь между способностью быстрых ацетиляторов окислять лекарственные препараты и, наоборот, медленных ацетиляторов быстро окислять лекарства [8]. Аналитические методы, позволяющие выявлять такие закономерности, имеют большую практическую ценность.
Целью данной работы является разработка экспрессного, высокоизбирательного и чувствительного метода определения фенотипа ацетилирования человека.
Для повышения избирательности и чувствительности определения фенотипа ацетилирования использовалась реакция дериватизации сульфадимезина с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном:
о ^0.
о*
^N^802-^^-
СНз
N Н2 + С1
оо
N
^ ^Н-80^ '^Н-сС
СНз N02
N02
■ НС1
N02
N02
Интенсивно окрашенный продукт аналитической реакции обусловливает чувствительность спектрофотометрического детектирования лекарственного вещества в биологических жидкостях. По максимуму спектра поглощения найдена оптимальная длина волны, соответствующая 490 нм (рис.1). Количество выведенного сульфадимезина определяют по градуировочному
графику (А=0,1264С+0,0193; К=0,9943; п=5).
Подобраны оптимальные
значения РН среды (использовали фосфатный буфер с рН=6,86). Эти условия проведения анализа позволили селективно и чувствительно определять сульфадимезин в моче и слюне человека методом спектрофотометрии (табл. 1).
По экспериментальным данным элиминирования сульфадимезина мочой и слюной были рассчитаны фармакокинетические параметры (табл.
2,3). Представленные данные показывают тримодальное
распределение группы обследуемых по периоду полувыведения, значениям констант элиминации и количеству свободно-выведенного лекарственного препарата. Эти результаты позволяют
определить генетически обусловленный уровень ^ацетил-трансферазной активности индивидуальных пациентов. По данным о количестве выводимого тест-препарата за 6 часов по сравнению с полученной дозой лекарственного вещества видно, что менее 1%
Рис. 1 - Спектр поглощения дибензо-фуроксанового производного
сульфадимезина (510-5 моль/л)
составляют сверхбыстрые ацетиляторы, от 1 до 3% - быстрые ацетиляторы, от 3% и более -медленные ацетиляторы (рис. 2,3).
Полученные кинетические данные по моче и слюне коррелируют между собой. Таким образом, с разработанного неинвазивного метода определения Ы-ацетилтрансферазной активности в слюне человека можно разделить группы обследуемых
Биологические объекты Введено сульфадимезина, мкг/мл Найдено сульфадимезина, Эг
2,78 0,04
Моча 5,56 5,4±0,06 0,04
13,9 13±0,09 0,05
2,78 2,7±0,08 0,05
Слюна 5,56 5,5±0,1 0,05
13,9 13,3±0,07 0,04
пациентов по фенотипу ацетилирования (рис. 4).
Таблица 1 - Результаты спектрофотометрического определения сульфадимезина в моче и слюне
Фенотип сверхбыстрого ацетилирования, формируется в результате процессов адаптации организма к физическим, мышечным нагрузкам, что было показано в [13].
Рис. 2 - Кривые кумулятивного выведения сульфадимезина с мочой: 1 -медленный; 2 - быстрый; 3 -
сверхбыстрый ацетиляторы,
(стрелками обозначен доверительный интервал определяемых значений)
Рис. 3 - Уровень содержания сульфадимезина в слюне: 1 -медленный; 2 - быстрый; 3 - сверхбыстрый ацетиляторы
Результаты определения фенотипа ацетилирования при контроле содержания сульфадимезина в виде дибензофуроксанового производного были сопоставлены с результатом при спектрофотометрическом определении гидразида изоникотиновой
Кинетические параметры Сверхбыстрые ацетиляторы (4 пациента) Быстрые ацетиляторы (21 пациент) Медленные ацетиляторы (15 пациентов)
Уровень содержания сульфадимезина в слюне через 1 час, мкг/мл 1±0,3 2±0,5 7±2,5
Уровень содержания сульфадимезина в слюне через 2 часа, мкг/мл 1,2±0,5 2,7±0,3 7±2
Уровень содержания сульфадимезина в слюне через 3 часа, мкг/мл 1,2±0,5 2,5±0,5 7±2
кислоты по реакции с ванадатом аммония [14]. Была модифицирована методика
Таблица 3 - Параметры выведения сульфадимезина со слюной при пероральном приеме 0,5 г лекарственного вещества
Кинетические Сверхбыстрые Быстрые Медленные
параметры ацетиляторы ацетиляторы ацетиляторы
(4 пациента) (21 пациент) (15 пациентов)
Количество выводимого
за 6 часов лекарственного 0,7±0,2 2,1±0,5 6,5±2
вещества, % от дозы
Максимальное
выведенное за 6 часов 4±2 12±3 33±10
количество препарата, мг
Тангенс угла наклона
ф ар макокинетических 0,7±0,2 2±0,5 5±1,5
кривых, tg а
определения изониазаида в слюне, а именно, условия проведения пробоподготовки слюны. Уменьшен объем отбираемой слюны человека, а также для осаждения белков в слюне использовали 10% трихлоруксусную кислоту, в результате этого было сокращено время центрифугирования.
Кинетические Быстрые Медленные
параметры ацетиляторы (30 пациентов) ацетиляторы (20 пациентов)
Уровень содержания
изониазида через 2 1,4±1 9,1±5
часа, мкг/мл
Уровень содержания
изониазида через 4 2±1,3 8,2±3
часа, мкг/мл
Уровень содержания
изониазида через 6 2±1,4 6,3±2
часов, мкг/мл
Таблица 5 - Параметры экскреции изониазида со слюной при пероральном приеме 0,5 г лекарственного вещества
Кинетические параметры Быстрые ацетиляторы (30 пациентов) Медленные ацетиляторы (20 пациентов)
Количество выводимого за 6 часов лекарственного вещества, % от дозы 0,1 - 4,6 5,8 - 12,3
Рис. 4 - Гистограмма
тримодального распределения пациентов: 1 - медленный тип
(38,3%); 2 - быстрый тип (56,3%); 3 - сверхбыстрый тип (5,4%)
Кинетические параметры, полученные обоими методами для идентификации фенотипа ацетилирования по моче и слюне, полностью коррелируют между собой (табл. 4 и табл. 5).
Из табл. 5 видно, что меньшему процентному значению количества выведенного изониазида соответствует низкое содержания его в слюне, и, наоборот, большему значению - высокое содержание препарата в течение первых 3 часаов измерения.
Рис. 6 - Гистограмма бимодального фенотипического распределения
пациентов: 1 - медленный тип (40%); 2 -быстрый тип (60%)
Рис. 5 - Уровень содержания ГИНК в слюне: 1-медленный; 2 - быстрый
На рис. 5 представлены кинетические кривые выведения изониазида в слюне испытуемых. Процентное отношение быстрых и медленных типов ацетилирования представлены на гистограмме (рис. 6).
Таким образом, предложенный метод спектрофотометрического определения сульфадимезина в слюне человека позволяет определять фенотип ацетилирования по кинетике выведения тест-препарата в биологических жидкостях.
Экспериментальная часть
Спектрофотометрические определения проводились на спектрофотометре СФ-26. Синтез 4-хлор-5,7-динитробензофуразана, 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана проведен доц. Ф.С. Левинсоном по методике [9-12]. В качестве тест-препаратов использовались сульфадимезин и изониазид в виде таблеток по 0,5 и 0,3 г соответственно. Фенотип ацетилирования определялся в группе обследуемых из 85 человек.
Литература
1. Середенин С.Б. // Генетические механизмы индивидуальной чувствительности к
лекарственным средствам: Доклад на I Международной конференции "Клинические
исследования лекарственных средств", г. Москва, 2002 г.
2. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений. М.: Медицина, 1982. 347 с.
3. D.E., ReidenbergММ.//Clin. Pharmacol. Ther. 1977. № 22. P.251-258.
4. Kalow W.// Clin. Phamiacokin. 1982; №7. P. 373-400.
5. Hein D. W.II Toxicology Letters, 2000, V. 112-113. P. 349 - 356.
6. Weber W. W. Pharmacogenetics. New York-Oxford: Oxford University Press, 1997.
7. МисийчукЮ.И., Терещенко Г. Ф., Лебедев Г.П. и др.II Экологическая химия. 1998. №7(1). С.42-47.
8. Холодов Л.Е., Яковлев В.П. Клиническая фармакокинетика. М.: Медицина, 1985.
9. Buncel E, Renfrow R.A. II J. Org. Chem. 1987. V.52. P. 103-121.
10. Шарнин Г.П., Левинсон Ф.С., Акимова С.А., Хасанов Р.Х. Способ получения 4-хлор-5,7-динитробензофуразана. А.С. 657025 (СССР)!! опубл. БИ № 14. 1979.
11. Шарнин Г.П., Левинсон Ф.С., Акимова С.А., Хасанов Р.Х. Способ получения 4-хлор-7-
нитробензофуразана. А.с. 1004375 (СССР). Опубл. БИ № 10. 1983.
12. Bailey A.S., Case J.R. II Tetrahedron. 1958. V.3. P. 113-131.
13. Джорджеску П., Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест: Медицинское изд-во, 1963.
14. Абзалов Р.А., Нигматуллина Р.Р., Хайруллина Т.Н., Гармонов СЮ., Шакирова Л.Ш., Евгеньев М.И.// Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2000. Т. 130. N12. С. 620.
© М. И. Евгеньев - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; С. Ю. Гармонов - канд. хим. наук, доц. той же кафедры; Л. А. Зайнутдинов -асп. той же кафедры.
