CC BY
88
НОВЫЕ МЕТОДЫ И ИНСТРУМЕНТЫ
УДК 616. 316 — 008. 8 — 615. 28 : 615. 036. 8 : 575. 21 : 577. 152. 211
НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЙ БИОХИМИЧЕСКОГО ФЕНОТИПА АЦЕТИЛИРОВАНИЯ
М.И. Евгенъев, С.Ю. Гармонов, A.A. Зайнутдинов, Т.Г. Маланичева
Кафедра аналитической химии (зав. - проф. В.Ф. Сопин) Казанского государственного технологического университета, кафедра детских болезней (зав.- проф. В.В. Сафронов) Казанского государственного медицинского университета
Биохимическая индивидуальность организма человека обусловливает значительные различия в действии лекарств при фармакотерапии. Попу-ляционные исследования определения фенотипа в значительной степени повышают эффективность курсовой фармакотерапии, позволяют сократить число побочных эффектов при ее проведении. Доказано, что в различных популяциях имеется строго определенное соотношение биохимических фенотипов [13, 16]. Паспортизация населения по этим признакам необходима с целью как обеспечения безопасности и эффективности лечения, так и проведения профилактических мероприятий [5].
Процессы ацетилирования занимают одно из центральных мест в обмене веществ. Ацетилиро-вание рассматривается как генетически детерминированная способность организма метаболизи-ровать соединения, содержащие в своей молекуле аминогруппы [4]. Лица с медленным типом ацетилирования (медленные ацетиляторы) являются гомозиготами для аутосомного рецессивного гена, а быстрые ацетиляторы — гомозиготами или гетерозиготами для доминантного гена. В зависимости от скорости ацетилирования в человеческой популяции выделяются две группы. К одной из них относятся лица, метаболизиру-ющие тест-препараты с высокой скоростью (быстрое ацетилирование), к другой — с низкой скоростью процесса (медленное ацетилирование)
[11, 14].
В клинической фармакологии статус ацети-лирования чаще всего используется в качестве фенотипического маркера, позволяющего прогнозировать риск возникновения нежелательных побочных эффектов лекарственных средств [1]. Принадлежность индивидуума к той или иной группе ацетиляторов также является одним из факторов, который обусловливает различную устойчивость к заболеваниям. Так, показано, что быстрый тип ацетилирования характерен для больных сахарным диабетом как I, так и II типа [12, 15], для детей со спаечной болезнью после полостных операций, также для больных с благоприятным течением экземы [б]. Превалирование медленного типа ацетилирования описано у
СНз V-N
bN
СНз
NH2 + с
тех больных туберкулезом, у которых изониазид вызывал побочные реакции [10]. Этот же фенотип отмечен при остром вирусном гепатите В и у больных ревматоидным артритом, системными заболеваниями соединительной ткани [3, 7], в частности лекарственной или системной красной волчанкой [17].
Цель данной работы: разработка экспрессного, высокоизбирательного и чувствительного не-инвазивного метода определения фенотипа аце-тилирования и его клиническая апробация.
В качестве тест-препаратов использовались сульфадимезин и изониазид в виде таблеток соответственно по 0,5 и 0,3 г. Фенотип ацетилирования определялся у 80 вариабельно отобранных пациентов от 20 до 30 лет без заболеваний печени и почек.
При оценке типа ацетилирования критерием фенотипирования служило значение фракции дозы свободного лекарственного вещества, выводимого с мочой или слюной. Для этого содержание свободно выводимого тест-препарата находили в почасовых пробах мочи и слюны в течение 7 часов после приема лекарственного средства. Растворами сравнения служили пробы мочи и слюны до приема препарата.
Определение сульфадимезина в моче при использовании реагента 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (БФО). Синтез БФО был проведен доц. Ф.С. Ле-винсоном [8, 9]. Мочу разбавляли в 25 раз, затем отбирали аликвоту 5 мл, добавляли 0,5 мл раствора 10% трихлоруксусной кислоты, 0,5 мл БФО, 1 мл ацетатного буфера (0,05 моль/л, рН 5,5). Далее измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм.
Определение сульфадимезина в слюне при использовании реагента БФО. Отбирали 1 мл слюны, добавляли 1 мл воды, затем 1 мл 10 % раствора сульфата цинка и 1 мл 0,75 М гидроксида натрия. Центрифугировали 10 минут при 9000 об/мин. Далее отбирали 3 мл надосадочной жидкости, добавляли 1 мл фосфатного буфера (рН 6,86), 0,5 мл БФО. Измеряли оптическую плотность при длине волны 500 нм.
Для повышения избирательности и чувствительности определения тест-маркеров фенотипа ацетилирования использовалась реакция дерива-тизации сульфадимезина с помощью БФО:
\\ //
NO2
NO2
■HCl
СН
СНз_ А
СНз NO2
-INO2
Казанский медицинский журнал, 2004 г., том 85, № 5.
Таблица 1 Кинетические параметры выведения сульфадимезина с мочой при пероральном приеме в дозе 0,5 г (различия между показателями быстрого и медленного ацетилирования достоверны при р<0,01)
Кинетические параметры Быстрые ацетиляторы (25 чел.) Медленные ацетиляторы (15 чел.)
Количество выводимого за 6 ч лекарственного вещества в % от дозы 2,1 0,4 6,5 2,0
Максимальное выведенное за 6 ч количество препарата, мг 12,0 3,0 33,0 10,0
Тангенс угла наклона фар-макокинетических кривых 2,0 0,5 5,0 1,0
Таблица 2
Параметры выведения сульфадимезина со слюной при пероральном приеме в дозе 0,5 г (различия между показателями быстрого и медленного ацетилирования достоверны при р<0,01)
Уровень содержания сульфадимезина в слюне, мкг/мл Быстрые ацетиляторы (25 чел.) Медленные ацетиляторы (15 чел.)
Через 1 ч 2,0 0,5 7,0 2,5
Через 2 ч 2,7 0,3 7,0 2,0
Через 3 ч 2,5 0,5 7,0 2,0
При этом интенсивно окрашенный продукт аналитической реакции обусловливает чувствительность спектрофотометрического детектирования лекарственного вещества в биологических жидкостях. По максимуму спектра поглощения была найдена оптимальная длина волны, соответствующая 490 нм. Были подобраны оптимальные значения рН и состав среды (использовали фосфатный буфер с рН 6,86), количественное завершение аналитической реакции происходит в полярных средах. Эти условия проведения анализа позволили селективно и чувствительно определить содержание сульфадимезина в моче и слюне человека методом прямой спектрофото-метрии в видимой области спектра (табл. 1).
Определение изониазида в моче при использовании реагента ванадата аммония. К 0,3 мл мочи добавляли 2 мл ванадата аммония и доводили объем до 10 мл, далее измеряли оптическую плотность при длине волны 420 нм.
Определение изониазида в слюне при использовании реагента ванадата аммония. Отбирали 2 мл слюны, добавляли 1 мл 10% раствора сульфата цинка, центрифугировали 10 минут при 9000 об/мин. Далее отбирали 1 мл надосадочной жидкости, добавляли 1 мл воды и 2 мл ванадата аммония. Измеряли оптическую плотность при длине волны 420 нм.
По экспериментальным данным элиминирования сульфадимезина мочой и слюной были рас-
Таблица 3
Параметры выведения изониазида с мочой при пероральном приеме в дозе 0,5 г при спектрофотометрическом детектировании производного с ванадатом аммония
Уровень содержания изониазида в моче, мкг/мл Быстрые ацетиляторы (25 чел.) Медленные ацетилято-ры
Через 2 ч 1,5 ,0 9,1 4,5
Через 4 ч 2,5 ,3 8,5 3,0
Через 6 ч 2,0 ,5 6,3 1,0
Рис. 1. Кривые кумулятивной экскреции сульфадимезина в моче.
Рис. 2. Уровень содержания сульфадимезина в слюне.
Обозначения: 1— медленные ацетиляторы, 2 — быстрые ацетиляторы. Стрелками обозначен доверительный интервал определяемых значений, полученных при спект-рофотометрическом детектировании динитробензофурок-санового производного сульфадимезина.
считаны его фармакокинетические параметры (табл. 2).
Представленные данные демонстрируют бимодальное распределение группы обследованных по периоду полувыведения, значениям констант элиминации и количеству свободно-выведенного лекарственного препарата. Эти результаты позволяют оценить генетически обусловленный уровень Ы-ацетилтрансферазной активности индивидуальных пациентов. По данным о количестве выведенного за 6 часов тест-препарата от полученной дозы лекарственного вещества видно, что среди обследованных от 1 до 3% составляют быстрые ацетиляторы, от 3% и более — медленные (рис. 1, 2).
Полученные кинетические данные о моче и слюне коррелируют между собой. Таким образом, с помощью разработанного неинвазивного метода определения Ы-ацетилтрансферазной активности в слюне человека можно произвести разделение групп пациентов по фенотипу ацетилирова-ния (рис. 3).
Результаты выявления фенотипа ацетилиро-вания при контроле содержания сульфадимезина в виде динитробензофуроксанового производного были сопоставлены с таковыми, полученными по методу, включающему определение гид-разида изоникотиновой кислоты по реакции с ванадатом аммония в слюне человека [2]. Для этого метод определения изониазида в слюне был модифицирован, а именно изменены условия под-
Казанский медицинский журнал, 2004 г., том 85, N 5.
Рис. 3 Гистограмма бимодального фенотипического распределения пациентов (в %), полученная по параметрам выведения сульфадимезина и изониазида в слюне: 1) медленный тип (37,5%), 2) быстрый тип (62,5%).
! I I I
Рис. 4. Уровень содержания изониазида в слюне: 1 -медленные ацетиляторы, 2 - быстрые ацетиляторы. Стрелками обозначен доверительный интервал определяемых значений.
готовки пробы слюны. Уменьшение объема отбираемой слюны, а также использование для осаждения белков 10% трихлоруксусной кислоты позволили сократить время центрифугирования и обеспечить экспрессность аналитических процедур. Кинетические параметры, полученные обоими методами при идентификации фенотипа аце-тилирования по моче и слюне, полностью коррелируют между собой (табл. 3). Параметры экскреции изониазида со слюной при пероральном приеме 0,5 г лекарственного вещества за 6 часов в процентах от дозы составили для быстрых аце-тиляторов (30 чел.) 0,1-4,6, а для медленных (20 чел.) - 5,8-12,3.
По представленным данным видно, что меньшему процентному количеству выведенного изо-ниазида соответствует низкое содержание его в слюне у быстрых ацетиляторов, и наоборот, большему значению — высокое содержание препарата в первые 3 часа измерения у медленных ацети-ляторов. На рис. 4 представлены кинетические кривые выведения изониазида в слюне обследованных. Процентное соотношение быстрых и медленных типов ацетилирования представлено на гистограмме (рис. 3).
Таким образом, предложенный метод определения фенотипа ацетилирования при исследовании фармакокинетики сульфадимезина в слюне человека позволяет точно диагностировать при-
надлежность индивидуума к той или инои группе ацетиляторов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Викторов А.П., Короткий В.П., Голопыхо Л.И., Коржик Н.П. // Клиническая хирургия. - 1990. -№ 9. - С. 74.
2. Джорджеску П., Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. -Бухарест, 1963.
3. Ермакова Т.М., Ковалева В.М., Брежнева Е.Т., Евстафьева О.Е.// Педиатрия. - 1983. - № 1. - С. 10-13.
4. Парк Д.В. Биохимия чужеродных соединений.- М. 1982.
5. Середенин С.Б. Фармакологическая защита генома. / С.Б. Середенин, А.Д. Дурнев.-М., 1992.
6. Тихонова В.А., Лукина В.В., Борисенко Г.Н., Булавская Л.Н.// Сб. научн. работ. - Саратов, 1993.-С. 44-47.
I. Astbufy С., Beyeler С.// Rheumat. - 1995. -Vol.14. - P. 257-260.
5. Bailey AS., Case J.R. // Tetrahedron. - 1958. -Vol. 3. - Р. 113-131.
9. Buncel Е., Renfrew R.A.// J. Org. Chem. - 1987. -Vol.52. - P. 103-121.
10. Donald P., Sirgel F. et all// din. Pharmacol. Ther. -1997. - Vol. 3. - P. 895-900.
II. Drayer D.E., Reidenberg M.M.// Clin. Pharmacol. Ther. - 1977. - Vol. 22. - P. 251-258.
12. Hadasova E., Brysova V., Kadicakova E.// Europ. J. Clin. Pharmacol. - 1990. -Vol.39.-P. 43-47.
13. Нет D. W.// Toxicology Lett. - 2000. -Vol. 112-113. -P. 349.
14. Kalow W.// Clin. Phamacokin. - 1982. - Vol. 7. -P. 373-400.
15. Mrozikiewicz P., Drakoulis N., Roots I.// Clin. Pharmacol. Ther. - 1994. -Vol.56.-P. 626-634.
16. Nebert D. W., Roe A.L.// The Science of the Total Environment. - 2001. -Vol.274.-P.93.
11. Yung R., Johnson К., Richardson В.// Labor.Invest -1995. -Vol. 73. - P. 746.
Поступила 15.04.04.
NONINVASIVE METHOD OF DETERMINATION OF BIOCHEMICAL PHENOTYPE OF ACETYLATION
M.I. Evgenyev, S.Yu. Gormonov, L.A. Zainutdinov, T.G. Malanicheva
S u m m a r y
Express highly sensitive noninvasive method of pharmaceutical analysis of biochemical phenotype patterned after acetylation are developed. Phenotype diagnosis method is based on comparative characteristics of pharmacokinetic parameters of test drugs of sulfadimidine and isoniazid with urine and saliva of individual paients. The methods developed can be used to correct doses of medications in therapy and to decrease side effects.
I
J
