CC BY
89
С. Ю. Гармонов, З. Ч. Нгуен, И. Ф. Мингазетдинов, Л. М. Юсупова,
Н. С. Шитова, Р. Н. Исмаилова, В. Ф. Сопин
СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 5-АМИНОСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЕЕ ЭКСКРЕЦИИ ИЗ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА
Ключевые слова: 5-аминосалициловая кислота, моча, спектрофотометрия.
Установлены условия спектрофотометрического определения месала-зина в моче при использовании 5,7-дихлор-4,6-динитробензофураксана и 7-хлор-
4,6-динитробензофуроксана как аналитических реагентов. Оптимальные результаты определений достигаются при длине волны 500 нм и pH 6-8. Предел обнаружения месалазина составляет 0,31 мкг/мл. Показана возможность использования разработанных методик для оценки индивидуальных фенотипов метаболизма процессов ацетилирования месалазина у человека.
Keywords: 5-aminosalicilic acid, urine, spectrophotometry.
The condition of spectrophotometric determination of mesalazine in the urine are established with 5,7-dichlorine-4,6-dinitrobenzofuroxan and 7-chlorine-4,6-dinitrobenzofuroxan application as analytical reagent. The optimal result of the determination are observed at the wavelength of 500 nm and pH 6-8. The detection limit of mesalazine is 0,31 mcg/ml. The possibility of the applicated the developed methodology was demonstrated for the diagnostic of individual phenotypes of acety-lation processes mesalazine in humans.
Одной из важных проблем фармацевтической химии, которая возникает при обеспечении безопасного и эффективного применения лекарственных средств (ЛС), является подбор индивидуальных терапевтических доз для каждого больного. В связи с этим весьма актуальной является оценка активности ферментативных систем организма человека, отвечающих за процессы биотрансформации лекарственных веществ (ЛВ).
Метаболизм лекарственных средств (ЛС) осуществляется путем реакций химической модификации (фаза I - окисление, восстановление, гидролиз) и конъюгации с эндогенными соединениями (фаза II - ацетилирование, сульфатация, глюкоронизация) при участии различных ферментов. Для фармакокинетических исследований генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ в организме человека путем N-ацетилирования нашли применение вещества, содержащие аминные функциональные группы (гидразиды кислот, производные изоникотиновой и п-аминобензойной кислот, сульфаниламиды и др.), для которых показано бимодальное распределение у населения и сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, различающиеся генетически детерминированной индивидуальной активностью N-ацетилтрансферазы гепатоцитов [1,2].
Месалазин (месаламин, 5-аминосалициловая кислота) находит применение для лечения воспалительных заболеваний кишечника, особенно неспецифического язвенного колита и болезни Крона [3,4]. Для этого часто используются препараты как на основе суб-
станции месалазина, так и его пролекарств (сульфасалазин, олсалазин, балсалазид) (рис. 1). Однако применение пролекарств месалазина весьма ограничено из-за большого количества побочных эффектов при их применении (лекарственные гепатиты, синдром Стивена-Джонсона, гемолитическая анемия, интерстициальный нефрит и др.), в формирование которых вносят вклад и особенности генетического статуса пациента [3,4].
В организме под действием ацетилирующих ферментов месалазин метаболизирует-ся, образуя N-ацетилмесалазин (Ы-ацетил-5-аминосалициловую кислоту). При этом биотрансформация месалазина в организме человека контролируется ферментами N-ацетилтрансферазы 1-го типа (NAT1) и 2-го типа (NAT2). Тем не менее, неизвестно какой именно из этих ферментов играет ключевую роль в N-ацетилировании месалазина [5]. В тоже время для оптимизации режимов дозирования, предотвращения побочных эффектов необходимы способы оценки фенотипов ацетилирования при использовании месалазина как фармакогенетического маркера. При этом выбор надлежащего аналитического метода для количественного определения месалазина в биологических образцах играет важную роль в оценке и интерпретации его биодоступности, биоэквивалентности и индивидуальных различий в фармакокинетических данных.
Для количественного определения месалазин и его метаболита в различных биологических матрицах описаны спектрофотометрические [6] и хроматографические методы анализа [7-13]. Однако в настоящее время в литературе не представлены спектрофотометрические способы оценки интенсивности процессов ацетилирования месалазина при его экскреции с мочой.
В связи с этим проведение исследований по разработке простых, избирательных, экспрессных и точных методик спектрофотометрического определения месалазина в биологических объектах являются весьма актуальными. Цель работы состояла в изучении возможности оценки фенотипа ацетилирования при выведении месалазина с мочой человека спектрофотометрическим методом анализа при использовании 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (хлорБФО) и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана как реагентов (дихлорБФО).
Экспериментальная часть
Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26, оптическую плотность исследуемых растворов в видимой области измеряли в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Синтез хлорБФО и дихлорБФО проведен Л.М. Юсуповой [14, 15]. Использованы субстанция месалазина (Alfa Aesar, Германия) и его лекарственная форма - таблетки месакола, покрытые кишечнорастворимой оболочкой по 400 мг (SUN Pharmaceutical Industries Ltd, Индия).
Методика определения. Для определения содержания месалазина в мерную колбу объемом 10 мл отбирают 0,5 мл образца анализируемой мочи, добавляют 0,5 мл диметилсульфоксида, 0,15 мл 0,02 М раствора хлорБФО (дихлорБФО), 2 мл фосфатного буферного раствора (0,2 М) и доводят дистиллированной водой до метки. Для приготовления раствора сравнения используется образец мочи до приема тест-препарата и все компоненты, кроме реагента, добавляются так же, как и в исследуемый раствор. Через 5 мин после приготовления растворов измеряется их оптическая плотность при длине волны 500 нм и толщине кюветы 1 см. Количество выведенного месалазина определяют по градуировочному графику.
Результаты и их обсуждение
Наиболее распространенным в клинической практике методом детектирования содержания тест-препаратов ацетилирования и их метаболитов благодаря универсальности и невысокой стоимости является спектрофотометрия. Однако, в этих случаях для достижения избирательности аналитических определений ЛВ в биологических матрицах важным условием является проведение реакций, протекающих с образованием окрашенных соединений.
Взаимодействие месалазина с 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксаном и 7-хлор-
4,6-динитробензофуроксаном в полярных средах приводит к образованию интенсивно окрашенных в красный цвет устойчивых продуктов реакции:
02N Q2n
На рис. 2 представлены спектрально-аналитические характеристики растворов 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана, 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана, а также продуктов их взаимодействия с месалазином. Полосы поглощения продуктов реакции месалазина с реагентами имеют сдвиг в сторону больших длин волн, чем для самих аналитических реагентов соответственно. Кроме того, в случае продукта реакции месалазина с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном достигаются более высокие значения интенсивности поглощения. На рис. 3 представлены спектры поглощения растворов 7-хлор-4,6-
динитробензофуроксана, смеси 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с мочой и продукта реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с месалазином. Из представленных спектрально-
аналитических данных видно, что в условиях анализа при ^=500 нм, влияние реагента и мочи на полосы поглощения продукта аналитической реакции весьма незначительно. Как показали проведенные эксперименты, его можно полностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при спектрофотометрическом детектировании.
Рис. 2 - Спектры поглощения: 1 - 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10"4М) в ацетонитриле, 2 - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в ацетонитриле, 3 - производного месалазина (3*10-5М) и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4М), 4 -производного месалазина (3*10-5М) и 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в смеси диметилсульфоксид - вода (5:95 % об.), рН=6,8. /=1 см
A
Рис. 3 - Спектры поглощения: 1 - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в ацетонитриле, 2 - производных компонентов мочи и 7-хлор-4,6-
динитробензофуроксана (1,5*10-4М), 3 - 4,6-динитробензофуроксанового производного месалазина (3*10-5 М) в смеси диметилсульфоксид - вода (5:95 % об.), pH=6,8. /=1 см
Было установлено, что используемые добавки органических растворителей при проведении аналитической реакции существенно влияют на устойчивость 4,6-динитропроизводного месалазина и интенсивность его полосы поглощения (рис. 4). Как видно, максимальное светопоглощение наблюдается при использовании смеси димети-сульфоксид - вода (5:95 % об.), что может быть связано с обеспечением оптимальной растворимости продукта реакции. Ранее было установлено, что в зависимости от pH среды
4,6-динитобензофуроксановые ароматических аминов в водных растворах могут существовать в виде различных форм, обусловленных проявлением ЫН-кислотности соединений [15]. В связи с этим было исследовано влияние рН на интенсивность полосы поглощения продукта реакции (рис. 5). Как видно, наиболее полное образование производного и максимальная интенсивность светопоглощения наблюдается в интервале pH 6-8, причем в этом интервале максимум поглощения соответствует аналитической длине волны 500 нм.
Рис. 4 - Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых производных месалазина (3*10"5 М): 1 - в воде; 2 - в смеси этанол-вода (30:70, об. %), 3 - в смеси ацетонитрил-вода (30:70, об.%), 4 - в смеси диметилсульфоксид-вода (30:70, об. %), 5 - в смеси диметилсульфоксид-вода (5:95, об. %), рН=6,8, /=1 см
Рис. 5 - Зависимость оптической плотности от рН при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) и месалазина (3*10-5 М) в смеси диметилсуль-фоксид-вода (5:95 об. %), Х=500 нм, /=1 см
Оптимальную концентрацию реагента при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с месалазином определяли экспериментально. Как видно из дан-
ных, представленных на рис. 6, при двукратном и более избытке реагента достигается полное количественное завершение аналитической реакции.
А
С(реагент)/С(месалазин)
Рис. 6 - Влияние концентрации реагента 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана на аналитический сигнал при проведении реакции с месалазином (3*10- М) в смеси диме-тилсульфоксид-вода (5:95 об. %), А=500 нм, /=1 см
При этом хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации месалазина линейны и подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера для области концентраций 0,32 - 4,6 мкг/мл:
А = 0,1594Сх (мкг/мл)+0,0012 (Н2 = 0,9994; П=12).
Предел обнаружения месалазина, опредленный по 3Э критерию, при указанных условиях спектрофотометрического определения достигает 0,3 мкг/мл, что ниже интервала фармакокинетических концентраций лекарственного вещества.
Правильность определения месалазина в моче была оценена методом введено - найдено. Полученные данные свидетельствовали, что при выбранных условиях детектирования 4,6-динитробензофуроксанового производного месалазина компоненты мочи не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения аналита.
С помощью разработанной методики избирательного спектрофотометрического определения месалазина в моче была проведена оценка его количества при выведении с мочой из организма человека. Кинетические кривые экскреции лекарственного вещества с мочой приведены на рис. 7. За 10 часов исследования было выведено 1,6 % (12,89±1,12 мг) свободного месалазина у пациентов с медленным фенотипом ацетилирования, а у лиц с быстрым фенотипом ацетилирования 0,8 % (6,43±0,51 мг) соответственно. Эти результаты согласуются с литературными данными, где количество месалазина, выведенное с мочой составляет около 3-6 % за 72 часа [4]. Установление количества выводимого месалазина в процентах от вводимой дозы (фракции дозы) позволяет судить о фенотипе ацетилирования обследуемых. При этом уровень выводимого неизменным месалазина для быстрых и медленных ацетиляторов различается в два раза.
Таким образом, разработанные методики в дальнейшем можно использовать в клинической практике для определения фенотипа ацетилирования пациентов при использовании месалазина в качестве тест-препарата процессов ацетилирования.
1,8 -,
0,6 -
0,4 -0,2 -oi
1,6 -
1,4 -
1,2 -1 -
0,8 -
f, час
О
2
4
6
8
10
12
Рис. 7 - Кинетические кривые выведения свободного месалазина с мочой. Медленый фенотип ацетилирования (1), быстрый фенотип ацетилирования (2). Прием месалазина в разовой дозе 800 мг в виде лекарственной формы месакола
1. Кукес В.Г., Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В.. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 293 с.
2. Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И., Зыкова И.Е., Аналитические методы исследования генетического полиморфизма организма человека, в кн. «Проблемы аналитической химии. Т.11. Химический анализ в медицинской диагностике». - М.: Наука, 2010.- С. 21-65.
3. Javier P.G., Fernando G., JoséM., JoséM.P. Digestive //Diseases and Sciences. - 2002. - V. 47. - № 3. - Р. 471 - 488.
4. Sandborn W.J., Hanauer S.B. // Aliment Pharmacol Ther .- 2003. - V. 17. - Р. 29- 42.
5. HendirkL., Martina K, Alexander J., Uwe F., Fritz S. // Eur J Clin Pharmacol.- 2009. - V. 65. - Р. 47- 54.
6. PieniaszekHJ.Jr., Bates TR.//Res Commun Chem Pathol Pharmacol. - 1975. - V. 12. - № 3. - Р. 571 - 581.
7. Jette T,. Steen H.H. // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1991. - V. 570. -№ 1. - Р.109 -117.
8. Palumbo G., Carlucci G., Mazzeo P., Frieri G., Pimpo MT., Fanini D. // J Pharm Biomed Anal. - 1995. - V. 14. - № 1-2. - Р.175 -180.
9. Hussain F. N., Ajjan R. A., Moustafa M., Anderson J. C., Riley S. A. // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1998. - V. 716. - № 1-2. - Р.257 -266.
10. Beata B., Jolanta N., Jerzy B. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2000. - V. 22. - № 2. -Р.341 -347.
11. Giancarlo P,et al. // Biomed. Chromatogr. - 2005. - V. 19. - Р.350 -354.
12. Nobilis M. et al. // Journal of Chromatography A. - 2006. - V. 1119. - Р.299 -308.
13. Elisabetta P., Marcello L., Patrizia S., Giulia R., Enrico R., Aldo R. // Journal of Chromatography B. - 2008. -V. 872. - № 1-2. - Р.99 -106.
14. BaileyA.S., Case J.R, Tetrahedron. - 1958. - V. 3. - Р.113 -131.
15. Шарнин Г.П., Левинсон Ф.С., Акимова С.А. А.С. 657025 (СССР). - 1979. - V. 14.
16. ЕвгеньевМ.И., Гармонов СЮ., ШакироваЛ.Ш., БрысаевА.С. // Хим.-фарм. журн. . - 1999. - V. 33. - № 5. - Р.50 -53.
© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ, serggar@mail.ru; З. Ч. Нгуен - асп. той же кафедры; И. Ф. Мингазетдинов -студ. КГТУ; Л. М. Юсупова - д-р хим. наук, проф. каф. химии и технологии органических соединений азота КГТУ; Н. С. Шитова - канд. хим. наук, доцент ОПП ЦМД КГТУ; Р. Н. Исмаилова -канд. хим. наук, доц. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; В. Ф. Сопин - д-р хим. наук, проф. зав. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ.
Литература
