CC BY
26УДК 619:616-001.28/.29:579.577.114:615.37
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОЗАЩИТНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ B.BIFIDUM И E.COLI В СОЧЕТАНИИ С БИОПОЛИМЕРОМ И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ НА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Г.В.Конюхов - доктор биологических наук, профессор, зав. отделом; Р.Н.Низамов - доктор ветеринарных наук, профессор; Т.Р.Гайнутдинов - кандидат биологических наук, вед.н.с.;
А.М.Идрисов - кандидат ветеринарных наук, ст.н.с.; М.М.Шакуров - кандидат биологических наук,
вед.н.с.; Д.Т.Шарифуллина - кандидат биологических наук, ст.н.с.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань (420075, г. Казань, Научныйгородок-2, тел. (843)239-53-19, e-mail: vnivi@mail.ru).
Предыдущими исследованиями было показано, что из испытанных 9 вариантов композиций на основе E.coli, B.bifidum, гидросиликата алюминия, гидроокиси алюминия и природного биополимера-хитозана из 2 композиций подмора пчел: 1) смесь культуральной жидкости и бактериальной массы E.coli в сочетании с апизаном и 2) смесь культуральной жидкости и бактериальной массы B.bifidum в сочетании с апизаном обладали высокой радиозащитной активностью, обеспечивая 65-75%-ную защиту летально облученных лабораторных животных от радиационной гибели. Указанные композиции имели различную радиозащитную эффективность при лечебном и профилактическом применении. Целью настоящих исследований явилось усовершенствование технологии получения радиопротектора на основе E.coli и B.bifidum в сочетании с биополимером и оценка его эффективности на сельскохозяйственных животных. Для конструирования композиционного радиопротектора на основе E.coli и B.bifidum, микроорганизмы выращивали на жидких питательных средах в течение 48 часов. Затем культуральные жидкости с биомассой смешивали в соотношении 1:1 и смесь высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса. Порошок смеси микроорганизмов разводили в физиологическом растворе с концентрацией 2^109 м.к./мл и добавляли в раствор, полученный по усовершенствованной технологии апизан из расчета 0,5 масс%. Полученный препарат названый нами РПКМ (радиопротектор композиционный микробный) подвергали лучевой стерилизации путем облучения гамма-лучами в дозе 2,0 кГр. После определения токсичности и безвредности препарата, его испытывали на радиозащитную активность в опытах на 9 овцах породы «Прекос». Терапевтическую активность препарата оценивали по клинико-гематологическим показателям и выживаемости животных. Установлено, что профилактическое (однократное подкожное введение препарата в дозе 5 мл) как за 24 ч , так и через 24 ч после облучения обеспечивало выживаемость 66,6% овец от радиационной гибели.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: радиозащитный препарат, культуральная жидкость, иммуномодуляторы, полисахариды, биополимеры.
Известно, что развитие лучевой болезни закономерно сопровождается количественными и качественными изменениями микрофлоры кишечника [7]. Анализ литературных данных, подтвердил основные закономерности изменения микрофлоры кишечника у облученных животных и позволил отметить некоторые важные особенности развития постлучевого дисбактериоза, характеризующегося уменьшения количества бифидобактерий и лактобактерий с одновременным увеличением содержания кишечной палочки, клостридий, протея и энтерококка в кишечнике.
При изучении различных аспектов механизма противолучевого действия отечественных и зарубежных препаратов накоплен значительный экспериментальный материал, свидетельствующий о способности веществ микробного происхождения повышать радиорезистентность организма млекопитающих к облучению [1, 5, 8,].
В процессе жизнедеятельности бифидобактерии и эшерихии на жидких питательных средах продуцируют уникальный набор биологически активных веществ:
ферменты, антигены, антибактериальные компоненты, энтеро-, экзотоксины и цитокины, обладающие радиозащитными свойствами при совместном и раздельном применении [4, 9, 13].
Биологически активные вещества с каждым годом приобретают все большее значение, а число промыш-ленно полезных видов микроорганизмов возросло в разы. Многие исследователи для защиты животных от облучения и лечения лучевой болезни применяли широкий спектр препаратов, в состав которых входят бактериальные антигены. Известна возможность повышения устойчивости организма к поражающему действию ионизирующей радиации с помощью вакцинных препаратов. При этом установлено, что противолучевой эффект - при использовании бактериальных и противовирусных средств как при профилактическом, так и лечебном применении [6], максимальный эффект наблюдается при использовании бактерий кишечно-ти-фозной группы [3]. Достаточно широким спектром использования вызывающим интерес в научных исследо-
ET ЕР ПИАРНЫЙ
Врач
ваниях является природный биополимер, полисахарид - хитозан, который находит практическое применение как иммуномодулятор [2, 12].
Исследованиями по апитерапии выявлено, что препарат, полученной на основе продуктов пчеловодства - апизан - природный биополимер, обладает иммуностимулирующим, иммуномодулирующим и радиопротекторным действиями, является наиболее перспективным иммуномодулятором, годным в употреблении в чистом виде, для него не требуется дополнительная обработка, он беспрепятственно проникает через все клеточные барьеры.
Выявлено, что механизм действия хитозана при радиационном поражении заключается в его способности ускорять начало и активность процессов восстановления кроветворной ткани. Учитывая вышесказанное и литературные данные о целесообразности и перспективности поиска биопрепаратов среди веществ природного происхождения и с учетом изложенного, нами проведены настоящие исследования, целью которых является разработка радиозащитного препарата на основе продуктов метаболизма B.bifidum и E.coli с природным биополимером.
Материалы и методы. С целью конструирования радиозащитного препарата на основе E.coli и B.bifidum, микроорганизмы выращивали на жидких питательных средах в соответствии с общепринятыми в микробиологической практики методами [11].
Получение биополимера-апизана осуществляли согласно методике С.В.Немцова и др. (2001) с нашими модификациями (Патент RU № 2256121 С 1) опубл. 10.07.2015 г. Бюл. № 19).
Конструирование радиозащитной композиции осуществляли путем подбора оптимальных соотношений компонентов микробного и антигенного происхождения. При составлении композиции учитывали совместимость, дисперсность, образования осадка, изменения цвета, концентрация PH, разбиваемость осадка и т.д.
Токсичность и безвредность препарата определяли согласно Р.В.Петрову [10]. Испытание лечебно-профилактического действия экспериментального образца композиции проводили на облученных в дозе 6,0 Гр овцах породы «Прекос», препараты вводились животным в дозе 5 см3 за 24 ч до и через 24 ч после облучения. Лечебно-профилактическую эффективность препарата оценивали по клинико-гематологическим показателям и 45 - суточной выживаемости опытных животных. Гематологические исследования проводили по общепринятой методике. Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке с использованием общепринятых биометрических методов с применением прикладных программ Microsoft Excel (2000).
Результаты исследований. На первом этапе экспериментально изучали компоненты композиционного радиозащитного препарата на основе E.coli, B.bifidum и биополимером-апизан.
Для конструирования композиционного препарата, тест микробы E.coli и B.bifidum выращивали на жидких питательных средах (МПБ и среда Блоурокка) в течение 42 часов. Затем культуральные жидкости с биомассой E.coli и B.bifidum после тщательного перемешивания в соотношении 1:1 высушивали в сушильном шкафу до постоянной массы. Порошковую смесь микроорганизмов разводили в физиологическом растворе в концентрации 2х109 м.к./мл и добавляли в раствор природный биополимер - апизан из расчета 0,5 мас.%.
Апизан получали согласно усовершенствованной нами технологии. Для этого хитин-содержа-щее сырье - подмор пчел вносили в инкубационную среду с культивируемым в ней сожительствующего микроорганизма - Medusomyces Gisevi, которой в процессе метаболизма синтезирует и продуцирует в культуральную жидкость уксусную, янтарную, глю-коновую, щавелевую, лимонную, яблочную, пирови-ноградную кислоты и ферменты: каталазу, липазу, протеазу и карбоксилазу. Содержащейся в подморе пчел хитин под воздействием указанных кислот подвергается естественному сукцинированию, декар-боксилированию и деацелированию, превращаясь в легкодоступную и высококачественную питательную субстанцию для клеток микроорганизма-продуцента - гидрофильный катионный биополимер - хитозан, представляющий собой аминополисахорид 2-ами-но-дуокси-в-Д-глюкан, являющийся высокоактивным стимулятором роста и развития клеток.
Далее изучали совместимость полученных компонентов. В качестве критериев совместимости служили: растворимость, появление или отсутствие запаха, изменение цвета, образование конгломератов или нерастворимых частиц, образование осадка.
Полученный препарат подвергали лучевой стерилизации путем облучения гамма-лучами 60Со в дозе 2,0 кГр.
Для испытания токсичности и безвредности использовали смесь растворенных препаратов из 3 ампул каждый, объединенных в стерильных условиях по 1 см3 из каждого флакона в отдельный флакон. Смесь препаратов тщательно перемешивали и вводили подкожно 20 белым мышам по 0,25 см3 справа и слева в области лопаток (из расчета 2 группы по 10 мышей на каждый препарат). Наблюдение вели в течение 16 сут, учитывая наличие или отсутствие реакции на препарат. По истечении данного срока гибели опытных животных не наблюдалось.
Для оценки радиозащитных свойств отобранных препаратов в качестве моделей были использованы с.-х. животные - 12 голов мелкого рогатого скота (овцы) обоего пола породы «Прекос», средней живой массой 48,5±2,0 кг, из которых 6 иммунизировали однократно, подкожно радиозащитными препаратами в дозе 5,0 см3, а 6 животных иммунизации не подвергали, они служили контролями (контроль облучения и биологический контроль). Иммунизацию проводили за 1 сут до облучения на гамма-установке «Пума» в дозе 6 Гр.
За всеми животными на протяжении опыта (45 сут) вели клиническое наблюдение. Критериями эффективности радиозащитных препаратов служили: выживаемость животных, клинико-гематологи-ческие показатели, срок падежа.
Результаты изучения радиозащитной активности использованных препаратов приведены в табли-
це 1. Из ее данных видно, что реакция животных на введение антигена характеризовалась незначительным (на 0,5-0,80С) повышением температуры тела в течение 2 сут после иммунизации. В дальнейшие сроки у облученных овец отмечено кратковременное повышение температуры тела до 400С с последующей гипотермией.
Таблица 1
Клинические показатели овец
Показатель Группа животных
Препарат на основе E.coli и апизана,облученные в дозе 6 Гр Препарат на основе B.bifidum и апизана, облученные в дозе 6 Гр Контроль, облученные в дозе 6 Гр
Появление первых клинических признаков, сут 4-5 5-6 2-3
Разгар ОЛБ, сут 16 15 12-14
Срок падежа, сут 24 25 20-22
СПЖ павших овец, сут 24 25 21
Выживаемость, % 66,6 66,6 0
Результаты наблюдения за овцами показали, что первые признаки лучевого поражения контрольной группы появились на 2-3, а у иммунизированных животных на 4-5 сут после облучения. Разгар острой лучевой болезни (ОЛБ) в контрольной группе наступал на 12-14, а в иммунизированной - на 15-16 сутки. У овец наблюдалась одышка, адинамия, а у некоторых - кровотечение из носа, содержание белка лейкоцитов, Т- и В-лимфоцитов, гемоглобина периферической крови овец превышало их значение у контрольных.
Общее клиническое состояние облученных животных в течение 9 сут после облучения не отличалось от такового необлученных. В дальнейшие сроки у облученных овец отмечено кратковременное повышение температуры тела до 400С с последующей гипотермией.
Результаты гематологических исследований показали, что количество гематокрита в крови иммунизированных и не иммунизированных облученных животных имело тенденцию к уменьшению, однако существенное его понижение отмечалось только у овец 3-й группы (контроль облучения), а наибольшее его снижение наблюдалось на 20 сут опыта и составило 84% от исходного показателя.
Установлено, что воздействие гамма-облучения в дозе 6,0 Гр вызывало изменение содержания субпопуляции лимфоцитов, однако степень нарушения ге-мопоэза зависела от предварительной иммунизации животных использованными антигенами (радиозащитными препаратами).
Количество содержания Т- и В-лимфоцитов снижалось равномерно, а на 14 сут после облучения наблюдалось максимальное снижение как Т-, так и В-лимфоцитов, снижение их от исходного уровня в 1 группе (препарат на основе E.coli и апизана) соста-
вило 1,8 и 1,7х109/л (Т - лимфоциты), 0,9 и 0,8х109/л (В - лимфоциты); во 2 (препарат на основе В.ЬМит и апизана) - эти показатели находились на низком уровне и составляли 0,6 и 0,4х109/л (Т - лимфоциты), 0,3 и 0,2х109/л (В - лимфоциты) в 3 (контроль облучения) Т - лимфоциты = 0,4 и 0,2х109/л; В - лимфоциты = 0,1 и 0,05х109/л, соответственно. Повышение данных показателей наблюдалось с 20 сут за исключением контроля облучения - они пали.
Количество красных кровяных клеток (эритроцитов) к концу исследований в иммунизированных группах составляло: 8,1 и 7,8х1012/л в 1 группе, во 2 - 7,8 и 5,5х1012/л; 8,3 и 8,5х1012/л в третьей группе, соответственно.
Тромбоциты в крови после облучения у иммунизированных животных неуклонно снижались, с максимумом на 14 сут их количество к данному спаду составляло 160х1012/л (1-я) и 125х1012/л (2-я), при 370 и 410х1012/л к исходным показателям. В дальнейшие сроки имелась тенденция к их повышению.
Падеж в контрольной группе наступал на 20-22 сут (СПЖ=21), а у опытных - на 24 и 25 сут, соответственно. При вскрытии у павших овец обнаруживались признаки ОЛБ (геморрагический синдром) - точечные кровоизлияния на слизистой кишечника и почек, отек легких. Селезенка была уменьшена в размерах, дряблая, с кровоизлияниями.
Заключение. Таким образом, в опытах на овцах установлена принципиальная возможность применения радиозащитных препаратов, полученных на основе продуктов микробного метаболизма В.ЫА^т и Е.соИ с природным биополимером (апизан), обеспечивающих 66,6% выживаемость животных в каждой из групп, при 100% гибели контроля облучения.
ET ЕР МНАРНЫЙ
Врач
Литература
1. Андрущенко, В.Н. Противолучевое действие веществ микробного происхождения / В.Н.Андрущенко,
A.А.Иванов, В.Н.Мальцев // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1996. - Т. 38, вып. 2 - С. 195-207.
2. Быкова, В.М. Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана / В.М.Быкова, С.В.Немцев. - М.: Наука, 2002. - С. 7.
3. Дуплищева, А.П. Влияние антигенов и продуктов их деградации на радиорезистентность облученных животных / А.П.Дуплищева, Н.Г.Синилова, К.К.Иванов // Радиобиология. - 1965. - Т. 5, вып. 5. - С. 243-252.
4. Зароза, В.Г. Эшерихиоз телят / В.Г.Зароза. - М.: Агропромиздат, 1991. - 239 с.
5. Иванов, А.А. Противолучевые эффекты иммуноглобулинов / А.А.Иванов, Н.Н.Клемпарская, Г.А.Шальнова.
- М.: Энергоатомиздат, 1990. - С. 176.
6. Коноплянников, А.Г. Радиобиология стволовых клеток / А.Г.Коноплянников. - М.: Энергоатомиздат, 1984.
- 120 с.
7. Клемпарская, Н.Н. Восстановление иммуногенеза у облученных животных /Н.Н.Клемпарская, Г.А.Шальнова // В кн.: Восстановительные процессы при радиационных поражениях. М., Атомиздат, 1964. - С. 89-95.
8. Мальцев, В.Н. Бактериотерапия острой лучевой болезни /В.Н.Мальцев, В.М.Коршунов, В.А.Стрельников и др. // Радиобиология. - 1978. - Т. 18, вып. 5. - С. 757-760.
9. Мальцев, В.Н. Влияние бактериальных препаратов на выживаемость облученных животных / В.Н.Мальцев, К.К.Гуценко, Н.В.Емченко // Радиац. биология. Радиоэкология. - 1994. - Т. 34, вып. 4-5. - С. 578-581.
10. Петров, Р.В. О токсикологическом действии бактериальных эндотоксинов на организм Р.В.Петров// Лабораторное дело. - 1987. - № 6. - С. 14-16.
11. Перт, С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С.Дж. Перт // М., Издательство Мир., 1978. - 331 с.
12. Скрябин, К.Г. Хитин и хитозан: получение, свойства, применение / Под ред. К.Г.Скрябина, Г.А.Вихоревой,
B.П.Варламова. - М.: Наука, 2002. - 368 с.
13. Ткаченко, Е.И. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики / Е.И.Ткаченко, Е.Б.Аванцева, Ю.П.Успенский [и др.] // Клиническое питание. - 2005. - № 1. - С. 14-20.
IMPROVEMENT OF PRODUCTION TECHNOLOGY FOR DRUG BASED ON B. BIFIDUM AND E. COLI IN COMBINATION WITH A BIOPOLYMER AND ASSESSMENT OF ITS EFFECTIVENESS ON FARM ANIMALS
Konyuhov G.V. - Doctor of Biological Sciences, professor; Nizamov R.N. - Doctor of Veterinary Sciences, professor; Gaynutdinov T.R. - Candidate of Biological Sciences;
IdrisovA.M. - Candidate of Veterinary Sciences; Shakurov M.M. - Candidate of Biological Sciences; Sharifullina D.T. - Candidate of Biological Sciences.
Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru.).
In previous research nine of the tested variants of compositions based on E. coli, B. bifidum, aluminium silicate hydrate, aluminium hydroxide and a natural biopolymer-chitosan from dead bees were studied. Of nine compositions the two prepared from: 1) a mixture of culture liquid and the bacterial mass of E. coli in combination with episan and 2) a mixture of culture fluid and Bakassi B. bifidum in combination with apezanon had a high radioprotective activity, providing 65-75% protection of lethally irradiated laboratory animals. These compositions had different radiation efficiency for therapeutic and prophylactic use. The aim of this study was to to improve the technology production for radioprotector drug based on E. coli and B. bifidum in combination with a biopolymer and to evaluate its effectiveness on farm animals. To obtain a composiion for radioprotector based on E. coli and B. bifidum, bacteria were grown on liquid nutrient media for 48 hours. Then the culture liquid with biomass were mixed in a ratio of 1:1 and the mixture was dried in a drying cabinet until constant weight. The powder mixture of microorganisms wass diluted in physiological solution with a concentration of 2x10 y/ml was added to apisan solution obtained using the improved technology in the ratio of 0.5 mass%. The drug named as RPKM (radioprotector composite microbial) was subjected to sterilization by irradiation with gamma rays at a dose of 2.0 kGy. After the drug toxicity and safety was determined its radioprotective activity was experimentally trialled on 9 Prekos sheep. The drug therapeutic activity was assessed by clinical and hematological parameters and survival rate of animals. The studies showed that the drug can be used for preventive purpose (single subcutaneous administration at a dose of 5 ml 24 hours before) and treatment purpose (24 hours after irradiation) and provides 66.6% survival rate in sheep from radiation death.
KEYWORDS: culture liquid, immunomodulatory, polysaccharides, biopolymers.
References
1. Andrushchenko, V.N. Protivoluchevoe dejstvie veshchestv mikrobnogo proiskhozhdeniya [Anti-irradiation effect of microbial substances] / V.N.Andrushchenko, A.A.Ivanov, V.N.Mal'cev // Radiacionnaya biologiya. Radioekologiya. -1996. - Vol. 38, Issue. 2 - P. 195-207.
2. Bykova, V.M. Syr'evye istochniki i sposoby polucheniya hitina i hitozana [Raw materials and methods to produce chitosan and chitin]/V.M.Bykova, S.V.Nemcev. - Moscow: Nauka, 2002. - P. 7.
3. Duplishcheva, A.P. Vliyanie antigenov i produktov ih degradacii na radiorezistentnost' obluchennyh zhivotnyh [The effect of antigens and products of their degradation on radioresistance on irradiated animals] / A.P.Duplishcheva, N.G.Sinilova, K.K.Ivanov // Radiobiologiya. - 1965. - Vol. 5, Issue 5. - P. 243-252.
4. Zaroza, V.G. Esherihioz telyat [Calves escherihiosis] / V.G.Zaroza. - Moscow: Agropromizdat, 1991. - 239 p.
5. Ivanov, A.A. Protivoluchevye effekty immunoglobulinov [Anti-radiation effects of immunoglobulins] / A.A.Ivanov, N.N.Klemparskaya, G.A.Shal'nova. - Moscow: Energoatomizdat, 1990. - P. 176.
6. Konoplyannikov, A.G. Radiobiologiya stvolovyh kletok [Radiobiology of stem cells] / A.G.Konoplyannikov. -Moscow: Energoatomizdat, 1984. - 120 p.
7. Klemparskaya, N.N. Vosstanovlenie immunogeneza u obluchennyh zhivotnyh [Recovery of immunogenesis in irradiated animals] / N.N.Klemparskaya, G.A.Shal'nova // In: Vosstanovitel'nye processy pri radiacionnyh porazheniyah. Moscow, Atomizdat, 1964, - P. 89-95.
8. Mal'cev, V.N. Bakterioterapiya ostroj luchevoj bolezni [Microbial therapy of acute irradiation diseases]/V.N.Mal'cev, V.M.Korshunov, V.A.Strel'nikov [et al.] // Radiobiologiya. - 1978. - Vol. 18, Issue 5. - P. 757-760.
9. Mal'cev, V.N. Vliyanie bakterial'nyh preparatov na vyzhivaemost' obluchennyh zhivotnyh [The effect of microbial drugs on survival rate in irradiated animals] / V.N.Mal'cev, K.K.Gucenko, N.V.Emchenko //Radiac. biologiya. Radioekologiya. - 1994. - Vol. 34, Issue. 4-5. - P. 578-581.
10. Petrov, R.V. O toksikologicheskom dejstvii bakterial'nyh endotoksinov na organizm [On toxic effect of microbial endotoxins on body] / R.V.Petrov // Laboratornoe delo. - 1987. - № 6. - P. 14-16.
11. Pert, S.J. Osnovy kul'tivirovaniya mikroorganizmov i kletok [Basics of microbial and cell cultivation] / S.J.Pert // Moscow, Izdatel'stvo Mir., 1978. - 331 p.
12. Skryabin, K.G. Hitin i hitozan: poluchenie, svojstva, primenenie [Chitine and chitosan: production, peculiarities, application] / edited by K.G.Skryabin, G.A.Vihoreva, V.P.Varlamov. - Moscow: Nauka, 2002. - 368 p.
13. Tkachenko, E.I. Eradikacionnaya terapiya, vklyuchayushchaya probiotiki [Eradication therapy including probiotics] / E.I.Tkachenko, E.B.Avanceva, Yu.P.Uspenskij [et al.] / /Klinicheskoe pitanie. - 2005. - № 1. - P. 14-20.
