CC BY
53УДК619:616.993.192-076: 636.21
усовершенствование копроскопичЕского метода диагностики криптоспоридиоза телят
Е.Г.Кириллов - аспирант; Д.Г.Латыпов - доктор ветеринарных наук, доцент.
ФГБОУ ВО«Казанская государственная академия ветеринарной медицины им.Н.Э.Баумана» г.Казань (420029, Казань, Сибирский тракт, 35, тел. +7(843) 273-96-17, e- mail: nis_kgavm@mail.ru).
Криптоспоридиоз - остро или подостро протекающее инвазионное заболевание телят, вызываемое простейшими из рода Cryptosporidium, характеризующиеся поражением желудочно-кишечного тракта и диареей. Данная инвазия имеет широкое распространение на территории всего мира, в том числе во всех зонах нашей страны, в хозяйствах с разной технологией производства, и наносит значительный ущерб животноводству. Целью наших исследований являлось, изыскание наиболее эффективного метода для диагностики криптоспоридиоза телят. Материалы и методы. В опыте использовали 50 телят в возрасте от 4 до 30 дней, с признаками диареи. Для консервации проб фекалий больных животных использовали 2,5% раствор бихромата калия. Результаты исследований показали, что при диагностике криптоспоридиоза телят метод нативного мазка обладал низкой эффективностью. Метод седиментации центрифугированием повышал диагностическую эффективность выявления ооцист криптоспоридий до 65%, а метод седиментации по Красильникову до 69%. Однако при окрашивании микропрепаратов они получались загрязнёнными остатками фекалий. Применение методов, основанных на эфирной седиментации, показывали более высокие результаты (более 76%). Кроме того, эфирный способ хорошо концентрировал ооцист. При проведении данного метода мазки получались чистыми, так как суспензирующее вещество отделяло ооцист от содержимого фекалий, а эфир поднимал детрит и жиросодержа-щие вещества. Заключение. Предложенный нами модифицированный способ дал возможность выявить более 96% инвазированныхживотных, что на 11% больше, чем принятый на практике формалино-эфирной метод. При проведении модифицированного метода окрашенные мазки получались чистыми, при визуальном осмотре не встречались деформированные ооцисты, обнаружимые при формалино-эфирном методе. Кроме того предложенный способ являлся менее токсичным, чем его аналог.
ключЕВыЕ СлоВА: диагностика, криптоспоридии, седиментация, телята.
Острые кишечные инфекции новорожденных телят остаются одной из наиболее актуальных проблем ветеринарии во всех регионах России [1]. Исследованиями последних лет доказана значительная роль патогенных культур криптоспоридий в развитии желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят [2].
Диагноз на криптоспоридиоз телят устанавливают на основании анализа эпизоотологических данных, клинической картины болезни и результатов патоло-гоанатомического вскрытия. Для постановки окончательного диагноза используются копроспопические методы исследования фекалий животных (флотации и седиментации), в сочетании с микробиологическими методами (окрашивание мазков). Вместе с тем, диагностика криптоспоридиоза считается сложной и трудной задачей, что связано с несовершенством методов концентрации ооцист, а также способов окрашивания мазков фекалий [3, 4].
Имеется много литературных данных по лабораторным методам диагностики криптоспоридий [5, 6, 7]. Вместе с тем, многие из них посвящены диагностике инвазии методом флотации ооцист криптоспоридий. Однако при использовании насыщенных растворов при флотации ооцисты криптоспоридий разрушаются [8].
В последние годы для диагностики криптоспориди-оза широко используется метод эфирного осаждения в различных вариантах. Принцип осаждения яиц простейших заключается в последовательной обработке проб суспензирующим веществом и эфиром. При этом суспензирующее вещество проникает в состав не переваренных частиц корма, выпадающих в большом количестве в осадок после центрифугирования. Последующее добавление эфира в состав этой смеси и перемешивание приводит к извлечению из содержимого раствора фекальных частиц. Удельный вес эфира меньше удельного веса воды, поэтому пробы фекалий, обработанные эфиром, всплывают, а ооцисты крипто-споридий оседают [9]. Вместе с тем, при данной методике все же осадок получается не очень непрозрачным, поэтому окрашенные мазки содержат некоторые примеси, которые экранируют часть поля зрения. Кроме того эфирный метод деформирует ооцист.
Исходя из вышеизложенного, усовершенствование копроскопической диагностики криптоспоридиоза телят остается актуальной проблемой.
материалы и методы. В опыте использовали 50 телят в возрасте от 4 до 30 дней, с признаками диареи. Для консервации проб фекалий больных животных использовали 2,5% раствор бихромата калия. Оценку эффективности методов диагностики устанавливали
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
по количеству мазков, в которых обнаруживали ооцист криптоспоридий, и по среднему количеству ооцист в одном поле зрения.
Для оценки диагностической эффективности нами были испытаны методы нативного мазка, седиментация с центрифугированием, седиментация с ПАВ по Красильникову в модификации Красновой, водно-эфирная, уксусно-эфирная, формалино-э-фирная методы седиментации, а также модифицированный нами способ седиментации (смесь молочной кислоты с эфиром).
При проведении модифицированного метода, фекалии телят в количестве одного грамма процеживали через марлевый фильтр в центрифужную пробирку и вливали воду, центрифугировали в течение 3-х минут при 1500 об/мин, затем надосадочный слой жидкости сливали. После к осадку добавляли 4% раствор молочной кислоты, перемешивали, вливали 2 мл этилового эфира, закрывали пробкой, встряхивали в течение 5-10 сек и центрифугировали в течение 2-х минут при 1500 об/мин. Затем коагулянт и надосадочный слой сливали, а осадок переносили на покровное стекло. Мазки высушивали на воздухе, фиксировали жидкостью Никифорова и окрашивали по Циль-Нильсену, рассматривали под иммерсионным увеличением микроскопа.
Результаты исследований. При изыскании усовершенствованного метода нами были изучены различные концентрации молочной кислоты (от 1 до 10% растворы).
Было установлено, что при использовании 1% раствора молочной кислоты осадок получался незначительным, а мазки чистыми. Однако ооцисты криптоспоридий окрашивались незначительно (рис.1).
Рис.1. Ооцисты криптоспоридий при применении седиментационного метода с 1% раствором молочной кислоты. Окрашивание по Циль-Нильсену (ув.х900).
При применении 10% раствора молочной кислоты ооцисты криптоспоридий ярко перекрашивались и приобретали темно-красный цвет (рис.2).
Рис. 2. Ооцисты криптоспоридий при применении седиментационного метода с 10% раствором молочной кислоты. Окрашивание по Циль-Нильсену (ув.х900).
Наиболее оптимальной концентрацией обладал 4% раствор молочной кислоты. Данная концентрация наиболее хорошо суспендировала фекалии и концентрировала ооцисты, усиливала проникающее свойство красителя в тело паразита (рис.4).
Поэтому в дальнейших своих исследованиях начали использовать 4% концентрацию раствора молочной кислоты в разработанной нами методике. В последующем модифицированный копроскопический седи-ментационный метод диагностики криптоспоридиоза телят сравнивали с существующими на практике другими методами.
Результаты изучения эффективности различных седиментационных копроскопических методов при диагностике криптоспоридиоза телят представлены в таблице.
Данные таблицы показывают, что диагностическая эффективность метода нативного мазка была низкая - всего 45% выявления. При этом ооцисты криптоспоридий обнаруживались только в некоторых полях зрения в количестве 1-2 ооцист. Кроме того, при этом методе мазки получались грязными, и в них трудно было идентифицировать ооцисты. Поэтому при низкой интенсивности выделения ооцист в фекалиях сложно получить достоверный результат.
Метод седиментации с центрифугированием повышал выявление ооцист криптоспоридий до 65%. При использовании данного метода в поле зрения микроскопа встречались в среднем до 7,4±0,46 ооцист. Однако осадок на дне пробирки был значительным, что затрудняло выделение ооцист и в конечном итоге влияло также на качество окрашивания мазков.
При использовании метода седиментации с центрифугированием с ПАВ, где для уменьшения поверхностного натяжения ооцист использовался стиральный порошок «Сарма» в виде 0,3% раствора, эффективность выявления ооцист криптоспоридий увеличива-
лась до 69%. Количество ооцист в одном поле зрения как и во втором методе диагностики, осадок получился достигала в среднем до 8,33±0,54 экз. Однако, так же, значительным, экранировал поле зрения.
Таблица
Эффективность различных седиментационных копроскопических методов при диагностике
криптоспоридиоза телят
Методы лабораторных исследований Количество исследованных мазков Среднее количество ооцист в одном поле зрения
всего число мазков с ооцистами %
Нативного мазка 50 23 45 1,67±046
Седиментации с центрифугированием 50 32 65 7,4±0,46
Седиментации с центрифугированием с ПАВ 50 35 69 8,33±0,54
Водно-эфирной седиментации 50 38 76 13,17±0,87
Уксусно-эфирной седиментации 50 41 81 19,50±0,84
Формалино-эфирной седиментации 50 43 85 24,5±1,41
Модифицированный метод 50 48 96 57,0±14,03
Диагностическая эффективность водно-эфирного метода седиментации возросла до 76%, выявление ооцист криптоспоридий в одном поле зрения увеличилось в среднем до 13,17±0,87. При этом осадок получился меньше, чем в предыдущих методах.
Использование уксусно-эфирного метода седиментации позволило выявить ооцист криптоспоридий в 81% случаях. При этом в одном поле зрения микроскопа обнаруживались в среднем 19,50±0,84 ооцист. Выпадение осадка было незначительное, а поле зрения относительно чистое.
зрения - 24,5±1,41 экз. Мазки были относительно чистыми, но при этом часто встречались деформированные ооцисты (рис.3).
Рис. 3. Ооцисты криптоспоридий при использовании формалино-эфирной седиментации.
Окрашивание по Циль-Нильсену (ув. х900).
Среди существующих на практике методов, наибольшей диагностической эффективностью обладала формалино-эфирная седиментация. При использовании данного метода количество выявленных образцов достигало до 85%, а количество ооцист в одном поле
Рис. 4. Ооцисты криптоспоридий при использовании модифицированного метода седиментации.
Окрашивание по Циль-Нильсену (ув.х900).
Наиболее высокой диагностической эффективностью обладал модифицированный нами метод с использованием молочной кислоты при седиментации ооцист. При использовании данного метода из 50 проб фекалий ооцисты криптоспоридий были обнаружены в 48 случаях (96%). При этом в одном поле зрения микроскопа в среднем наблюдали до 57,0±14,03 ооцист. Осадок был незначительным, окрашенный мазок чистым, без примесей. Кроме того, метод не деформировал ооцист, как при формалино-эфирном методе (рис.4).
ЕГЕПШАРНЫЙ
Врач
заключение. При диагностике криптоспоридиоза телят метод нативного мазка не концентрирует ооцист, а при использовании методов седиментации с центрифугированием и по Красильникову мазки получаются сильно загрязнёнными детритом, где трудно бывает идентифицировать ооцист. Применение методов, основанных на эфирной седиментации, позволяет концентрировать ооцист криптоспоридий, мазки получаются чистыми, так как вода, уксус и формалин суспендируют и отделяют ооцисты от содержимого фекалий, а эфир поднимает детрит и жиросодержащие вещества.
При проведении модифицированного нами копро-скопического метода, вместо раствора формалина
Литература
применяется 4% раствор молочной кислоты, как более эффективное средство при эмульгировании проб фекалий. При этом молочная кислота используется одновременно как средство, суспензирующие фекалии, и как вещество, усиливающее проникающее свойство красителя в тело паразита.
Применение модифицированного способа позволяет выявить более 10% инвазированных животных, чем принятый на практике формалино-эфирной метод. При этом мазки получаются чистыми, без примесей, ооцисты не деформируются, как при формалино-эфир-ном методе. Кроме того, предложенный нами способ является также менее токсичным, чем его аналог.
1. Метод лечения острых желудочно-кишечных болезней телят / С.Ш.Абдулмагомедов [и др.] // Ученые записки Казанской Государственной Академии Ветеринарной Медицины им.Н.Э.Баумана. - 2014. - Том 217. - С. 3-7.
2. Петрович, Е.В. Криптоспоридиоз телят и усовершенствование мер борьбы с ним в условиях Центральной Нечерноземной зоны: автореф. дис. ... канд. вет. наук: 03.02.11 / Е.В.Петрович. - М., 2013. - 19 с.
3. Диагностика криптоспоридиоза телят: методические рекомендации / М.Ш.Акбаев [и др.]. - М.: ФГОУВПО «МГАВМиБ им.К.И.Скрябина», 2004. - 14 с.
4. Васильева, В.А. Особенности распространения криптоспоридиоза у животных в условиях республики Мордовия / В.А.Васильева, П.А.Кулясов // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - № 2. - С. 155-156.
5. Касаткина, Н.М Анализ эффективности известных методов диагностики по критерию выявления кишечных паразитов / Н.М.Касаткина, Н.А.Ильина // Успехи современного естествознания. - 2007. - № 12. - С. 145-147.
6. Vohra, Р. A comprehensive review of diagnostic techniques for detection of Cryptosporidium parvum in stool samples / P.Vohra, M.Sharma, U.Chaudhary // lOSR Journal of Pharmacy. - 2012. - Vol. 2. - Р. 15-26.
7. Quantitative comparison of different purification and detection methods for Cryptosporidium parvum oocysts / S.Kara [et al.] // Veterinary Parasitology. - 2011. - Vol. 177. - P. 366-370.
8. Алиев, А.А. Криптоспоридиоз (диагностика, культивирование Cryptosporidium parvum в клетках тканей, экспресс-оценка препаратов): автореф. дис. ... канд. вет. наук: 03.00.19 / А.А.Алиев. - СПб., 1993. - 19 с.
9. Лабораторная диагностика гельминтозов и протозоозов: методические указания МУК 4.2.3145-13. - М.: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора, 2014. - 119 с.
improving the coprological method to detect calve
CRYPTOSPORIDIOSIS
Kirillov E.G. - postgraduate; Latipov D.G. - Doctor of Veterinary Medicine.
Bauman N.E.Kazan State Academy of Veterinary Medicine (tel.+7(843) 273-96-17), e-mail:nis_kgavm@mail.ru).
Cryptosporidiosis is an acute or sub acute parasitic disease caused by protozoa from Cryptosporidium genus and characterized by gastrointestinal lesions and diarrhea. This parasitic disease is spread worldwide including our country and cause economic damage to farming economy. The aim of our research was to find the most effective method to detect calve cryptosporidiosis. Methods and materials: in the experiment 50 calves at the age from 4 to 30 days with symptoms of diarrhea were used. Feces samples from infected animals were preserved in 2.5% solution of potassium dichromate. The investigation results: For calve cryptosporidiosis detection the method of native smear was found to have a lower efficiency. The method of sedimentation by centrifuging enhanced efficiency of detecting of cryptosporidia oocysts by 65%, and Krasilnikov's method of sedimentation - by 69% accordingly. However, the sample preparation staining resulted in contamination with feces residues. Using the methods based on ether -based sedimentation was effective in oocyst concentration. It resulted in pure smears as the suspension separated oocysts from fecal mass and ether raised organic debris and lipid-containing substances. Conclusion: The proposed modified method enabled detection of more than 96% of infected animals that is higher for 11% than
the conventional formalin-ether-based method. The modified method enables to produce pure smear at staining and whole oocyst unlike formalin-ether -based method resulting in destructed oocyst and contaminated smears. Moreover, the proposed method is less toxic then its counterpart.
KEYWORDS: diagnosis, cryptosporidiosis, sedimentation, calves.
References
1.Abdulmagomedov, S.Sh. Metod lecheniya ostryh zheludochno-kishechnyh bolezney telyat [Treatment of acute gastrointestinal diseases in calves] /S.SH.Abdulmagomedov, R.A.Nuratinov, R.M.Bakrieva, A.Yu.Aliev // Ucheniye zapiski Kazanskoy Gosudarstvennoy Akademii Veterinarnoy Mediciny im. N.E.Baumana. - 2014. - Vol. 217. - P. 3-7.
2. Petrovich, E.V. Kriptosporidioz telyat i sovershensvovanie mer borby s nim v usloviyah Tsentralnoy Nechernozemnoy zon [Calves cryptosporidiosis and improvement of control measures in Central non-Chernozemarea]: abstract from thesis for Candidate of Vet. Sci.: 03.02.11 / Petrova Elena Vyachechlavovna. - Moscow, 2013. - 19 p.
3. Akbaev, M. Sh. Diagnostika kriptosporidioza telyat: Metodicheskie rekomendasii [Detection of calves cryptosporidiosis: guidelines] / M.SH.Akbaev, N.V.Esaulova, S.A.Shemyakova, D.N.Shemyakov - Moscow: K.i. Skryabin MGAVMiB, 2004. - 14p.
4. Vasileva, V.A. Osobennosti rasprostaneniya kriptosporidioza u zhivotnyh v usloviyah respubliki Mordoviya [Features of spreading animal cryptosporidiosis in the Republic of Mordovia] / V.A.Vasileva, P.A.Kulyasov// Mezhdunarodniy zhurnal prikladnyh i fundamentalnyh issledovaniy - international journal of applied and fundamental researches - 2014. - vol.2
- P. 155-156.
5. Kasatkina, N.M. Analiz effektifnosti izvestnyh metodov diagnostiki po kriteriyu viyavlenia kishechnyh parazitov [Analysis of efficiency of the available detection methods according to the criterion to detect intestinal parasites] / N.M.Kasatkina, N.A. ilina// Uspehi sovremennogo yesyestvoznaniya. - 2007. - Vol. 12. - P. 145.
6. Vohra, P. A comprehensive review of diagnostic techniques for detection of cryptosporidium parvum in stool samples / P.Vohra, M.Sharma, U.Chaudhary iOSR Journal of Pharmacy. - 2012. - Vol. 2. - P. 15-26.
7. Kara, S., Quantitative comparison of different purification and detection methods for Cryptosporidium parvumoocysts / S.Kara, S.Gawlowskab, A.Daugschiesb, B.Bangourab // Veterinary Parasitology. - 2011. - Vol. 177.
- P.366 - 370.
8. Aliev, A.A. Kriptosporidioz (diagnostika, kultivirovaniye Cryptosporidium parvum v kletkahtkaney, ekspress-otsenka preparatov) [Cryptosporidiosis (Cryptosporidium parvumdetection, cultivation in tissue cells, rapid evaluation of drugs)]: abstract from thesis for Candidate of Vet. Sci: 03.00.19 / Aliev Ali Abakorovich. - Saint Petersburg, 1993. - 19 p.
9. Laboratornaya diagnostika gelmintozov i protozoozov: Metodicheskie rekomendatsii [Laboratory diagnosis of helminthosis and protozoan diseassis: methodology]. - Moscow: Federalny tsentr gigieny i epidemiologii Rospotrebnadzora. - 2014. - 43-53 p.
