CC BY
79
УДК 619:616.993
КРИПТОСПОРИДИОЗ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ (МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ)
О. С. МЕХОВ А
УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины», г. Витебск, Республика Беларусь, 210026
(Поступила в редакцию 12.03.2016)
Резюме. Криптосопридиоз - это протозооз, возбудителем которого является Cryptosporidium parvum, паразитирующий в кишечнике и распространяющийся с фекалиями больных животных. Нами проведено сравнение различных методов выделения криптоспоридий из фекалий. Были применены различные методы для обнаружения ооцист в фекалиях лабораторных мышей. Были использованы методы флотации, седиментации, метод окрашивания по Цилю-Нильсену и др. Также был использован модифицированный метод седиментации формалином и эфиром.
Ключевые слова: криптоспоридиоз, лабораторная мышь, ооцисты, диагностика, флотация, седиментация.
Summary. Cryptosporidiosis is a diarrheal disease caused by a microscopic parasite, Cryptosporidium parvum, that can live in the intestine of animals and is passed in the faeces of an infected animal. We compared different methods for the detection of Cryp-tosporidium in faeces. Various methods have been applied to detect oocysts in faeces of laboratory mice. Ziehl-Neelsen staining method, flotation method, sedimentation method for confirmation are described. A modification of the centrifugal sedimentation (formol/ether method) of concentration is also described.
Key words: cryptosporidiosis, laboratory mice, oocytes, diagnostics, flotation, sedimentation.
Введение. За последние два десятилетия у людей во многих странах мира существенно возрос интерес к содержанию мелких и экзотических животных, таких как морские свинки, крысы, хомяки, мыши, ежи, а также некоторые виды рептилий - змеи, крокодилы, ящерицы, черепахи и др. Существует множество коммерческих организаций, которые занимаются продажей и перепродажей этих животных. Кроме того, многие животные используются как объекты медико-биологических исследований. Необходимо помнить, что при разведении животных крупными колониями увеличивается возможность распространения заразных болезней среди этих животных, клинически скрытые спонтанные заболевания осложняют проведение научных экспериментов, грызуны могут быть источником инвазии для домашних животных, экспериментаторов и обслуживающего персонала [7].
Анализ источников. Кокцидии рода Cryptosporidium распространены во всем мире и к настоящему времени зарегистрированы более чем у 170 видов животных и птиц из 50 стран. Для видов данного рода характерна разная широта специфичности. Так, вид С. parvum инвазирует широкий круг млекопитающих, включая человека. Природным резервуаром и потенциальным источником возбудителя на фермах являются синантропные и дикие грызуны. У экспериментально зараженных мышей в процессе эндогенного развития криптоспоридии вызывают атрофию ворсинок эпителия тонких кишок, дистрофию бокаловидных клеток, гипертрофию крипт и инфильтрацию собственной пластинки слизистой оболочки и подслизистого слоя плазматическими клетками, полиморфноядерными лейкоцитами и лимфоцитами [3]. В популяции грызунов криптоспоридии обнаруживаются в течение всего года. Выделяемые ими ооцисты контаминируют окружающую среду [2].
Для выделения ооцист простейших из фекалий зараженных животных широко применяют копро-скопические методы [5, 9]. Методы специфической диагностики и изучения криптоспоридиоза, по целевой установке, экономичности и сложности исполнения подразделяются на две группы: 1) методы, направленные на изучение самого паразита - его морфологии и структуры на разных стадиях развития (методы Циля-Нильсена, Романовского-Гимза); 2) диагностические, направленные на обнаружение в организме и в испражнениях животного возбудителя - ооцист и размножающегося паразита на разных эндогенных стадиях (методы флотации, седиментации) [5].
На основе анализа эффективности насыщенных растворов поваренной соли, аммиачной селитры, сахарозы, сульфата цинка, раствора Бреза, раствора Павласека ряд ученых пришли к выводу, что наиболее экономичным, доступным и результативным является насыщенный раствор натрия хлорида. Эффективность методов диагностики зависит от выбора насыщенных растворов для флотации и составляет: для натрия хлорида - 68 %, для аммиачной селитры - 77,1 %, для раствора Бреза -82,8-100 %, для раствора натрия нитрата - 82,8 % [5]. По данным А. А. Алиева, применение насыщенного раствора хлорида натрия (плотность 1,18-1,25 г/мл) приводило к разрушению ооцист в течение
30-60 минут. Еще более быстрое разрушение ооцист происходило при применении насыщенного раствора аммиачной селитры. Применение насыщенных растворов сахарозы (плотность 1,25 мг/см3) имеет преимущество перед другими флотационными растворами, т. к. является наиболее щадящим по отношению к ооцистам. Это является важным при исследовании большого количества проб и накоплении биомассы возбудителя [1].
Цель работы - определить наиболее эффективный копроскопический метод выделения ооцист криптоспоридий у лабораторных мышей и усовершенствовать формалин-эфирный метод седиментации ооцист простейших.
Материал и методика исследований. Целью наших исследований явилось определение наиболее эффективного метода выделения ооцист криптоспоридий из фекалий лабораторных грызунов. В опыте использовали 7 лабораторных белых мышей. Животные содержались в индивидуальных клетках. Ежедневно проводился отбор проб фекалий, которые помещались в емкости с соответствующими номерами (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7). Затем каждую из 7-ми проб исследовали следующими методами: окраска мазков-отпечатков по Циль-Нильсену, окраска мазков по методу Романовского-Гимза, флотация оо-цист насыщенными растворами натрия хлорида, сахарозы, седиментация ооцист формалином и эфиром, с последующей флотацией насыщенным раствором сахарозы. Навеска материала для флотационных методик составляла 0,1 г. После проводили микроскопию препаратов при увеличении ><1000 и подсчитывали среднее количество ооцист в 10-ти полях зрения микроскопа. Обработка и анализ полученных результатов проводились общепринятыми методами вариационной статистики на ПК. По результатам исследования оценивались эффективность применения методов в диагностике и удобство использования.
Результаты исследований и их обсуждение. Выбор той или иной методики зависит от поставленных целей исследования и возможности ее исполнения. Метод окраски мазков по Циль-Нильсену является наиболее демонстративным [8]. В результате окрашивания зафиксированных мазков карбол-фуксином из содержимого кишечника мышей ооцисты криптоспоридий окрасились в пурпурный цвет с разными оттенками: от ярко-красного цвета до бледно-розового. Сопутствующая микрофлора окрасилась в синие тона. Было выявлено 0-2 ооцисты в п. з. м. лишь в пробе от животного № 5. К окраске карболовым фуксином восприимчивы не только простейшие С. рагупт, но и другие биологические объекты (в частности, цисты простейших других родов, споры грибов), это затрудняет дифференциацию цист простейших и спор грибов, а также их видовую дифференциацию, т.к. форма, размер и тинкториальные свойства окрашенных объектов практически неразличимы [4]. Также не все ооцисты окрашиваются и часто в мазках наблюдались бледно-розовые или совершенно неокрашенные клетки возбудителя [9]. Таким образом, цветовой и морфометрический критерии идентификации объектов при использовании метода Циль-Нильсена не являются специфичными, так как при данном методе доступны преимущественно параметры длины, ширины объекта, а также его тинкториальные свойства, которых недостаточно для объективной оценки (рис. 1).
О
и
Р и с. 1. Ооцисты криптоспоридий. Окраска мазка фекалий по методу Циля-Нильсена (*1000)
Р и с. 2. Ооцисты криптоспоридий. Метод формалин-эфирной седиментации и флотации сахарозой (*1000)
В ходе научных исследований также осуществлялось окрашивание мазков фекалий азур-эозином по Романовскому-Гимза. В ряде случаев он весьма информативен, поскольку при адекватной предварительной подготовке мазка краситель проникает внутрь ооцисты и окрашивает спорозоиты [5, 8]. Но в нашем случае идентифицировать ооцисты криптоспоридий не удалось ни в одном из мазков.
По данным В. Ф. Никитина, оптимальными для диагностики криптоспоридиоза являются копроско-пические методики. При этом наиболее эффективен поиск ооцист во влажном нативном препарате. Затруднение вызывают лишь малый размер ооцист (в основном от 3 до 7 мкм) и полупрозрачный цвет, сливающийся в некоторой степени с цветом жидкой части препарата [5].
При низкой интенсивности инвазии целесообразно использовать методы обогащения (флотацию и седиментацию), так как количество ооцист в фекалиях грызунов может быть настолько незначительным, что их выявление с помощью микроскопии окрашенных мазков представляет трудную задачу. При диагностике кокцидиозов с использованием флотационных растворов важно учитывать возможные морфологические и структурные изменения ооцист, т. к. под влиянием флотационного раствора ооцисты могут приобретать форму полушара и даже контура полукруга [5].
Нами осуществлялись исследования методом флотации с применением насыщенных растворов натрия хлорида (плотностью 1,2 мг/см3), сахарозы (плотность 1,25 мг/см3). Для отмывании фекалий мы использовали 10 % формальдегид. Полученную суспензию процеживали через двойной слой марли в центрифужную пробирку объемом 15 мл.
Исследуемый материал (масса навески 0,1 г) от каждой из 7 исследуемых проб после смешивания с формальдегидом центрифугировали в течение 1-2 мин. при 2-3 тыс. об/мин., или 3-4 мин. при 1500 об/мин. Затем центрифугировали повторно с соответствующими флотационными растворами при том же режиме. Материал собирали металлической петлей, наносили на предметные стекла и микроско-пировали при увеличении х400, х600 и х1000.
При использовании раствора натрия хлорида (1,2 мг/см3), ооцисты были выявлены в пробах под номерами 3, 5, 6. Ооцисты были трудноразличимы по морфологическим признакам. Оболочка оо-цист, флотированных раствором сахарозы, имела вид четкого контура, окаймляющего морфологические структуры. Ооцисты имели вид розовых округлых образований.
Так же мы проводили выделение ооцист формалин-эфирным методом. Преимущество данного метода заключается в том, что под действием 10 % формальдегида в смеси с эфиром непереваренные грубые частицы корма эмульгировали, а жироподобные вещества растворялись. Образовавшаяся эмульсия обладала меньшим удельным весом, чем вода, поэтому фекалии вместе с непереваренными грубыми частицами корма поднимались в виде пробки вверх, а ооцисты осаждались на дно пробирок. В данном случае биомасса возбудителя содержала гораздо меньше примесей, которые могли бы затруднить микроскопию. Однако вместе с ооцистами осадок содержал большое количество микроорганизмов, спор, простейших, населяющих желудочно-кишечный тракт, которые затрудняли диагностику. Морфологически ооцисты были слабодифференцированы.
Нами был предложен комплексный метод формалин-эфирной седиментации и флотации насыщенным раствором сахарозы. Седиментированный осадок, оставшийся на дне пробирок, смешивали с 4 мл насыщенного раствора сахарозы (1,25 мг/см3). После тщательного размешивания стеклянной палочкой содержимое центрифугировали в течение 5 минут при 1,5 тыс. об/мин. Поверхностную пленку снимали металлической петлей, наносили на предметные стекла и микроскопировали при увеличении х400, х600 и х1000. При данном методе степень очистки препарата была значительно выше. В результате ооцисты криптоспоридий были очищены от непереваренных частиц корма, от микроорганизмов и простейших, населяющих кишечник (рис. 2). Морфологически ооцисты были легко диагностируемы. Ооцисты были выявлены в пробах №2, 3, 5, 6, 7.
Данные по эффективности выделения ооцист из одинаковой навески фекалий приведены в табл. 1.
Анализируя данные таблицы, можно утверждать, что точность определения экстенсивности инвазии зависела от примененного метода диагностики. Наиболее оптимальным оказался предложенный нами комплексный метод формалин-эфирной седиментации и флотации сахарозой, потому что он позволил выявить ооцисты у 5-ти животных (ЭИ - 71,4 %). В то время как окраска мазков по методу Романовского-Гимза не позволила выявить ооцисты криптоспоридий ни в одном из препаратов. Так-
же низкоэффективным оказался наиболее распространенный в подразделениях Госветслужбы метод диагностики криптоспоридиоза путем окрашивания мазков-отпечатков по Цилю-Нильсену. Это не имеет принципиального значения, потому что при массовых диагностических исследованиях важно выявлять животных с высокой интенсивностью инвазии (например, больные телята с 1 г фекалий выделяют во внешнюю среду до 74 млн. ооцист, сохраняющих свою инвазионность до года и более) [8].
Т а б л и ц а 1. Сравнительная эффективность методов диагностики криптоспоридиоза мышей, M±m (n=7)
Методы диагностики Среднее количество ооцист Сryptosporidium sp. в 10 п. з. м. (*900) ЭИ, %
Проба №1 Проба №2 Проба №3 Проба №4 Проба №5 Проба №6 Проба №7
Окраска по методу Циль-Нильсена 0 0 0 0 1,4±0,47 0 0 14,2
Флотация растворами: хлорида натрия 0 0 1,5±0,43 0 2,5±0,5 1,0±0,33 0 42,9
сахарозы 0 0 1,7±0,43 0 3,2±0,49 2,7±0,59 0 42,9
Формалин-эфирный метод + флотация сахарозой 0 2,5±0,52 1,7±0,42 0 6,0±0,57 4,4±0,52 3,2±0,48 71,4
При проведении исследований важно учесть, что использование зараженных, в частности, крипто-споридиями животных, приводит к искажению результатов опытов, а однотипные исследования, выполненные разными методиками, дают различные результаты.
Заключение. Проведенные исследования дают основание утверждать, что комплексное использование методов формалин-эфирной седиментации и флотации насыщенным раствором сахарозы позволяют значительно увеличить выделение ооцист возбудителя криптоспоридиоза из минимального количества пробы фекалий. При выборе способа диагностики криптоспоридиоза следует руководствоваться поставленной целью (изучение морфологии, накопление биомассы ооцист возбудителя, определение интенсивности инвазии). Так, для изучения морфологии ооцист и интенсивности инвазии более приемлемыми являются метод окрашивания мазков по Цилю-Нильсену, а для выделения максимального количества ооцист из навески пробы - комплексный метод формалин-эфирной седиментации и флотации насыщенным раствором сахарозы.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Алиев, А. А. Криптоспоридиоз (диагностика, культивирование Cryptosporidium parvum в клетках культуры тканей, экспресс оценка препаратов): автореф. дис. ... канд. вет. наук: 03. 08. 19. / А. А. Алиев. - СПб., 1993. - 20 с.
2. Васильева, В. А. Зараженность криптоспоридиями свиней и окружающей среды / В. А. Васильева, Н. С. Малахов, Т. Б. Мусаткина // Российский паразитологический журнал. - 2009. - № 3. - С. 61-63.
3. Мехова, О. С. Патоморфологические изменения в органах мышей при экспериментальном криптоспоридиозе // О. С. Мехова, В. С. Прудников // Ученые записки учреждения образования «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины». - Витебск, 2009. - Т. 45, вып. 2, ч. 1. - С. 163-165.
4. Мироненко, В. М. Окрашиваемость цист простейших и спор грибов по методу Циль-Нильсена / В. М. Мироненко, И. В. Воробьева, О. С. Мехова, В.М. Мироненко // Биоэкология и ресурсосбережение: материалы VIII Международной научно-практической конференции; г. Витебск, 22-23 мая 2009 г. - Витебск, 2010. - С. 110-111.
5. Никитин, Н. Ф. Копроскопическая диагностика криптоспоридиоза и эймериоза телят / Н. Ф. Никитин // Ветеринария. -2002. - №9 - C. 27-31.
6. Протисты: Руководство по зоологии / Российская академия наук; ред. А. Ф. Алимов. - СПб.: Наука, 2007. - Ч. 2. -1142 с.
7. Шемякова, С. А. Паразитарные болезни лабораторных грызунов / С. А. Шемякова, Д. Н. Шемяков; Московский ветеринарный вебцентр [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://webmvc.com/show/show.php?art=29&sec=10. - Дата доступа: 16.01.2016.
8. Ятусевич, А. И. Методические рекомендации по диагностике и профилактике криптоспоридиоза свиней / А. И. Ятусе-вич, В. С. Прудников, О. С. Мехова. - Витебск: ВГАВМ, 2011. - 12 с.
9. Pavlasek, I. Nalezy kryptosporidii ve zlaznatem zaludku u slepic a u volne zijicich a exotickych ptaku odchycenych z volne prirody (Findings of Cryptosporidia in the proventriculum of hens and in wild and exotic birds) / I. Pavlasek // Veterinarstvi, 2001. -№ 3. - P. 103-108.
