CC BY
40
УДК 579.873.13, 579.872.1
Денисова И.А., Андрющенко С.В.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург E-mail: rattus000@gmail.com
УСКОРЕННЫЙ АЛГОРИТМ АМПЛИФИКАЦИИИ ДЛЯ НАЧАЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ РОДОВ ОБЛИГАТНО-АНАЭРОБНЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ МНОЖЕСТВЕННОЙ ПЦР
Оптимизация алгоритма амплификации для тест-систем ПЦР-идентификации двух родов актинобактерий с использованием праймеров с высокой температурой отжига путем объединения и сокращения фаз отжига и синтеза позволила сократить время протекания полимеразной цепной реакции от 1 часа 10 минут до 32 минут.
Ключевые слова: множественная ПЦР, актинобактерии, бифидобактерии, пропионибактерии.
Введение
ПЦР как наиболее простой и доступный метод молекулярно-генетического определения принадлежности выделяемых микроорганизмов к тому или оному таксону приобретает особое значение, особенно вследствие трудоемкости, а иногда невозможности культивации большинства представителей кишечных микробиоценозов человека [1], среди которых более 3/4 составляют облигатно-анаэробные бактерии [2]. В то же время, такой анализ более детально может быть проведен с использованием стандартных методов ге-нотипирования по уровню изменчивости в последовательности гена малой рибосомальной РНК [3, 4], что значительно более затратно по трудовым и материальным ресурсам, так и путём поиска уникальных родоспецифичных последовательностей или целых генов, что имеет гораздо более узкий спектр применения и требует индивидуального подхода к разработке тест-систем для каждой таксономической группы [5].
С другой стороны, необходимость идентификации бактерий до уровня вида в условиях, когда известно, что горизонтальный перенос генов у прокариот является своре правилом, чем исключением, представляется неочевидной [6]. Первичная идентификация облигатных анаэробов вполне может быть осуществлена классическим методом полимеразной цепной реакции до уровня рода с модификациями в виде двухфазной и множественной полимеразной цепной реакции (мультиплекс-ПЦР). Такой подход позволяет многократно ускорить и оптимизировать рутинные исследования.
Таким образом, целью нашей работы стала дальнейшая оптимизация системы опреде-
ления бактерий до уровня рода Bifidobacterium или Pronionibacterium c помощью ранее разработанной системы множественной ПЦР в двухфазном режиме.
Материалы и методы
Нами в работе использовано 2 штамма бактерий Bifidobacterium spp. и 2 штамма Propionibacterium spp. коллекции лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ИКВС УрО РАН.
Проводилась дальнейшая оптимизация разработанной ранее тест-системы на базе праймерных пар для определения облигатно-анаэробных актинобактерий до уровня рода (табл. 1).
Матричная ДНК выделялась из каждого исследованного штамма для ПЦР в реагенте «ДНК-Экспресс» («Литех», Россия) объемом 0,1 мл, применяя в качестве твердотельного термоТаблица 1. Перечень праймеров, использованных в работе
Наименование праймера Нуклеотидная последовательность Длина, количество нуклеотидов
Bif F ATGGGGTCGCGT CCTATCAGG 21
Bif R GGGCCCCACATC CAGCTTCGAG 26
Prb F CGAGTGGCGAAC GGGTGAGTAAGA 24
Prb R GTAGCATGCGTG AAGCCCTGGAGA 24
Примечание: Bif - праймеры, родоспецифичные для Bifidobacterium spp.; Prp - праймеры, родоспецифичные для Propionibacterium spp.
Денисова И.А., Андрющенко С.В._
стата амплификатор «Терцик МС-2+» («ДНК-технология», Россия) при температуре 98°С в течение 15 мин с последующим центрифугированием в микроцентрифуге «СМ-50» («Elmi», Латвия) при 15300 g в течение одной минуты. Супернатант, содержащий выделенную ДНК вносился в объеме 2,5 мкл. в подготавливаемую реакционную смесь для ПЦР.
Реакционная смесь для ПЦР конечным объемом 10 мкл готовилась из набора следующих праймеров и реагентов: 1 мкл 25 ммоль/л раствора магния сульфата, , 0,2 мкл 10 ммоль/л раствора дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, 0,3 мкл 10 мкмоль/л смеси каждой из пар праймеров, 0,1 мкл раствора Taq-полимеразы (5 ед/ мкл) и 6 мкл буфера «ДНК-экспресс». Реакция проводилась в том же ДНК-амплификаторе «Терцик МС-2+». Алгоритм амплификации: температура фазы денатурации - 93,6°C с длительностью 3 с; температура сдвоенной фазы отжига и элонгации поэтапно увеличивались в диапазоне от 70 до 73°C, длительность элонгации - уменьшалась от 30 до 2 с [7]. Количество циклов реакции всегда составляло 30 [8].
Ампликоны, получаемые в результате реакции, были подвергнуты агарозному гель-электрофорезу [9]: весь объем (10 мкл) реакционной смеси дополняли 2 мкл буфера для внесения 10-кратной концентрации с красителем бромфеноловым синим, после чего вносили в лунки агарозного геля. Концентрация агарозы составляла 2%. Условия проведения электрофореза: форезная камера заполнялась 1x TAE-бу-фером, содержащем 40 мкг/мл бомида этидия при напряженности поля до 14,8 в/см в течение 15 минут. Визуализация результатов разделения ампликонов проводилась в проходящем УФ-свете при длине волны 312 нм.
Результаты и обсуждение
Алгоритм ПЦР с температурой отжига 73°C и при количестве 30 циклов показал положительный результат, а также отсутствие неспецифических ампликонов с одной парой прай-меров при использовании как ДНК-матриц, полученных из бифидобактерий, так и в случае ДНК пропионибактерий.
При смешивании в одной пробе разных пар праймеров при вышеуказанной температуре также было показано отсутствие неспецифических результатов реакции в пробах с ДНК-мат-
Ускоренный алгоритм амплификациии...
рицей каждого из исследуемых штаммов. Дальнейшее повышение температуры отжига приводило к резкому снижению эффективности ПЦР.
Так как температура отжига, которую мы использовали, соответствовала диапазону значений, составляющих оптимум работы Taq-по-лимеразы, стала возможной реализация алгоритма двухфазной ПЦР, и продолжение дальнейшего сокращения фазы отжига-синтеза. Устойчивое образование ампликонов от праймеров для пропионибактерий в реакционной смеси используемого объема сохранялось вплоть до 15 секунд, отводимых на вторую фазу. В итоге нам удалось достичь еще большего снижения общего времени реакции: от 1 часа 10 минут в случае стандартной трехфазной ПЦР и 45 минут - ранее разработанной неускоренной двухфазной до 32 минут. В то же время амплификация с прайме-рами для рода Bifidobacterium происходило без видимого снижения эффектичвности вплоть до 6 секунд, отводимых на фазу отжига-синтеза.
Дальнейшее сокращение времени, отводимого на синтез ампликонов, показало постепенное снижение эффективности амплификации до полной невизуализируемости в диапазоне 3 секунд как для пропионибактерий (от 15 до 12 секунд), так и в случае бифидобактерий (от 6 до 3 секунд).
Заключение
Предложенный способ оптимизации разработанного ранее алгоритма двухфазной
Bif Prp Bif ЩЁ
Рисунок 1. Электрофореграмма результата 29 циклов множественной двухфазной ПЦР с двумя парами праймеров с пробами матричной ДНК бифидобактерий (В1£) и пропионибактерий (Ргр) при температуре отжига 70°С (первая и вторая дорожки) и 72°С (третья и четвертая дорожки)
Естественные науки
мультиплекс-ПЦР позволяет еще более сократить время идентификации двух основных родов культивируемых облигатно-анаэробных актинобактерий, которые обычно выделяются из кишечника большинства всеядных млекопитающих, включая человека: применяя одну реакционную смесь на каждую анализируемую пробу.
Проведенная оптимизация системы скри-нингового определения облигатно-анаэробных бактерий существенно сокращает время, требующееся для проведения анализа. Сокращение объема реакционной смеси позволило ещё более сократить время, отводимое на синтез амплико-нов до 15 секунд, даже с учетом большой длины получаемых цепей на матрице ДНК пропиони-
бактерий, который превышает 1,1 тысячу оснований. Этот факт позволяет использовать предложенное усовершенствование и для большинства других стандартных тест-систем ПЦР-ана-лиза, содержащих праймеры с соответствующими значениями температуры отжига.
Таким образом, разработанный алгоритм двухфазной ПЦР с высокой температурой отжига, малым объемом реакционной смеси и предельно короткой длительностью фаз позволяет значительно ускорять ранее разработанную систему ПЦР-идентификации до уровня рода облигатно-анаэробных актинобактерий, которые обычно выделяются из кишечника человека: более чем в два раза по сравнению со стандартной процедурой.
30.09.2014
Работа выполнена по проектам фундаментальных исследований программ Президиума РАН № 12-П-4-1015 «Инфектологические механизмы ассоциативного симбиоза человека» и № 12-П-4-1045 «Изучение интеграционных механизмов межмикробных взаимодействий микросимбионтов кишечной микробиоты в паре «доминант-ассоциант»
Список литературы:
1. Sun Zh., Baur A., Zhurina D. Accessing the Inaccessible: Molecular Tools for Bifidobacteria // Applied and Environmental Microbiology.- 2012.- V.78.- N.15.- P.5035-5042.
2. Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Валышев А.В., Бухарин О.В. Видовая характеристика и факторы персистенции бифидофло-ры кишечника в норме и при дисбиозах // Журн. микробиол., эпидемиол. иммунобиол.- 2009.- №2.- С.89-93.
3. Krizova J, Shpanova A., RittichB. Evaluation of amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and species-specific PCR for identification of Bifidobacterium species // Systematic and Applied Microbiology.- 2006.- N.29.- P.36-44.
4. Collado M.C., Hernandez M. Identification and differentiation of Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium species in fermented milk products with bifidobacteria // Microbiological Research. - 2007. - V.162. - P.86-92.
5. Martin R., Jimenez E., Heilig H. Isolation of Bifidobacteria from Breast Milk and Assessment of the Bifidobacterial Population by PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Quantitative Real-Time PCR. // Appl. Environ. Microbiol.- 2009. - V.75. -N.4. - P.965-969.
6. Georgiades K., RaoultD. Defining Pathogenic Bacterial Species in the Genomic Era // Front. Microbiol. - 2010. - N.1.- P. 151.
7. Carman W.F., Kidd A.H. An assessment of optimal conditions for amplification of HIV cDNA using Thermus aquaticus polymerase // J. Virol. Methods.- 1989. - V.23.- N.3.- P.277-289.
8. Ребриков Д.В., Саматов ГА., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР "в реальном времени" // М.: БИНОМ.- 2009.- 223с.
9. Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. // М.: Мир.- 1984. -480с.
Сведения об авторах:
Денисова Ирина Александровна, студент физического факультета Оренбургского государственного университета
Андрющенко Сергей Валерьевич, старший научный сотрудник Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат медицинских наук
460000, ул. Пионерская, 11, е-mail: rattus000@gmail.com
